干细胞治疗肌萎缩侧索硬化症的研究进展

中山大学附属第一医院神经科 刘强 姚晓黎

摘要：肌萎缩侧索硬化症是一种致死性神经变性疾病，尚无有效治疗措施。干细胞由于其具有分化成运动神经元的潜能，受到极大的关注。用于ALS治疗的干细胞有胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带血非造血干细胞及诱导产生多能性干细胞。其治疗的作用机制主要分为三种：细胞替代, 神经营养因子释放和免疫调节。

关键词：肌萎缩侧索硬化症 干细胞治疗细胞替代 神经营养因子释放 免疫调节

基金项目：广东省博士启动基金资助项目（编号：5300783）；广东省科技计划项目（编号：2006B36003003）。

通讯作者：姚晓黎，E-mail: yeyaoxiaoli@sohu.com

肌萎缩侧索硬化（ALS）是一种进行性神经变性疾病，由于上、下运动神经元变性导致延髓、四肢、躯干、胸部及腹部肌肉逐渐无力和萎缩，多因呼吸肌麻痹而死亡。目前尚无有效的治疗方法，力鲁唑（riluzole）为Glu拮抗剂，可使ALS病人的生存期平均延长3个月，是目前唯一被美国FDA批准的临床药物^【1】。其他的治疗措施还包括维生素、神经营养因子及基因治疗等^【2】，但是都只减慢而不能阻止疾病进展。

最新的研究表明，组织特异性干细胞具有分化成其他细胞或组织的潜能，可以分化为运动神经元，这为ALS的治疗开创了更广泛的空间。目前对于干细胞治疗的作用机制分为三种：细胞替代（cell replacement）,神经营养因子释放（trophic factors delivery），免疫调节（immunomodulation）。细胞替代理论源于选择性采用有功能的细胞替代变性神经元可以得到临床体征的长期改善。移植的细胞存活，整合到内生的神经网络，然后导致功能改善。释放营养因子是一种更为实用的短期方法，干细胞治疗的有效性归因于产生的神经营养因子能够支持细胞生存、诱导内生的细胞增殖、促进神经纤维再生。第三种理论源于最近研究认为神经系统的炎症在神经变性病的发病机理中起重要作用。慢性炎症的抑制能够解释干细胞移植的积极效果^【3】。

现将近年关于ALS干细胞治疗研究进展综述如下。

1、治疗ALS的干细胞种类

干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。干细胞按照生存阶段分为胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESC)和成体干细胞（somatic stem cell）。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。用于ALS治疗的干细胞有胚胎干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞和脐带血非造血干细胞等。

1.1 胚胎干细胞

胚胎干细胞是指由胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）或原始生殖细胞（primordial germ cell,PGC）经体外抑制培养而筛选出的细胞。胚胎干细胞（ES细胞）是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官。但是人胚胎干细胞应用于临床面临伦理及形成畸胎瘤等复杂因素^【4】。

1.2 神经干细胞
神经干细胞（neural stem cell,NSCs）指来源于神经系统, 具有自我更新能力。在特定条件诱导下能够向神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞分化的潜能^【5】。

1.3 骨髓间充质干细胞

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells , MSCs)具有多向分化潜能，能分化成神经元 、神经胶质细胞。因MSCs 具有获取简便,对供体损伤小,增殖力强,来源广泛，具有迁移至组织损伤部位的能力；很强的免疫抑制特点，可自体移植，也可异体移植等优点^【6】, MSCs 向神经细胞的分化为ALS的治疗带来新的希望^【7】。

1.4 脐带血非造血干细胞

脐带血非造血干细胞（umbilical cord blood-derived stem cells）具有多向分化潜能,其在体外条件培养下可以分化为具有神经细胞和神经胶质细胞特征的细胞[1 ] ;植入到大鼠脑内可分化成胶质细胞或神经元^【8】。与hMSC和hMSC-NSCs比较，脐带血细胞在CSF中生存率较低，在蛛网膜下仅看到很少的细胞，在脑组织中没有发现细胞^【9】。

1.5 诱导产生多能性干细胞

最近, 将人类体细胞诱导成为多能性干细胞（induced pluripotent stem cells，iPS）的研究成果在生命科学领域引起了一次轰动, 分化的细胞可以通过少数几个基因的外源导入而被重编程到具有多能性的状态,其意义在于可以将患者的体细胞重编程为多能干细胞，再分化为特异性的运动神经元。iPS类似于人的ES，具有多能性，可分化为各种细胞，但可绕过ES的伦理学争论，从而成为具有患者特异性的细胞^【10】。

2、替代治疗

2.1 直接的运动神经元替换要求移植的细胞不仅能分化为运动神经元,而且能被受者的中枢神经系统神经元识别和连接,通过合适的神经纤维发出轴突在肌细胞形成突触，恢复运动传导通路^【10】。

通过诱导因子如维甲酸、音猬因子，可以将小鼠ESCs诱导成类胆碱功能神经元^【11】。还有研究报道在双丁酰cAMP的处理下小鼠ESC源性运动神经元将轴突延伸到前根^【12】。然而，即使经过这种处理，这些轴突也限制在移植神经元的附近前根，也没有发现神经肌肉接头^【11】。Nakamura et al.(2005)采用体外神经环境，发现胚胎脊髓前体细胞细胞移植到损伤的新生鼠脊髓可以幸存，迁移，分化为神经元，少突胶质，但是很少分化为星形胶质。而且，这些细胞的移植可以促进运动和反射反应的恢复^【13】。Erb et al.(1993)报道，移植的运动神经元可以存活最多18周，重新使失神经的肌肉神经化^【14】。但是Kerr和同事通过实验发现大多数人胚胎干细胞移植到大鼠后，保持未分化状态，只有很少一些变成类胆碱功能的，不会分化为运动神经元或者与肌肉建立联系^【15】。

NPCs能够分化为CNS中三种主要的成熟细胞类型：神经元、星形胶质和少突胶质^【16】。Wu和合作者在体外将人胎儿的NSCs分化为类胆碱运动神经元，移植到脊髓，首次证明人胎儿的NSC发出轴突与外周肌肉形成神经联系，这个发现与运动功能的部分改善有关，揭示慢性运动神经元变性的成年大鼠仍然存在形成新的神经联系的合适的环境条件^【17】。

MSCs能分化为非间充质系,具有很好的可塑性。已经有证据表明，MSCs能在体内体外分化为神经元和胶质细胞^【18】。在缺乏酸性神经磷脂酶的老鼠，移植MSCs可以延迟神经异常的发病，延长生存期^【19】。但是H.-J. Habisch没有观察到移植hMSC、hUBC能延长ALS鼠的生存时间。处理组和对照组的ALS鼠都死于130天左右，且两组腰段脊髓未发现神经元数目的不同。可能原因是移植细胞的数量^【9】。 Garbuzova-Davis et al.（2003）; Corti et al.（ 2004)移植后可在CNS或外周血管看到大约1.5％的全部细胞类型^{【19 20】}，而H.-J. Habisch仅看到单个细胞，原因可能是注射部位不同，前者是注入外周血管，而后者是注入CNS。对此结果可能有两点解释，移植到CNS的细胞数目、脑和脊髓部位细胞的归巢和分化。移植后十天观察到大多数细胞在蛛网膜下，主要分布在枕大池和基底池附近，很少的细胞在第四脑室和脊髓周围。研究发现，hMSCs体内移植对症状前的运动表现有利，但是考虑到生存时间或疾病进展，hMSCs和hUBCs没有产生主要的治疗作用^【9】。

临床上Mazzini et al. (2003)进行了一项研究，以检验在ALS进行MSCs移植的效果。研究组选了7个有严重下运动神经体征和轻度上运动神经体征的ALS。从每个病人取一部分骨髓进行MSC培养，3到4周后将细胞悬浮在自体的脑脊液中从外科暴露的脊髓T7–T9水平直接移植。移植后没有病人出现严重不良反应。分别在移植后3月和6月行MRI检查，没有发现脊髓结构改变和异常细胞增殖。在4个患者的下肢近段肌群观察到肌力减弱呈轻度减缓的趋势，这个效应与移植细胞的数目相关^【21】。骨髓间充质细胞很容易从ALS的骨髓中分离到，长期观察已经证实自体同源MSCs的培养扩充和移植入人的脊髓是安全的，在ALS病人可以耐受。长期观察还发现用力肺活量FVC和ALS-FRS的下降在至少50％的病人中移植后显著减慢^【22】。

2.2 尽管运动神经元的变性是ALS主要病理特点,但其它类型细胞也受到影响。Terao et al. （1994)发现随疾病进展脊髓中间神经元也变性^【23】，而且减少的脊髓中间神经元本身也能造成截瘫^【24】。这样，因为中间神经元的减少，很有可能接受胚胎干细胞来源的功能性运动神经元的移植后ALS病人的瘫痪仍旧存在，如此，同样需要这些中间神经元的替代^【25】。

死亡的运动神经元的功能替代被证明很难，不论是整合到脊髓环路还是促进新的轴突向肌肉的生长。然而采用胶质细胞的干细胞治疗可能是一个成功的方法，特别是基于胶质细胞在改善神经病理中的角色。已经知道运动神经元周围的胶质细胞调节运动神经元的存活^【2】。有报道，增加过表达变异SOD1运动神经元周围的非神经元细胞能够减少SOD1导致的病理状态^【26】。变异的非神经元细胞能引起运动神经元的病理改变，单独的运动神经元变异SOD1表达不足以引起神经元变性^{【27 28】}。这些结果提示胶质细胞的干细胞替代治疗对改变疾病进展有帮助。

最新研究认为星形胶质分泌一种毒素杀伤运动神经元，从而认为星形胶质是导致ALS运动神经元死亡的元凶。以Kevin Eggan为首的哈佛研究小组从表达正常人SOD1 基因和表达突变SOD1基因的鼠胚泡中培养胚胎干细胞，然而分化为运动神经元。他们发现即使正常的神经元在有SOD1突变基因的星形胶质细胞的出现下，14天后会有50％的减少。相反的条件下，突变的运动神经元在正常星形胶质的围绕下，其减少的程度远没有那么严重^【29】。Serge Przedborski等的研究更为深入，他们证明了这种特殊毒素来源于星形胶质细胞。他们发现将运动神经元培养在星形胶质细胞培养后的培养基上，与直接暴露于星形胶质的结果一样，这种结果提示该毒素是胶质细胞分泌的。他们指出SOD1蛋白和谷氨酸盐跟这种毒素可能相同^【30】。

3、营养支持和神经保护

研究发现具有神经保护作用的营养因子包括胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）、胰岛素样生长因子－1（IGF-1）、血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、心肌营养素-1（CT-1）、白血病抑制因子（LIF）、睫状神经营养因子（CNTF）、脑源神经营养因子（BDNF）、神经生长因子-3（NT-3）^【31】。

近十年大量的文献报道在实验室将NSCs分离、增殖、纯化，然后移植到神经变性病的模型中。然而，多数实验观察到的有利效果并非来自于细胞替代或移植细胞在神经微环境中的起效，而是来自于释放能够刺激或抑制内生细胞的活动的能力。虽然不少研究者将ESC或NSC在体外分化为神经元，但有学者发现ESCs或组织源性NSCs在成年小鼠脊髓内不形成典型运动神经元，推测可能是缺乏足够的环境因素^【11】。也有研究认为ALS鼠的剩余脑成体NSCs和祖细胞仍然正常，而且到疾病晚期仍然存在并行使重要的NSC功能。也认为NSCs所处的微环境(niche)在增殖能力和表型特征存在间断改变，使得NSCs比神经祖细胞更易受影响。尽管mSOD1小鼠的神经祖细胞数量正常，但是新生的神经元的存活受到限制，这样会阻碍细胞募集和神经元的替代治疗，应该通过改变细胞微环境来替代变性的上运动神经元^【32】。Kerr DA同样认为干细胞治疗的积极结果主要是干细胞分化为胶质细胞样细胞，为运动神经元提供营养因子，而不是直接的神经元替代^【15】。

体外修饰的人神经祖细胞移植到SOD1转基因鼠脊髓后分泌GDNF出现症状的轻度改善^【33】。输注胶原细胞源性神经营养因子(GDNF) 血管内皮生长因子(VEGF), 胰岛素样生长因子-1(IGF-1)能保护ALS动物模型运动神经元，增加动物的生存时间^{【25 34】}。在一些实例中NSCs移植主要分化为移植源性的星形胶质，偶尔分化为少突胶质，提示治疗效果是星形胶质提供（分泌）的营养因子^【35】或者移植源性少突胶质对轴突重新髓鞘化作用^【36】。

除了神经胶质细胞，肌肉也能为运动神经元和轴突提供营养支持^【37】。而且发现去神经的骨骼肌分泌神经营养因子减少，包括BDNF、NT-3、NGF、CT-1、HGF、GDNF。加速的轴突缺失和功能异常是因为运动神经元缺乏这些营养因子，由此发现成肌细胞通过改善GDNF的分泌预防运动神经元的变性^【38】。

在疾病出现症状前，移植hNPC释放GDNF能维持将近100％的运动神经元，否则这些神经元会减少到正常值的30％。即使在症状晚期，GDNF也能维持至少30％的运动神经元，这个水平足以防止症状的发生。然而肌肉的神经支配并没有看到相似结果，肢体功能也没有改变。

hNPC产生的GDNF能调节运动神经元的存活^【39】。在ALS，病人和SOD1鼠的脊髓都有胶质细胞的活化增生^【40】。假设胶质细胞的反应性增生继发于运动神经元的死亡，很有可能如果移植侧一定数量的神经元复活，会减少胶质细胞的增生。但是发现移植侧和对照侧的星形胶质没有减少，还观察到小胶质的高反应性。那么，GDNF的保护作用不是通过调节宿主反应性星形胶质细胞介导的，GDNF在一个高反应环境促使表达SOD1蛋白的运动神经元存活。被GDNF调节的类胆碱功能的运动神经元甚至没有开始表达细胞凋亡的早期标志如ubiquitin。作者认为GDNF可能与hNPC分泌的其他因子共同作用激活宿主运动神经元的与抗凋亡蛋白联系的细胞保护通路^【39】。

4、抑制炎症反应

McGeer (2002)提供了大量的证据证明在ALS的受累组织中存在活化的小胶质、星形胶质和白细胞渗透。小胶质细胞参与的过度固有免疫防卫创造了一个不利于宿主组织生存的炎症环境^{【3 41】}。小胶质细胞的活化信号是该该炎症反应的启动因素，抑制小胶质细胞活化的抗生素，如二甲胺四环素minocycline可以减少神经损伤后的炎症反应^【42】。有研究者报道混合免疫抑制剂或者CD4抗体能延长人神经干细胞移植的存活，混合免疫抑制剂和CD4抗体能够阻断IL－2的产生，抑制移植区域CD4、D8细胞募集以及削弱小胶质细胞的吞噬反应来保护NSC移植物的。同时免疫抑制能够为移植的干细胞分化为神经元、建立与宿主神经元的网络提供足够的时间，从而改善ALS转基因鼠的疾病结果，表现为发病延缓、运动神经元疾病进展缓慢、生存时间较长^【43】。

移植后的健康运动神经元能否在活化的小胶质细胞和其它炎症反应的有害（不利）环境中存活。帕金森和亨廷顿病的移植研究表明移植的多巴胺能神经元和纹状体神经元可以长期存活并行使功能,而不受疾病的影响^【25】。已经有很多研究报道关于骨髓来源的MSCs在体内体外具有免疫抑制的特性^【44】。Ryan et al.（2005)详尽论述了移植的MSCs遇到一个陌生的炎症环境，可能诱导免疫调节过程限制炎症以利于自我生存，作用机理可能是分泌一些可溶性因子以形成一个免疫抑制微环境^【45】。

5、展望

虽然动物研究和部分临床试验证明干细胞对神经变性疾病的治疗非常有潜力，但是，干细胞治疗在临床广泛应用之前还有很长的一段路要走。到目前为止，人们对干细胞的了解仍存在许多盲区,还有许多问题需要解决。对ALS的病因研究的更多了解能为干细胞治疗提供更多帮助。随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等各种生物技术的快速发展，干细胞研究领域向深度和广度不断扩展，人们对干细胞的了解也将更加全面。21世纪是生命科学的时代，也是为人类的健康长寿创造世界奇迹的时代，干细胞的应用将有更加广阔的前景。

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