HPV疫苗的研究进展与临床应用前景

子宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，据国际癌症中心（IARC）估计，全球每年宫颈癌的新发病例数约为49.3万，死亡人数约为27.4万[1]。半个多世纪以来，宫颈癌预防工作的重点在于定期筛检与早期治疗。宫颈癌的发生虽然是一个多因素、多步骤、多基因共同作用的结果，WHO于1992年宣布其中高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）感染是引起宫颈癌变的首要因素。随着HPV与宫颈癌之间病因学联系的明确，研究者将目光投向针对病因的预防及治疗措施——HPV疫苗。

1. HPV与癌症 HPV是一种主要感染鳞状上皮和黏膜鳞状上皮细胞的双链环状DNA病毒，基因长7.5~8.0 kb，含8个开放阅读框（Open reading frames, ORFs），分3个基因区，即早期区（Early region, E区）、晚期区（Late region, L区）与非编码区（Uncoding region, UCR）或上游调控区（URR）。E区编码E1、E2、E4、E5、E6、E7等早期蛋白，参与病毒DNA的复制、转录、翻译调控和转化等功能；L区编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2；UCR区含有HPV基因组DNA的复制起点和HPV表达所必需的调控元件。

目前已知的HPV亚型约100余种，其中有40多种可感染生殖道。按照HPV感染与发生宫颈癌的潜在危险性，将HPV分为低危型（HPV6、11、42、43、44 等）和高危型（HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56等）两类。研究表明约70 %宫颈癌的发生与HPV16及HPV18的感染有关，故这两型HPV相关基础研究与疫苗研究成了研究的热点。90%的生殖器疣病例是由HPV6、11感染所致，所以，目前的四价疫苗针对HPV16/18/11/6。除宫颈癌外，直肠癌、口咽癌、女性外阴癌及男性阴茎癌的发生亦与HPV感染存在相关性。在美国，每年确诊的HPV相关性非宫颈癌恶性肿瘤的患者与宫颈癌相当。由于宫颈癌早期筛查工作，使其发病率在逐渐下降，但是直肠癌、口咽癌的发病率却在逐渐上升。多数HPV相关性恶性肿瘤也与HPV16及HPV18有关，所以应用目前的HPV疫苗，或许会降低HPV相关性非宫颈癌恶性肿瘤的发生率[2]。

2. HPV疫苗

HPV疫苗能激发机体的细胞和体液免疫应答，有效的预防和控制HPV感染，在预防和治疗宫颈癌方面发挥作用。HPV疫苗可分为预防性疫苗和治疗性疫苗两大类。一般而言，免疫预防性疫苗主要诱导机体体液免疫反应，产生的中和性抗体在HPV进入机体前即能与病毒的抗原结合，从而防止HPV的感染。免疫治疗性疫苗主要引起机体的细胞免疫反应，产生的活化免疫细胞能识别和攻击HPV感染的组织，包括HPV引起的恶性肿瘤组织。2006年6月8日，美国食品与药品管理局（FDA）正式批准默克公司（Merck & Co., Inc.）生产的Gardasil（中文，加德西）宫颈癌预防性疫苗上市，这是世界上第一个肿瘤疫苗。随后英国葛兰素史克公司（GlaxoSmithKline, GSK）的宫颈癌预防性疫苗Cervarix也成功上市。美国FDA于2008年9月12日再次宣布，批准Gardasil用于预防6~26岁女孩和妇女HPV16、18型所致外阴和阴道癌。我国HPV预防性疫苗的基础研究始于20世纪90年代末期，目前国内有多家公司也在进行HPV预防性疫苗的临床前研究，预计2~3年可进入临床试验研究阶段，我国正在研制的包含有HPV 16/18/58/6/11五种型别HPV L1-VLPs（Virus-like particles,VLPs）疫苗集成性强，更适于我国国情。

2.1 预防性疫苗

目前HPV预防性疫苗种类较少，是一种亚单位疫苗。现有的此类疫苗是由病毒衣壳蛋白L1或L1与L2组成，在细胞内可自我组装成病毒样颗粒（Virus-like particles,VLPs）。VLPs具有与完整病毒相同的抗原空间表位，可激发机体的CD4+T细胞介导的体液免疫应答，刺激机体产生高效价保护性中和抗体，从而保护疫苗接受者不被疫苗所代表的类型的HPV病毒感染。因此，VLPs是一种合理的预防性疫苗。由于VLPs只含病毒抗原，不含病毒DNA，具有免疫原性的同时，不会导致病毒感染或诱发癌症，使用安全。由Merck公司开发的HPV疫苗Gardasil为四价疫苗,包含HPV16/18/11/6的VLPs，单一铝盐为佐剂。GSK公司开发的HPV疫苗为包含HPV16和HPV18的VLPs双价疫苗。上述两者均属于预防性疫苗。

相关临床试验结果证明上述两种疫苗均具有良好的耐受性，且没有严重的不良反应，抗体效价比自然感染HPV患者高50倍[3]。疫苗在16 000名以上的妇女中进行的临床II期及III期试验，结果表明，疫苗能够保护HPV16和18相关的病毒感染及CIN III病变。临床II期实验的跟踪结果显示，疫苗的保护期可达6.4 年[4~6]。Gardasil预防外阴和阴道癌的研究方面，Merck公司对15 000位参加最初试验研究的受试者进行大约2年的随访，证明HPV16/18阴性的受试者的预防效果达到100%，而对照组中10位出现外阴的癌前病变，9例出现阴道的癌前病变。研究结果未能证明疫苗对HPV16/18感染者的益处。综合Gardasil II期和III期临床试验资料，针对总体研究人群，试验组HPV16/18相关CIN II/III IS降低率达39.0％（95％ CI 23.3%~51.7％），HPV16/18相关外阴上皮内瘤样变（VIN）II/III级病变及阴道上皮内瘤样变（VaIN）II/III级病变降低率达69.1％（95％ CI 29.8%~87.9％），HPV6/11/16/18相关CIN及AIS降低率达46.4％（95％ CI 35.2%~ 55.7％），HPV6/11/16/18相关生殖器疣降低率达68.5％（95％ CI 57.5%~77.0％）[7]。Gardasil在中国的临床试验已经启动，国内有4家医院参加临床试验。鉴于HPV感染进展到宫颈癌是一个漫长的过程，常需要10~20年，因此两类上市疫苗对宫颈癌的预防效果最早也需要在2020年之后才能获得。

引起生殖道感染的HPV有40余种，不同型别的VLP引起的免疫反应具有高度型别特异性，仅在高度同源的HPV型别之间（如HPV18和45，HPV16和31）有一定程度的交叉保护反应，因此一种型别的HPV L1 VLP 难以交叉保护预防其他型别的感染，理想的L1 VLP疫苗应涵盖所有的高危型HPV。目前第二代预防性疫苗的发展方向主要是提高疫苗对不同型别的覆盖程度和降低成本，疫苗研究集中在乳头瘤病毒的次要外壳蛋白L2。

由于目前上市的宫颈癌预防疫苗仅涵盖HPV16及18两种高危型，可预防约70%的宫颈癌，临床试验表明这两类疫苗对其他高危型HPV的感染及癌前病变几乎没有预防作用，而且只对HPV16及18感染阴性的人群有预防相应型别HPV 感染及相关的肿瘤的作用，所以接种宫颈癌疫苗不能完全代替宫颈癌筛查，目前宫颈癌筛查仍是预防宫颈癌的有效手段。同时由于上述两种预防性疫苗价格上昂贵，需要低温保存等因素，极大地限制了在宫颈癌高发的发展中国家使用。

疫苗的给药注射分三次在6个月时间左右完成，即开始，第2个月和第6个月以后注射。Gardasil目前已在90个国家和地区上市，全球已使用达1 000余万例。Cervarix已在60多个国家使用。该疫苗的适用对象主要是年龄在9岁以上的妇女，目前欧洲国家HPV疫苗免疫计划都建议在比较年轻、还没有开始性生活的时候接种。对HPV DNA阳性和血抗体阳性的妇女是否接种有争论。澳大利亚和韩国已批准该疫苗对9岁到15岁的男孩使用[8]。

自从FDA在2006年批准Gardasil上市后，所报道的大多数不良反应事件都不严重。最常见的不良反应包括晕厥（昏倒）、注射部位疼痛、头痛、恶心和发热。免疫接种后出现晕厥比较常见，尤其是青少年。因晕厥而摔倒有时可能会导致严重受伤，如颅脑损伤，这可以通过让疫苗接种者在接种后静坐15 min来避免。同时，还建议在这15 min的观察期内关注其有无严重过敏反应发生。

2.2 HPV治疗性疫苗

由于在HPV感染相关的癌前病变及转化的恶性肿瘤细胞中，病毒序列常呈整合形式存在，晚期蛋白基因常断裂丢失，难以检测到晚期蛋白，因此预防性疫苗对已经感染相关病变没有治疗作用。HPV治疗性疫苗是用于防止已经存在的癌前病变继续恶化，并清除HPV感染细胞和肿瘤细胞。早期蛋白E6和E7含有多个抗原表位，其基因整合入细胞基因组DNA后，能在感染组织中持续表达，可诱导细胞恶性转化及维持恶性表型。由于这两个癌基因只在HPV转化的恶性细胞中持续表达，而在正常组织中不表达，因此属于肿瘤特异性抗原，是进行肿瘤免疫治疗的理想靶抗原。治疗性疫苗目的是通过刺激机体发生细胞免疫应答以清除病毒或已经变异的细胞，目前主要把E6和E7蛋白作为治疗性疫苗研究的靶抗原。

现有的治疗性疫苗研究以E6、E7为基础，有多种形式，包括重组载体疫苗、树突状细胞（dendritic cells, DC）疫苗、多肽或蛋白疫苗及DNA疫苗等。重组载体疫苗是目前HPV治疗性疫苗的研究热点，是将病毒或细菌作为载体携带抗原编码基因，感染机体后表达靶抗原来诱导免疫应答。痘疫苗和腺病毒是常用的载体。在一项关于融合有HPV16和18的E6和E7基因重组牛痘病毒疫苗TA-HPV的II期临床试验中，29例子宫颈癌患者作为受试者接种1次TA-HPV疫苗，结果4例产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）反应，初步验证了重组痘病毒疫苗的安全性和有效性[9]。Transgene公司的TG4001已完成了II期临床试验，TG4001是把HPV16的E6和E7基因重组到痘病毒上，并以白细胞介素2（IL-2）作为佐剂的病毒载体疫苗，临床结果显示其对HPV16 CIN2/3患者有效[10]。多肽疫苗是将病毒编码的蛋白产物直接注入体内以诱导CTL反应，从而对肿瘤细胞起杀伤作用。现用于临床试验的HPV16 E7多肽疫苗包括HLA-A *0201、HLA-A*2401、T辅助性肽及B细胞肽，以E7多肽免疫HPV相关肿瘤病人，可产生特异性的CTL反应。DNA疫苗是将编码抗原性蛋白DNA直接注入体内，表达目的蛋白，启动针对该抗原的体液和细胞免疫。编码HPV16/18的E6/E7抗原表位的DNA疫苗ZYC101、ZYC1O1a在I期和II期临床试验中也显示出了良好的抗HPV反应。另外，DC细胞作为专职的抗原提呈细胞，其在免疫排斥方面的作用越来越受到重视，已成为肿瘤治疗性疫苗研究领域的一个新热点。DC细胞疫苗在动物实验获得肯定的结果后，也进行临床I/II期实验。DC为基础的疫苗的作用原理是将E6和E7导入DC细胞，令其在DC细胞中表达，并被DC细胞提呈到细胞表面，激发CD4+和CD8+T细胞反应。

现在虽已研发出多种治疗性疫苗，但每种治疗性疫苗都存在有不容忽视的弊端，如多肽疫苗的抗原性弱，需要结合佐剂以及严格的HLA型使其应用受到限制；病毒载体疫苗的安全性无法保障具有潜在的致病性，而且再次应用可能会影响免疫效果；DNA 疫苗虽然具有易于构建和改造、不需要佐剂、稳定性好、成本低等优点，但是由于HPV整合后具有潜在危险性，且免疫原性较差，使其应用受到限制。因此，要求我们制定新的疫苗研究策略，寻求治疗性疫苗新的发展方向，例如可通过对病原体结合力弱的表位氨基酸序列进行修饰而增强疫苗的抗原表位，还可通过与细胞因子、趋化因子及共刺激分子的共同使用来增强疫苗的免疫效果。

治疗性疫苗尚停留在I/II期临床试验阶段，真正应用于广大癌患者还需要相当长的一段时间。并且，由于不同癌症患者的免疫系统状态各有特点及众多的安全性问题，使得治疗性疫苗要比预防性疫苗面临更严峻的挑战。

3. HPV疫苗的问题与展望 虽然HPV疫苗研究取得了可喜的成绩，但是还存在诸多问题。主要有以下几个方面：①致病的HPV种类很多，目前已有的无论是二价还是四价疫苗都不能预防所有型别的HPV感染；②疫苗的副作用和不良反应等还需要长期监测，疫苗的安全性还需要相当长一段时间来研究；③最佳免疫途径、最适剂量还有待探索；④疫苗适宜接种人群、性别、年龄及疫苗的保护期限，接种后还是否需要宫颈癌筛查，筛查间隔时间等问题需要长时间进一步询证医学证实；⑤由于80%的宫颈癌发生在发展中国家和较贫困地区；目前疫苗的费用还比较昂贵，有待开发廉价疫苗；⑥每年全球大约有47万例新发宫颈癌病例，到目前为止尚无逆转已经发生的感染和已经存在的病灶得以消除的有效办法。但是，我们相信，随着HPV免疫机制研究不断深入，基因工程技术和工艺设计水平不断成熟完善，高效价廉的HPV疫苗会在不久的将来陆续开发上市。 参考文献[1]. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, et al. Global cancer statistics, 2002[J]. CA Cancer J Clin, 2005, 55(2): 74-108.[2]. Gillison ML, Chaturvedi AK, Lowy DR. HPV prophylactic vaccines and the potential prevention of noncervical cancers in both men and women[J]. Cancer, 2008, 113(10 Suppl): 3036-3046.[3]. Cutts FT, Franceschi S, Goldie S, et al. Human papillomavirus and HPV vaccines: a review[J]. Bull World Health Organ, 2007, 85(9): 719-726.[4].Govan VA. A novel vaccine for cervical cancer: quadrivalent human papillomavirus (types 6, 11, 16 and 18) recombinant vaccine (Gardasil)[J]. Ther Clin Risk Manag, 2008, 4(1): 65-70.[5].Heymann WR. The human papillomavirus vaccine[J]. J Am Acad Dermatol, 2008, 58(6): 1047-1048.[6].Keam SJ, Harper DM. Human papillomavirus types 16 and 18 vaccine (recombinant, AS04 adjuvanted, adsorbed) [Cervarix][J]. Drugs, 2008, 68(3): 359-372.[7].Jenkins D. A review of cross-protection against oncogenic HPV by an HPV-16/18 AS04-adjuvanted cervical cancer vaccine: importance of virological and clinical endpoints and implications for mass vaccination in cervical cancer prevention[J]. Gynecol Oncol, 2008, 110(3 Suppl 1): S18-25.[8]. FDA approves cervical cancer vaccine, AP, accessed June 8, 2006. ; National Cancer Institute. Cervical Cancer Report. Available at: http://women.cancer.gov/planning/whr0001/cervical.shtml. Accessed August 2005. [Poljak, Vesna; Daley, Gemma. “Australia to Subsidize Merck Cervical Cancer Vaccine (Update 3)”, Bloomberg, 2006-11-29. Retrieved on 2007-01-26.，The Department of Health and Ageing (2007-08-13). The National HPV Vaccination Program-Frequently Asked Questions for Young Women. Retrieved on 2007-09-28.][9]. Borysiewicz LK, Fiander A, Nimako M, et al. A recombinant vaccinia virus encoding human papillomavirus types 16 and 18, E6 and E7 proteins as immunotherapy for cervical cancer[J]. Gene Ther, 1996, 347: 1523-1527.[10].Liu M, Acres B, Balbul JM, et al. Gene-based vaccines and immunotherapeutics[J]. PNAS, 2004, 101: 14567-14571.