p53基因与肝癌的研究进展

肝癌是最常见的癌症之一，我国肝癌发病率和死亡率是世界上最高的，占全球每年新发病例和死亡人数的55%，其中80%以上的肝癌是肝细胞癌(HCC)型。p53被誉为“分子警察”，其主要生物学功能是维持细胞基因组的稳定，负调节细胞的生长，诱导细胞凋亡。研究发现，人类恶性肿瘤中至少有50%发生了p53基因改变。随着人们对肝癌的发病机制深入了解，越来越多的证据表明p53与肝癌发生的过程有着密切的联系。本文就p53在肝癌中的表达和检测方法，以及p53与肝癌临床特征关系和基因治疗的进展做综述。

1 p53在肝癌中的表达

在正常人群和良性疾病中, 极少检测到P53抗体，而绝大多数恶性肿瘤患者均检测到了血清P53抗体，阳性率大约在7%-63%。肝癌中超过50%存在p53基因突变，在36%的进展期肝癌中发现p53基因的突变和缺失，因而该基因被认为与肝癌有相关性。龚玲等检测40例乙肝相关性肝细胞肝癌组织及其相应的癌旁组织中p53的表达。结果P53蛋白在肝癌组织中阳性表达率明显高于癌旁肝组织(P=0.047)。任勇等检测49例HCC组织、21例癌旁组织、10例正常肝组织P53蛋白的表达情况，结果HCC组织中P53蛋白阳性表达53.1%。癌旁组织中P53蛋白阳性表达为9.5%。二者差异有显著性(P<0.01)。10例正常肝组织无P53蛋白表达。喻宏等收集62例原发性肝癌组织及相应癌旁组织，检测p53的表达并进行观察。结果p53在癌组织中表达明显高于癌旁组织，与肿瘤分化程度呈正相关(P<0.05)；p53表达与性别、年龄、肿瘤大小无差异。张志培等收集42例HCC石蜡组织，检测HCC组织中突变p53的表达，分析结果为突变p53的阳性表达主要定位于细胞核中，HCC组织中突变p53阳性率为47. 62%。

不同研究的HCC组织中P53抗体阳性率差异较大, 官泳松等认为可能与研究纳入患者的种族、肿瘤分期有关，也可能与p53基因突变的部位、类型有关。但HCC组织中P53蛋白过表达是肯定的，p53可作为反应HCC生物学行为的重要指标。

2 p53在肝癌中的检测方法

通常对肿瘤组织中的p53基因测序或用免疫组织化学显示肿瘤细胞中突变的P53蛋白是检测肿瘤有无p53基因突变的金标准。

野生型p53抑癌基因产物P53蛋白的半衰期短(1~2h)，在正常细胞内保持低水平，因而难以检测；而突变的p53基因表达的P53蛋白产物由于具有较长的半衰期(2~12h)，可以用免疫组织化学检测，这是临床上运用最广泛的在蛋白水平上检测p53基因突变。陈可和等用寡核苷酸芯片技术检测我国肝细胞癌p53 基因7个常见突变位点的突变频率及形式, 以DNA 测序法验证结果。共检测肝细胞癌石蜡包埋标本54例，p53基因突变率为38.9%(21/54)。p53突变主要发生在249编码区；以DNA测序法对结果进行验证，两种技术检测结果重合率100%。

与免疫组织化学检测相比，FASAY对p53突变检测有更高的敏感性。

FASAY技术是一种在RNA水平上对p53基因突变进行检测的等位基因功能分析技术。吴小末等利用该技术结合DNA测序对28例临床原发性肝细胞癌手术样本中的p53基因结构突变与P53蛋白的功能进行了检测。发现FASAY检测的阳性结果为15例，p53基因突变率为53.6%。cDNA测序这15例阳性样本均发生了p53基因突变，而13例FASAY阴性样本中未检测到基因突变。研究结果表明，FASAY是一种灵敏的检测HCC中的p53基因结构与功能突变的技术。

许多研究发现P53抗体出现与P53蛋白积聚以及p53基因突变有明显相关性, 因而也可以相对简单地检测血清中P53抗体状态推测有无p53基因突变。笔者同意FASAY技术可以用于大规模地筛选HCC中p53的突变和研究它们的转录活性，最终有助于HCC肿瘤患者的诊断、预后和治疗。血清P53抗体检测方便、准确、特异性高，可应用于临床作为辅助诊断。

3 p53与肝癌临床特征的关系

官泳松等用ELISA法定量分析了68例肝癌患者血清P53抗体与性别、年龄、饮酒史、HbsAg、KPS评分、病理诊断、肿瘤分化程度、肝硬化、肿瘤生长方式、肿瘤分期、血管侵犯、有无肝外转移、Child分级、血清白蛋白、AFP、血清铁蛋白等的相关性。认为血清P53抗体阳性与肿瘤分化程度低(P = 0.020)、肝外转移(P =0.002)、肿瘤分期晚(P = 0.027)、血管侵犯等代表肿瘤不良生物学特征的指标有关。与前人研究相似。

3.1 p53与肿瘤分化程度及肿瘤分期的关系 官泳松等认为病理分化程度为低分化者，P53抗体阳性率66.7%，明显高于高分化(25.0%)和中分化(15.4%)者。肿瘤分期晚者，P53抗体阳性率高于分期早者。这些结果提示血清P53抗体阳性患者，其肿瘤分化程度低，分期晚，恶性度高。基础研究也发现p53基因突变率在分化较差的肝癌中更高，在肿瘤晚期比在早期更多地出现p53基因突变。龚玲等认为低分化肝癌组织中p53阳性表达率明显高于高中分化者(P=0.017)。Cox比例风险模型多因素分析发现临床分期(P=0.028)为独立的预后因子。

3.2 p53与肿瘤血管的关系 Volpert等的实验证实p53突变使血管内皮生长因子(VEGF)的表达量升高，使血管生成抑制因子(TSP)显著下降，说明p53突变在肿瘤血管生成中起到了重要作用。任勇的研究也表明了p53基因突变是导致VEGF高表达的原因之一。可见HCC肿瘤血管的生成与其转移密切相关，并受VEGF表达的影响，p53可通过调控VEGF的表达影响HCC的血管形成。Saffroy和官泳松都认为血清P53抗体阳性者, 肿瘤更容易侵犯血管(P = 0.010)。但是，突变的P53蛋白与肿瘤由原位生长到侵入血管再到远处转移这一系列过程中的作用机制尚未明确，有待在分子生物学水平深入研究。P53抗体阳性和阴性患者间肿瘤长径没有明显差异(秩和检验P>0.05)。

3.3 p53与AFP的关系 Saffroy在分析了130例欧洲的肝癌患者后, 发现P53抗体与AFP无相关性。官泳松等[11]研究进一步发现，在AFP小于诊断标准400μg/L的41例患者中，有10例P53抗体阳性。分子生物学研究也发现，p53基因的突变可能出现在肝细胞癌变过程的早期, 并随肿瘤发展, 逐渐升高。因此，我们可以利用P53抗体的高特异性，在肝癌诊断上可以与AFP互补，有助于AFP<400μg/L患者的诊断；同时对于AFP>400μg/L的患者，P53抗体阳性可以提高肝癌诊断的把握度。

此外，Shiota等分析86例HCC，发现P53抗体阳性与血胆红素和肿瘤数目有关，与瘤体大小无关。

4 p53与肝癌的基因治疗

基因疗法为肝癌治疗开辟了崭新的途径，而p53基因又是与人类肿瘤相关性最高的抑癌基因。近几年,人们将正常的野生型p53基因替代肿瘤细胞中突变p53基因，显示了较好的应用潜力。寻找高效、导向性的载体系统目前是肿瘤基因治疗临床应用的关键。

4.1 病毒类载体 包括腺病毒及逆转录病毒。目前腺病毒载体更常用作p53转移的载体,腺病毒介导的p53基因治疗已广泛开展。Reiser等通过实验证实腺病毒介导的基因转移可有效地将p53基因导入肿瘤细胞中。Terence等以受体介导基因转移系统介导野生型p53转染含突变p53的肝癌细胞株，发现能明显抑制其生长。郭英等通过表达wtp53重组腺病毒载体,将p53基因导入肝癌细胞株-PLC/PRE/5细胞,通过诱导其凋亡和细胞周期阻滞可抑制该细胞的生长。在施明等的研究中观察到了腺病毒对肝癌细胞BEL402、HLE及HuH7均有很高的转染率，表明腺病毒能有效地将目的基因导入肝癌细胞中并高效表达。

4.2 脂质体载体 朱光宇等研究表明运用脂质体作为载体较单纯导入基因具有更高的转染效率，同时在一定范围内，基因的量与转染效率成正比。同时宿主体不会出现外源性病毒基因所致的特异性免疫反应，表达时间较腺病毒载体长、分裂期及非分裂期细胞均可被转染等特点。卢勤等研究还进一步证实了转铁蛋白能增强脂质体-基因转染。

4.3 PTD融合蛋白系统 PTD融合蛋白系统被认为是一种很有前途的运载工具。丁忠阳等成功构建了含p53基因的原核表达载体pTATHA/p53，在大肠杆菌BL21(DE3)LysS内诱导表达并进行了纯化。通过纯化的p53蛋白经腹腔免疫BALB/c小鼠,制备高效价的抗血清。该实验为应用PTD-p53蛋白治疗肝癌的实验研究奠定了理论基础。

此外，穆红等p53-cDNA的真核表达质粒p53-pcDNA3对人源性肝癌细胞系HepG2进行转染，采用RNA原位杂交的方法证明了外源p53-cDNA在HepG2-p53细胞中的转染和转录，成功导入的p53-cDNA可诱导HepG2细胞发生凋亡，有良好的肿瘤基因治疗的应用前景。

肿瘤发生的一个重要机制就是抑癌基因失活和(或)癌基因活化。将正常的抑癌基因p53导入肿瘤细胞代替和补偿缺陷的基因，能从根本上抑制肿瘤的生长。抑癌基因p53其必将在肝癌的诊治中发挥重要作用。