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徐瑞荣主任医师 山东中医药大学附属医院 血液病科 尿检是临床上一种常用的检验项目，通过尿检可以达到健康体检及疾病筛查和诊断的目的。例如当我们发现尿中含有游离血红蛋白而无红细胞、或仅有少许红细胞而含有大量游离血红蛋白，即发现血红蛋白尿时，我们不得不怀疑一些溶血疾病，其中一种血红蛋白尿容易清晨第一次尿出现，该原发疾病即阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）。 PNH是一种获得性造血干细胞(HSC)磷脂酰肌醇聚糖-A类(PIG-A)基因突变所致的难治性溶血性疾病。PIG-A基因突变引起糖基化磷脂酰肌醇锚合障碍，导致GPI 锚链蛋白(GPI-AP)表达减少或者缺失，使得血细胞(红细胞、粒细胞及血小板)膜对补体异常敏感而被破坏，出现持续性血管内溶血，临床主要表现如病名所示，为与睡眠有关的、间歇发作的血红蛋白尿，可伴有溶血性贫血、血栓形成和造血功能障碍等症状。溶血主要与衰变加速因子(DAF，CD55)、膜攻击复合物抑制因子(MIRL，CD59)的缺失有关，CD55 和 CD59 这 2 种锚链蛋白表达显著减少或者缺失使 PNH 克隆更容易被激活的补体系统攻击，而 PNH 红细胞对补体的溶血作用又比血小板和白细胞更敏感，促使血红蛋白尿成为PNH 患者临床主要特征之一。静脉血栓是 PNH 患者死亡的主要原因之一，可能出现在静脉的任何部位，主要发生在脑静脉、肝静脉、门静脉、肠系膜静脉和肾静脉。大多是在发生急性溶血之后，这提示补体抑制和溶血是血栓发生的重要原因，但是到目前为止，血栓发生的病理机制尚不清楚，还处于假说阶段，可能与凝血酶原复合物的形成能力提高或纤溶作用的减少有关。PNH的诊断方法明确，包括两大方面，一则需要符合临床表现，二则依赖实验室检查，包括酸化血清溶血试验(Ham试验）、糖水试验、蛇毒因子溶血试验、尿潜血(或尿含铁血黄素)。此外PNH还经常可与再生障碍性贫血（AA）相互转化或兼具，称为再障-PNH综合征。为表明两病发生先后，或同时兼有两病特征而以某病为主，可分为四种情况：再障→PNH、PNH→再障、PNH伴有再障特征和再障伴有PNH征。作为良性肿瘤，PNH部分患者有自愈的可能，除此骨髓移植(BMT)是目前唯一能够达到治愈目标的手段，但需较高的条件且风险大，一般不采用。西医治疗方案包括传统方案和靶向治疗两种，传统治疗主要是控制临床症状，预防血栓的发生，采用环孢素 A，糖皮质激素，雄激素，抗胸腺免疫球蛋白(ATG)，肝素抗凝，化疗等药物或方法。但是传统治疗方案局限性和副作用都较大，优于此方案的靶向治疗正兴起，该方案通过外源性活性物质阻断补体的激活放大和 膜攻击复合物 （MAC ）的形成达到治疗的目的，但是这种治疗刚起步，药物、理论等还需进一步完善。目前，无论是传统还是靶向治疗都无法根治PNH，只能对症治疗，患者可配合中医治疗来稳定或缓解病情。中医认为，PNH溶血发作期属黄疸范畴，为湿热内蕴所致，治当以清热利湿为主，使用茵陈蒿汤或茵陈五苓散等加减，如伴有瘀血加入桃红四物汤等以活血化瘀，佐以补虚。未发作期属虚劳范畴，当以调补五脏为主，补气养血，阴阳双补，尤其注重补益脾肾，可使用当归补血汤、归脾汤类。肾阴虚象明显使用六味地黄丸、左归饮等方或墨旱莲、女贞子等药，肾阳火衰者使用如金匮肾气丸、右归饮或补骨脂、骨碎补、巴戟天、淫羊藿类。2018年04月10日
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何广胜主任医师 江苏省人民医院 血液内科 阵发性睡眠性血红蛋白尿症(paroxysmalnocturnalhemoglobinuria，PNH)是由于体细胞的磷脂酰肌醇聚糖互补组A（phosphotidylinositolglycancomplementationgroupA,PIG-A）基因突变造成的后天获得性造血干细胞克隆性疾病。患者的血管内溶血发生与睡眠呈现一定的时间相关性，因此得名。一、病因及发病机制PNH是一种由于一种或几种造血干细胞X染色体上PIG-A基因突变使糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）I的合成受阻。导致由GPI锚链在细胞膜上的一组膜蛋白丢失，GPI锚链接蛋白包括：①补体调节蛋白，如衰变加速因子（CD55）、膜攻击复合物抑制因子（CD59）、补体C8结合蛋白及膜辅助蛋白（MCP）；②粘附分子，如CD58、CD48、CD67、CD67；③酶类，如CD73；④受体类，如CD16、CD14；⑤血型抗原。GPI接连的抗原多种，也造成对PNH细胞生物学行为解释的复杂性，但两个GPI锚蛋白——CD55、CD59，由于其对补体调节中的重要作用，始终在PNH发病机制、临床表现、诊断和治疗中被紧密关注。CD55、CD59在造血细胞膜表面普遍表达。CD55是细胞膜上的C3转化酶衰变加速因子，通过调节C3和C5补体蛋白转化酶调控早期补体级联反应。CD59又被称为反应性膜攻击复合物抑制剂，可以阻止补体C9掺入C5b-8复合物中，而阻止膜攻击单位形成，达到抑制补体终末攻击反应的作用。CD55和CD59在细胞膜上完全或者部分缺失，使得补体系统活化后不能有效被抑制，引发红细胞被补体损伤，血管内溶血，释放游离血红蛋白，血栓形成和脏器功能损伤。PIG-A基因突变发生在造血干细胞水平，故PNH克隆累及各系血细胞，包括淋巴细胞。PNH克隆扩张多与免疫异常、造血功能衰竭有关。Dacie提出的所谓PNH发病的双重发病学说（dualpathogenesistheory，DPT）是被普遍认可和接受的假说：首先，造血干细胞在一定条件下发生突变，产生GPI缺陷的PNH克隆；其次，由于某种因素（现多认为是免疫因素），发生造血功能损伤或造血功能衰竭，PNH克隆获得增殖优势。多数PNH合并造血功能受损，也可以由再生障碍性贫血先起病，逐渐显现出PNH克隆。在较低危的骨髓增生异常综合征中也能见到小规模PNH克隆。PNH造成的器官损害和临床症状与血管内溶血、游离血红蛋白增高、补体系统持续活化，一氧化氮消耗、出凝血系统功能障碍等等有关，导致的乏力、气促、腹痛、血红蛋白尿等症状，高风险并发血栓、肾功能衰竭和肺动脉高压。PNH患者血栓形成是多因素共同作用的结果，PNH患者补体活化及溶血过程中释放一些物质，如补体C5a，可使机体处于一种潜在的炎症状态下，炎症可使单核细胞、血管内皮细胞过度表达及释放组织因子，而启动凝血过程。炎症介质可破坏内皮细胞，内皮细胞活化增加，大量组织因子释放入血启动外源性凝血途径。炎症因子加重凝血异常，凝血异常又可加剧炎症反应，形成恶性循环。CD59缺乏的血小板更易被活化或NO消耗促使血小板活化增加、聚集粘附形成血栓。血管内溶血使游离血红蛋白累积，血液黏滞度增加，也可能由于血红蛋白沉积在血小板上影响血小板的功能，使血液始终处于一种高凝或血栓前状态。血管内溶血释放游离血红蛋白入血，游离的血红蛋白与NO的结合能力要比氧气高百倍，使得血液中NO的含量下降；或者是溶血使得血管内皮功能紊乱，内皮合成的一类重要的舒血管物质就是NO,内皮功能紊乱使NO的化学合成减少。这导致PNH发生小血管平滑肌的痉挛，引发肺动脉高压、腹痛、吞咽困难以及男性勃起功能障碍等。慢性肾脏疾病也是多因素共同作用的结果，反复溶血，血红蛋白在肾近段小管重吸收，并在近端小管上皮细胞内分解为含铁血黄素后沉积在肾小管上皮细胞内损伤肾小管；NO的消耗、生物利用度下降使肾脏血管收缩、阻力增大、肾血流量减少、肾脏缺血缺氧；肾脏内血栓形成等都会影响到肾脏功能造成急慢性肾损伤。睡眠后，体内酸性代谢产物积聚，导致体液环境偏酸，而偏酸性的pH6.8-7.0环境下最适宜补体作用，利于补体破坏红细胞，以及尿液浓缩，故患者常发现睡眠后尿色呈浓茶色或酱油色，然后逐渐减轻。二、临床表现根据患者临床表现和PNH克隆规模，可以分为经典型（溶血型、血栓型）、骨髓衰竭型（合并再生障碍性贫血、或骨髓增生异常综合征，PNH克隆<10%< span="">）、亚临床型（PNH克隆<1%< span="">）。（一）血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿是本病的典型症状，约1/4患者以血红蛋白尿首发，典型PNH患者由于血管内溶血，游离血红蛋白经尿液排出，呈酱油色或浓茶色。血红蛋白尿的发作常与睡眠有关。轻者一般持续2-3天，重者1-2周，甚至更长时间，伴有乏力、疲乏、胸闷、气促、吞咽困难、腹痛等，腹痛多呈痉挛性的，男性患者约50%有勃起功能障碍。轻度的慢性血管内溶血者，呈偶发型或不发作型，常常仅尿隐血和含铁血黄素试验阳性。疲劳、感冒、感染、月经、手术，服用铁剂、阿司匹林、氯化铵、鲁米那等激活补体系统、使机体环境偏酸的情况下可以诱发溶血。（二）造血功能衰竭许多患者血象全血细胞减少，或者逐渐发展为全血细胞减少。PNH细胞在异常免疫损伤正常克隆后扩张为优势克隆，正常克隆受抑使造血功能衰竭，表现为PNH-再生障碍性贫血综合征，或者有些患者以再生障碍性贫血首发，再显现为PNH。溶血导致不同程度贫血。长期慢性血管内溶血，铁经尿液丢失，导致缺铁性贫血。中性粒细胞减少及功能障碍易感染，血小板减少致出血倾向。（三）血栓形成PNH是血栓形成的高危人群，在西方曾经是致死的首要因素。PNH血栓可以出现在任何部位，但多见于腹部和脑部。血栓以深静脉血栓最多见，20％左右的PNH患者发生多部位的血栓。在PNH中，不典型部位包括肝静脉（Budd-Chiari综合征）、肠系膜静脉、脑静脉及静脉窦等的血栓形成，较普通人群发生率高。PNH的血栓形成临床表现多样，如组织器官的淤血、缺氧、肺动脉高压、呼吸困难、Budd-Chiari综合征等。动脉型血栓比例也不低，常发生在脑动脉、冠状动脉，以脑缺血及急性心肌梗死为主要临床表现。40%的PNH患者可能会发生血栓事件，这些患者中大约40%～67%死于血栓事件。PNH患者血栓形成往往预后不良，一次血栓事件的发生将会使PNH的死亡率增加5～10倍。既往认为亚洲人群血栓发生率不高，但研究发现血栓发生中位时间是PNH诊断后2年以上，偏短的随访时间可能观察不够。目前亚洲地区资料显示，发现东西方的血栓发生率相近。（四）脏器损害补体系统持续活化、血管内溶血、凝血系统的长期相互作用下，PNH有许多脏器发生功能损害。肝功能受损，可以见到谷丙转氨酶上升、间接胆红素为主胆红素增高，长期溶血导致肝胆系统结石形成，以及胆囊炎。慢性肾损害见到肾小管上皮细胞脱随尿液排出形成含铁血黄素尿。肾脏内血栓形成引发侧腰肋痛或腹痛、影像学上可表现为病肾增大，若双侧肾静脉主干血栓形成可致急性肾衰，表现为少尿、无尿、血肌酐、尿素氮进行性增高。肾小管功能异常还会出现肾性糖尿、蛋白尿，与溶血相关的严重高血压还可出现肾小球硬化等。溶血的一系列代谢产物不能及时排出体外，形成恶性循环最终进展为肾衰竭。呼吸困难、气促常常被认为是贫血所致，但是部分患者可能由于肺动脉高压引发。心脏彩色多普勒和脑钠肽前体，常常提示肺动脉高压和右心功能不全。三、实验室检查（一）血象正细胞性贫血常见，缺铁时也可见小细胞低色素性贫血。网织红细胞多增高，但已有合并再障而降低者。粒细胞和血小板亦常减少。溶血发作时外周血涂片可以见到有核红细胞、多嗜色红细胞和红细胞碎片。（二）骨髓象骨髓增生明显活跃或活跃，红系多增高。发生再障者，则增生减低。铁缺乏时骨髓铁染色示骨髓内外铁减少，甚至阴性。（三）血管内溶血详见本章第1节。（四）诊断性实验1流式细胞术检测气单胞菌溶素前体变异体（FLARE）通过与细胞膜上的GPI蛋白特异性结合，把PNH细胞（GPI-）和正常细胞（GPI+）区分开来。以流式细胞术结合FLARE诊断PNH既敏感又特异，通过对粒细胞和单核细胞分析能准确确定PNH克隆规模，且不受溶血和输血影响。以流式细胞术检测CD59-红细胞，根据缺失CD59的程度区分出对补体敏感程度不同的红细胞群：I型，正常；II型，部分缺失；III型，完全缺失。目前流式细胞技术技术是诊断PNH的金标准。CD55、CD59等一些补体调节蛋白的表达还会受到其它因素的影响，如细胞发育不全、炎症反应及血液中异常球蛋白等均有可能导致膜蛋白的缺失或者被遮蔽，导致检测阴性。建议对Coombs试验阴性或伴铁缺乏的溶血性贫血、血红蛋白尿、再生障碍性贫血、难治性贫血、不明原因血栓形成或少见部位血栓形成、血栓与溶血共存、不明原因血细胞减少尤其是年轻患者都要进行PNH筛查。2血清学实验早年的主要检测方法，酸溶血试验（Ham试验）曾是经典确诊试验，特异性较好但敏感性不足。糖水试验阳性高，但特异性差，常常作为筛选试验。还有蛇毒因子溶血试验和热溶血试验。四、诊断与鉴别诊断经典型PNH，常有血管内溶血的临床及实验室改变，过去结合Ham试验、蛇毒因子溶血试验或尿含铁血黄素试验中任两项阳性，即可诊断。现在流式细胞术检测发现GPI-粒细胞或者单核细胞即可确定PNH克隆存在，能发现合并造血功能衰竭或者亚临床型的PNH。再以红细胞缺失CD59的程度区分出各型PNH细胞。PNH需与再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征以及其他溶血性贫血相鉴别。五、治疗（一）支持治疗严重贫血时输注浓缩红细胞。既往认为PNH应该输注洗涤红细胞，以免带入血浆中的补体。但实际上浓缩红细胞中血浆比容在30%左右，而正常成人的血容量约占全身体重的7%~8%，因此输入的几十毫升血浆会迅速被机体稀释，不会引发PNH的溶血。另一方面，洗涤红细胞经生理盐水洗涤，虽然几乎去除了全部的血浆蛋白，但红细胞也有一定损失（约20%）和损伤，而且由于在洗涤过程中破坏了原来密闭系统，故红细胞应在4℃～6℃下保存，并且必须在24小时内输注。所以目前不再推荐PNH输注洗涤红细胞。铁剂可使活性氧产生，释放的一些氧自由基及中间产物，PNH细胞对氧化损伤很敏感，易诱发血红蛋白尿。肯定PNH合并缺铁者，治疗应从小剂量开始治疗，为常规剂量的1/3～1/10，有反应者应停用。输血除能提高血红蛋白，维持组织需氧，尚能抑制PNH红细胞生成，间接减少补体敏感的红细胞。所以PNH合并重度缺铁性贫血可以直接输注红细胞。雄激素有刺激红系造血作用，对部分患者贫血有改善作用。合并免疫异常患者可以酌情使用免疫抑制剂，如环孢菌素。重型再生障碍性贫血合并小PNH克隆，亦可以使用抗人胸腺细胞免疫球蛋白治疗。（二）溶血发作控制首先避免诱发溶血的因素，如感冒、腹泻、某些药物等。糖皮质激素能减少或减轻血红蛋白尿发作，开始以泼尼松0.5～1mg/kg/d，发作停止后减半，再逐渐继续减量直至最小量，或维持量。口服或静脉滴注碳酸氢钠碱化血液、尿液，能够协助控制溶血，减少对肝肾脏器的负担和损害。既往认为抗氧化药物对细胞膜有保护作用，如维生素E、阿魏酸钠﹑亚硒酸钠，但疗效不确切。（三）血栓形成血栓形成者应进行溶栓和取栓治疗。考虑PNH常合并血小板减少，所以血栓形成后，在抗凝、溶栓与出血之间需要权衡利弊。血栓形成的急性期用药首先考虑肝素或低分子量肝素，随后使用维生素K依赖性凝血因子的拮抗剂。肝素治疗的早期因肝素浓度低会出现溶血加剧，这是因为低浓度肝素活化了补体替代途径，但是随着浓度上升，高浓度肝素抑制补体活化，可能抑制环节是C5b-9。所以低分子量肝素更合适。华法令可以降低PNH血栓形成风险，建议在中性粒细胞PNH克隆超过50%，血小板大于10万/dL时，无华法令禁忌症的PNH考虑预防使用。但即使使用华法令预防，仍然会有血栓发生。阿司匹林、氯吡格雷等抗血小板药物不能有效减少血栓形成风险，且PNH伴血小板减少者易增加出血风险，不建议使用。Eculizumab能有效减少血栓形成。（四）抗补体C5单克隆抗体补体C5是补体级联反应中最后一个酶促反应底物，C5在C5转化酶作用下裂解为C5a和C5b，C5b参与膜攻击复合物(MAC)C5b-9的形成。Eculizumab是抑制末端补体成分活化的重组人源型单克隆抗体，能特异性与人末端补体蛋白C5结合，通过抑制补体C5向C5a和C5b的裂解，阻断炎症因子C5a的释放及膜攻击复合物C5b-9的组成。Eculizumab治疗后，可使血清乳酸脱氢酶回到正常值或接近正常值，有效控制溶血，减少输血需求。Eculizumab能很好的抑制PNH中补体系统活化、控制溶血及血栓的发生，使血栓发生率下降，多数患者不再发生血栓。前述许多PNH中升高的诱发血栓的因子在eculizumab治疗均显著下降。Eulizumab可以抑制溶血、减少NO消耗、减少血栓事件的发生、调节血压、改善肾脏、肺动脉血流，能够有效减少肾脏损害和肺动脉高压发生率和发生程度。肾功能不全者在接受Eculizumab治疗的同时可辅以利尿剂、纠正电解质紊乱等，肾功能损伤严重可考虑血液透析。随访资料显示，规范使用eculizumab治疗的PNH生存时间与正常人群相当，能够改善PNH的自然病程。Eculizumab治疗后有感染脑膜炎球菌风险，治疗前最好进行疫苗注射。紧急情况下未及使用疫苗者，应给与青霉素预防脑膜炎发生。（五）化疗PNH是克隆性疾病，因此也有探索联合化疗治疗难治性PNH。方案是柔红霉素或高三尖杉酯碱联合阿糖胞苷小剂量化疗。多数患者见到血红蛋白水平上升，输血减少和PNH克隆受抑。但是此法骨髓抑制重，恢复期长，需要良好的隔离保护和支持治疗。（六）异基因造血干细胞移植PNH是克隆性疾病，故惟有异基因造血干细胞移植能治愈PNH。但PNH临床呈良性过程，需斟酌移植风险。在国外，随着eculizumab广泛使用，PNH取得与正常人群相当的生存期，对照移植较高的相关死亡率，eculizumab时代是否需要异基因造血干细胞移植治疗PNH，被提出了疑问。PNH的异基因造血干细胞移植通常推迟到疾病进展，发生危及生命的并发症，如并发重度造血功能衰竭，或者反复溶血无法控制时进行。六、预后PNH生存期较长，中位时间10～15年，主要死亡原因是血栓、感染和出血。许多患者合并再生障碍性贫血。转化为骨髓增生异常综合征和急性白血病少见，预后差。（何广胜）2014年09月09日10114
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何广胜主任医师 江苏省人民医院 血液内科 阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,PNH）是一种或几种造血干细胞X染色体上PIG-A基因突变使GPI锚链蛋白合成受阻，引发细胞膜上锚链的一组膜蛋白丢失，补体活化异常所致的造血功能衰竭症。Flaer检测法提高了诊断的敏感性，为PNH的早发现、早治疗打下了良好的基础。PNH的血栓形成、肺动脉高压、慢性肾功能不全等非典型症状较前受到了更多关注。Eculizumab治疗改变了PNH整个治疗面貌，异基因造血干细胞移植作为PNH的惟一治愈手段亦有进展。1 Flaer诊断 流式细胞术是诊断PNH的金标准，并可以对PNH血细胞进行定量分析。随着研究的不断深入，人们已经注意到了传统的流式细胞术对于PNH克隆检测的局限性。CD55、CD59等一些补体调节蛋白的表达还会受到其它因素的影响，如MDS、细胞发育不全或炎症反应等均有可能导致膜蛋白的缺失[1]。在这种情况下人们找到了FLAER分析法来补其不足。FLAER试剂是一种嗜水气单胞菌毒素的变体，从患暴发性传染病的鲫鱼中分离出嗜水气单胞菌株，该菌株培养的上清液中可分离到嗜水气单胞菌毒素，对其进行灭活等处理得到FLAER试剂。FLAER分析法对诊断的敏感性和特异性都有所增加。有文献报道[2]FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0.1%，其它靶向标记检出率的敏感性为1%；FLAER可以特异地与细胞膜上的GPI锚蛋白结合，可直接反应锚蛋白的缺失情况，而PNH本身就是由于GPI锚蛋白合成异常所致的疾病，其它靶向标记只是单纯与锚链的抗原特异性结合，且这些抗原的表达不稳定，还会受到其它因素的影响，因此FLAER诊断的特异性与其它靶向标记相比较而言有所提高。由于红细胞表面某些糖蛋白的存在使FLAER不能很好的与锚蛋白结合，FLAER分析法一般只用于粒细胞和单核细胞的检测，且不受溶血与输血的影响[1]。有文献报道[3]了536例疑似PNH患者FLAER分析法与传统流式分析法对比结果，发现FLAER分析法63例患者检测到了PNH克隆，检出率11.8%，并且克隆数都较大，不受溶血和输血的影响；而传统分析法只有33例患者被检测出有PNH克隆，检出率6.2%，检测出的克隆数都较小，很容易受到溶血和输血的影响。Battiwalla[2]等的对PNH患者多参数流式细胞术诊断进行了对比研究，靶向标记分别为：粒细胞FLAER、CD55、CD16，单核细胞FLAER、CD55、CD14，每个细胞系的靶向标记分别两两组合，研究的结果显示FLAER+CD55对粒系及单核系的PNH克隆的检出率最高。此文献还分析了单独应用CD16、CD14对粒系、单核系PNH克隆的检出率≥1%，单独应用FLAER粒系、单核系PNH克隆的检出率≥0.1%。考虑到FLAER技术对PNH诊断的敏感性和特异性都有所增加，因此对于PNH小克隆的监测已不再是问题。综合近年来多篇文献，对多参数流式诊断监测PNH小克隆意义总结如下：①PNH患者移植后微小残留病灶及嵌合状态的监测。移植有效PNH克隆会逐渐减小，移植无效或移植后复发PNH克隆会变化不明显或克隆增大。移植后嵌合状态好，FLAER与其它靶向标记会同向运动，既二者同时减小。反之，二者反向运动，既相互矛盾。移植有效使GPI锚蛋白正常表达，单纯FLAER分析法检测不到锚蛋白的缺失。CD55、CD16、CD14等锚链蛋白受到炎症、嵌合状态等因素的影响而表达缺失，并不是锚蛋白异常引起的其表达缺失。因此，单独FLAER分析法更能反映PNH患者移植后PNH克隆动态变化情况，二者结合分析更能反映机体的嵌合状态。②反应免疫抑制治疗效果。AA或MDS患者接受免疫抑制治疗骨髓状况改善后PNH克隆会逐渐减小。AA-PNH综合征患者接受强化免疫抑制治疗后，骨髓处于抑制期时，PNH克隆有可能会因获得生存优势而增大。PNH红细胞克隆的监测，国际上首推CD59，但 Hchsmann[4]等对CD58、CD59对网织红细胞和成熟红细胞PNH克隆检测的对比研究显示，前者的敏感性高于后者，检出的PNH克隆前者大于后者。对哪些患者要进行PNH的筛查呢？PNH诊断指南[5]建议对Coombs试验阴性或伴铁缺乏的溶血性贫血、血红蛋白尿、再生障碍性贫血、难治性贫血、不明原因血栓形成或少见部位血栓形成、血栓与溶血共存、不明原因血细胞减少尤其是年轻患者都要进行PNH筛查。有文献报道大约26%的PNH患者由于血红蛋白尿而被诊断[6]。日本的一项研究表明大约有45%的PNH患者有AA或MDS病史[7]。70%的AA患者可以检测出PNH克隆，细胞数通常小于10%，偶尔也可见到大克隆，经研究证实这部分患者确实存在PIG-A基因突变。由MDS转变为PNH的患者有以下特点：难治性贫血、骨髓增生低下、HLA-DR阳性、遗传学正常、中重度血小板减少、对免疫抑制治疗效果好。对免疫治疗敏感的患者可能存在误诊的可能性，是AA而非MDS，事实上AA转变为PNH较常见，而MDS转变为PNH很少见[8]。MDS患者也可检测到锚链蛋白的缺失，是否存在PIG-A基因突变仍有待进一步研究[8]。2 临床症状2.1血栓形成 血栓事件是PNH患者的主要死因，动静脉均可发生。PNH患者血栓形成是多因素共同作用的结果，PNH患者补体活化及溶血过程中释放一些物质，如C5a，可使机体处于一种潜在的炎症状态下[7]9，炎症可使单核细胞、血管内皮细胞过度表达及释放组织因子，而启动凝血过程。炎症又可以和凝血系统相互作用，炎症因子加重凝血异常，凝血异常又可加剧炎症反应，形成恶性循环。炎症介质可破坏内皮细胞，内皮细胞活化增加，大量组织因子释放入血启动外源性凝血途径。有文献报道CD55CD59缺乏的血小板更易被活化或NO的消耗促使血小板活化增加[10]、聚集粘附形成血栓。血管内溶血使游离血红蛋白累积，血液黏滞度增加，也可能由于血红蛋白沉积在血小板上影响血小板的功能[11]使血液始终处于一种高凝或血栓前状态。静脉血栓多发于深静脉、肺，肝静脉、肠系膜静脉、皮肤静脉血栓相对少见[9]。临床表现多样，如组织器官的淤血、缺氧、肺动脉高压、呼吸困难、布加综合症等。动脉血栓常发生在脑动脉、冠状动脉，以脑缺血及急性心肌梗死为主要临床表现。PNH患者合并动脉血栓者较少见，这部分患者中以中青年占多数 [12]。40%的PNH患者可能会发生血栓事件，这些患者中大约40%～67%死于血栓事件[13]。PNH患者血栓形成往往预后不良，一次血栓事件的发生将会使PNH的死亡率增加5～10倍[13]。血栓形成风险大小可以通过一些客观指标来判断，从而可以采取有效的措施来预防血栓事件的发生。许多文献已经报道[14]了血栓事件的发生可能与PNH粒细胞克隆数有关，PNH粒细胞大于50%，血栓形成的风险明显增加。粒细胞克隆每增加10%血栓的发生率就会增加4倍[15]。血栓形成还与输血史，溶血程度，抗凝治疗，血小板数量有关。28%无输血史的PNH患者会发生血栓事件[16]。有大克隆及典型溶血症状的PNH患者易形成血栓[15]17。有文献报道PNH患者抗凝治疗会促使新的血栓形成或原有血栓进展 [18]。个别PNH患者接受肝素抗凝治疗后会出现肝素诱导的血小板减少症(HIT)[19]，而接受肝素抗凝治疗的患者HIT发生率为1%～3%，这部分患者中血栓事件的发生率高达89%。临床上凡怀疑有血栓形成的PNH患者可以通过彩色多普勒、增强CT、血管造影、MRI等检测手段反应出来，但造影剂有诱发溶血及血栓事件的可能而限制了其应用[20]。2.2肺动脉高压（pulmonary hypertension ，PAH）反复的血管内溶血使血液中游离的血红蛋白增加，血红蛋白与NO的结合能力要比氧气高百倍，NO的消耗增加；溶血或炎症损伤血管内皮细胞，内皮细胞合成的NO减少；溶血可释放精氨酸酶，合成NO的前体L-精氨酸分解增加，NO合成减少[21]。最终将会导致NO的清除、生物利用度下降。正常机体NO量是PNH患者的6～10倍[22]。而在机体内NO有重要的生理作用：调节平滑肌功能、平衡血管的舒缩活动、维持器官血流量。基于NO的生理功能，血液中NO含量下降，肺血管平滑肌功能失调、肺血管阻力增大逐渐形成PAH。据报道大约有50%的PNH患者有PAH[23]。此外溶血使肺动脉的紧张性增加[22]24、血液的高凝状态及肺栓塞也是PAH形成的重要原因。有文献报道溶血相关的血栓事件极易发生在肺部[23]，也许与此有关。一项对PNH患者肺动脉高压的研究提示：60%的患者有亚临床血栓[25]。呼吸困难是PAH及右心室功能不全典型的临床表现，66%的患者会出现中重度呼吸困难。衡量PAH的2个重要指标：彩色多普勒和脑钠肽前体（amino terminal-pro brain natriuretic peptide，NT-proBNP）。BNP的水平与PAH及右心功能不全的程度相关联。NT-proBNP（≥160pg/ml）的水平在溶血性贫血患者中是一个判断病情严重程度的重要指标。46.6%的PNH患者NT-proBNP≥160pg/ml [23]。彩色多普勒主要是通过观察三尖瓣反流量（Tricuspid reverse flow，TRV）来反应PAH，在溶血性疾病中通常TRV＞2.5m/s（相当于肺动脉压力＞30mmHg），存在PAH 。但是TRV还受到心输出量等多种因素的影响，对于TRV＞2.5m/s是否真正存在PAH很多文献提出了质疑。Bachir等对96例多普勒证实有PAH的溶血性贫血患者行右心导管测肺压，只有24例患者肺动脉压力是增高的[21]。因此，超声评估PAH存在一定的假阳性率，该指标定在何程度才能更好的反应肺动脉压力的情况，或者是否需要其它指标的参考仍有待进一步研究。对于有Eculizumab上市的国家并且能够承担该药物长期治疗的费用，改善肺动脉高压及呼吸困难当然首选Eculizumab药物治疗。对于无Eculizumab药物上市的国家或是由于经济原因不能选择Eculizumab治疗的患者来说，PAH一定要采取综合治疗，如利尿、扩血管（钙通道阻滞剂、前列环素类药物）、强心、抗凝、吸氧等。另外，合理使用镇静剂，可预防PAH危象的发生。2.3慢性肾脏疾病（chronic kidney disease ，CKD）慢性肾脏疾病也是多因素共同作用的结果，反复溶血，血红蛋白在肾近段小管重吸收，并在近端小管上皮细胞内分解为含铁血黄素，含铁血黄素沉积在肾小管上皮细胞内损伤肾小管；NO的消耗、生物利用度下降使肾脏血管收缩、阻力增大、肾血流量减少、肾脏缺血缺氧；肾脏内血栓形成等都会影响到肾脏功能造成急慢性肾损伤。临床表现：肾小管上皮细胞脱随尿液排出形成含铁血黄素尿，肾脏内血栓形成引发侧腰肋痛或腹痛、影像学上可表现为病肾增大，若双侧肾静脉主干血栓形成可致急性肾衰，表现为少尿、无尿、血肌酐、尿素氮进行性增高，肾小管功能异常还会出现肾性糖尿、蛋白尿，与溶血相关的严重高血压还可出现肾小球硬化等。PNH患者CKD的发生率高出常人6.6倍[26]。有文献[26]对129例PNH患者的报道中得出大约64%的PNH患者存在CKD的并发症，43.1%CKD 1-2 期，20.7%CKD 3-5期，35.7%无CKD。存在CKD并发症的患者中59%的患者输血史0-1次[21]，提示血细胞破坏增多会增加CKD的风险。此外，可以看出大部分存在肾脏并发症的PNH患者都处于慢性肾病的早期阶段，出现3-5期CKD往往提示预后不良，溶血的一系列代谢产物不能及时排出体外，形成恶性循环最终进展为肾衰竭。有文献报道[18]，8%～18%的PNH患者死于肾衰竭。若患者出现肾功能不全的症状或高度怀疑肾脏有血栓形成时MRI检出的敏感性较高，有人检查发现80%（8/10）的PNH患者MRI提示有肾脏血栓形成的证据[11]。治疗上，在接受Eculizumab治疗的同时可辅以利尿剂、纠正电解质紊乱等，肾功能损伤严重可考虑血液透析。2.4其它 常见的临床症状还有腹痛、吞咽困难、呼吸困难、勃起功能障碍、乏力等，正常的日常活动无法维持，严重影响患者的生活质量。究其原因都是由于溶血、NO消耗所引起。3. 治疗PNH克隆<10%(AA-PNH、MDS-PNH、亚临床PNH等)且无症状的患者不需要治疗，只要定期随访即可，6或12个月筛查一次[8]；对于有典型症状的患者则需要早期干预治疗，骨髓移植和Eculizumab是唯一证明有效的方法，部分患者也可用糖皮质激素，但长期应用的毒副作用需要考虑。3.1EculizumabEculizumab是人源型抗补体C5单克隆抗体，补体C5是补体级联反应中最后一个酶促反应底物，C5在C5转化酶作用下裂解为C5a和C5b，C5b参与膜攻击复合物(MAC)C5b-9的形成。Eculizumab是抑制末端补体成分活化的重组人源型单克隆抗体，能特异性与人末端补体蛋白C5结合，通过抑制补体C5向C5a和C5b的裂解，阻断炎症因子C5a的释放及膜攻击复合物C5b-9的组成，从而达到控制溶血、减少炎症反应、减少血栓形成的目的。大量的研究已经证明了Eculizumab是治疗PNH最安全有效的药物。Eulizumab可以抑制溶血、减少NO消耗、减少血栓事件的发生、调节血压、改善肺动脉高压及呼吸困难等情况。Kelly[27]等对79例接受Eulizumab治疗的PNH患者的研究显示，治疗前81%的患者需要输血支持，治疗后66%的人可脱离输血，治疗一年时仍有2/3的患者需要输血，但输血间期明显延长，随着治疗时间的延长，大部分人可脱离输血依赖。治疗前后血栓事件的发生率分别为5.6%和0.8%，且采取预防性抗凝治疗的患者，Eulizumab治疗后抗凝治疗停止，在随后的长期观察中无血栓事件发生。Hillmen[28]等对195例PNH患者的研究中发现接受Eulizumab治疗的患者血栓发生率从7.37%降至1.07%，治疗后F1+2（凝血酶原片段1+2），D-dimers（D-二聚体），PAP（纤溶酶抗纤溶酶复合物），TAT（凝血酶抗凝血酶复合物）水平都有不同程度的下降[29,30]。考虑到血栓事件是PNH患者的主要死因并与患者的预后密切相关，因此长期接受Eulizumab治疗的患者，死亡率明显下降，与正常人相比无显著差异，Kelly[27]等的研究还显示在Eulizumab治疗期间死亡3例，且死因都与本病无关，1例55岁死于转移性结肠癌，1例76岁有老慢支病史死于肺炎，1例79岁死于心衰。另有文献报道[23]Eulizumab治疗后，LDH、精氨酸酶-1、NO消耗、NT-proBNP在2周内明显改善，治疗两周后溶血、贫血、乏力、呼吸困难、腹痛等症状均有不同程度改善。且在治疗过程中，患者的血压明显下降，收缩压中位改变-10mmHg，舒张压中位改变-40mmHg。具体用法：前四周600mg，ivgtt，qw×4次，从第五周开始900mg，ivgtt，两周一次，若患者的症状较重维持剂量可酌情增加。对于Eulizumab的血药浓度问题，两周即可达到有效治疗浓度，最低有效浓度35ng/ml [31]，治疗有效与否可通过监测LDH的变化来反映。脑膜炎奈瑟菌感染是Eulizumab治疗过程中最严重的不良反应，因此用药前要注射疫苗。其它常见的不良反应按发生可能性由大到小依次为头痛、鼻咽炎、恶心、腹泻、皮疹、发热、呕吐等，这些不良反应在初始治疗时较明显，在治疗过程中会逐渐改善[7]。美中不足的是Eulizumab只能控制溶血症状，无法彻底治愈PNH，只能抑制血管内溶血，无法抑制血管外溶血，有加重血管外溶血的可能性，如膜表面沉积补体C3片段的红细胞在脾脏破坏增多，最终可致脾脏肿大，有些患者接受治疗后网织红计数仍然很高可能就是此原因。此外，价格昂贵、终身用药、定期用药给患者带来了极大的经济负担，患者一旦应用Eculizumab，则需每两周输注一次直到患者去世或PNH自发消失(极少发生)，若中断治疗，患者随即出现无法控制的溶血及其并发症，后果不容乐观。Eculizumab虽说是目前治疗PNH的首选药物，但该药在许多国家还没有上市，对于这些国家的PNH患者来说只能选择激素类药物或其它免疫抑制剂，别无它选。前面已经述及Eculizumab的常见不良反应，都只是短期内的副作用，长期用药的不良反应、患者的耐受情况、是否会出现新的基因突变或出现耐药基因不可预知。3.2异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）BMT是惟一能够彻底治愈PNH的有效方法，由于Eulizumab药物的存在及移植相关高死亡率，很多情况下BMT并不是患者的最佳选择。对于一些无Eulizumab药物上市的国家，骨髓移植仍然是治疗本病的首选方案。综合文献对PNH患者骨髓移植适应征总结如下：①存在PNH引起的严重并发症，如反复血栓形成，难治性溶血性贫血等。②骨髓衰竭。③Eulizumab药物治疗效果欠佳。非清髓或减低剂量预处理方案适应人群：①年轻患者，对生育有要求。②有脏器功能不全及不能耐受清髓预处理方案者。IEBMT报道的48例接受同胞全相合骨髓移植的PNH患者2年生存率为56%，大部分患者于移植后1年内死亡[32]。欧洲血液与骨髓移植小组报道的PNH患者异基因骨髓移植5年存活率70%，移植失败6%，急慢性GVHD分别为15%和20%[33]。Santarone[34]等对26例PNH骨髓移植患者的报道，其中22例同胞全相合，1例无关供体全相合，1例同胞部分相合，1例无关供体部分相合，1例单倍体（其母），移植失败8%，移植相关死亡率42%，15例清髓预处理患者中随访一年移植相关死亡率26%，1例死于急性GVHD，1例死于慢性GVHD，2例死于感染。11例减低剂量预处理患者一年内累计死亡率63%，8例HLA全相合的患者中4例死亡，1例死于移植失败，1例死于慢性GVHD，1例死于感染，1例死于布加综合症。所有移植患者Ⅱ～Ⅳ级急性GVHD累积发病率42%，15例清髓的患者中，Ⅱ级急性GVHD6例，Ⅲ～Ⅳ级急性GVHD2例；11例减低剂量预处理的患者中，Ⅱ级急性GVHD2例，Ⅲ～Ⅳ级急性GVHD1例。20例长期存活的患者中，慢性GVHD累积发病率50%，广泛的慢性GVHD累积发病率16%。随访10年无病生存率57%，23例HLA全相合患者10年无病生存率65%，15例清髓预处理患者10年无病生存率73%。长期存活的15例患者中（11例清髓预处理，4例减低剂量预处理）血液系统恢复正常，无PNH克隆，无血栓事件，无本病的复发。目前还没有大宗病例对于同胞骨髓移植、无关供体移植及脐血移植的对比研究。3.3其它治疗是否要对PNH患者进行预防性抗凝治疗或在Eulizumab治疗同时性抗凝治疗尚存在争议，抗凝治疗有可能使原有血栓加重或新血栓形成，或肝素诱导的血小板减少症。因此，临床医生在行抗凝治疗前一定要权衡利弊，充分考虑的有可能出现的各种不利因素，并与患者及家属充分沟通后再做决定。前面已经述及本病主要是由于反复溶血、NO消耗、生物利用度降低、血小板活化增加最终导致血栓形成，从这一连锁反应人们考虑到能否试图增加NO的生物利用度（外源性吸入NO或口服精氨酸）而起到治疗PNH的作用，这一设想在镰刀型细胞贫血症的患者中已经证实了其不可行性[26]，典型的PNH是溶血性疾病中红细胞破坏最严重的血管内溶血之一，由此可以推测增加NO的生物利用度对PNH患者无效。总之，Flaer时代的PNH早期明确诊断、早期进行干预治疗已不再是幻想，问题的重点在于什么时机应采取什么样的治疗措施，是否要对该病的诊断及治疗进行分层分级、哪些是PNH患者预后不良的高危因素、是否合并其它基因突变类型、是否有必要对疾病的危险程度进行评分仍有待研究。此外，PNH克隆达到多少时需要干预治疗、哪些患者需要动态监测目前还没有统一的标准。在PNH的治疗中，Eculizumab虽是一线用药，但不足之处仍需考虑，如加重血管外溶血，输注次数频繁，输注计划严格，长期应用不良反应尚不可预知和价格昂贵等。BMT虽能彻底治愈本病但移植相关死亡率高。这些问题也是PNH治疗过程中较为棘手的问题，如何应对及很好的解决这些问题并使患者从中获益最大仍需广大 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