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发表者：王海英 人已读
王海英1 唐承薇2
1 成都市第三人民医院消化内科
2 四川大学华西医院消化内科
【摘要】目的 研究慢性饮酒后小肠菌群的改变及其对机体的影响。方法Wistar大鼠随机分为对照、慢性酒精、慢性酒精恢复及急性酒精四个组。慢性酒精组饮用25％酒精6个月，慢性酒精恢复组饮用25％酒精6个月后再饮水6个月，急性组以25％酒精按7.5g乙醇/kg体重/day连续灌胃3天。细菌培养分析回肠菌群的变化；HE染色观察回肠组织学改变。结果 慢性酒精组大鼠小肠需氧菌总量较对照组增加约10倍，以球菌增加明显，乳酸杆菌绝对值减少，与需氧菌的比例下降38%。慢性酒精恢复组乳酸杆菌数量较慢性酒精组增加数千倍，与需氧菌的比例显著回升，同对照组无明显差别。慢性和急性酒精组回肠绒毛呈出血、糜烂、倒伏等病变，但慢性酒精组病变较轻，戒酒后病变恢复。结论 长期饮酒后小肠需氧菌过长、乳酸杆菌减少，增强了肠道细菌的致病性，影响肠腔营养物质的吸收，导致酒精相关的肠道病变的发生，且这种改变是诸多因素共同造成的而非酒精直接作用的结果。
【关键词】酒精 ；细菌学；大鼠
Alterations of small intestinal microflora after chronic alcohol abuse. WANG Hai-ying, LI Jing, ZHOU Chao, et al. Division of Peptide Related With Human Disease, State Key Laboratory of Biotherapy, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu 610041, China
Corresponding author: TANG Cheng-wei, Email: cwtang@medmail.com.cn
【Abstract】Objective To investigate the alteration of the small intestinal microflora after chronic alcohol abuse and its effects on the host. .Methods Wistar rats were assigned to one of four groups: control、chronic、withdrawal and acute. The rats of chronic group were given 25% alcoholl for six monthes, withdrawal group rats were first given 25%alcoholl for six monthes, then withdrawed from it for another six monthes, the rats of acute group were received 7.5g alcohol/kg weight/day by 25% alcohol intragastric administration. Mucous of ileum was used for aerobic and anaerobic incubation and intestinal histophathologic changes were studied under light microscope. Results The amount of aerobe bacteria in the rat ileum after chronic alcohol abuse was ten folds higher than in normal control, especially with coccus, meanwhile the number of lactobacillus declined. The ratio of lactobacillus to aerobe bacteria decreased about 38%. The amount of lactobacillus after withdrawl was increased thousand tims compared with chronic group,having no differece with normal of a ratio to aerobe bacteria. Inflammatory lesions including bleeding and erosion were observed in small intestinal mucosa both in chronic and actue group, having recovered after withdrawl. Conclusions Aerobe bacteria overgrowth and decreased lactobacillus of the small intestine will strengthen the pathogenicity of gut flora and disturb the absorption of nutrient, resulting in many symptoms related with alcohol. And these changes are result from complex factors not direct effect of acohol.
【Keywords】Alcohol; Microbilogy; Rat
长期饮酒后常出现腹泻、腹胀、营养不良等，这种对糖、脂、蛋白质等营养物质消化吸收障碍的病理生理机制目前主要认为与肝、胰、小肠上皮细胞的损伤有关[1~3]。小肠是营养物质吸收的主要场所，这一功能受到肠腔内菌群的影响[ 4]。长期饮酒，估计作为细菌赖以生存的肠道内环境发生了重大变化，但小肠腔内的细菌谱及量发生了何种改变尚未见报道。如果小肠内菌群的重大变化直接与酒精有关，急、慢性饮酒后小肠腔内的菌群变化应该相似；停止饮酒后，小肠腔内的菌群变化应回复到正常状态。
小肠菌群对肠黏膜屏障的多方面生理功能具有重要影响，了解慢性饮酒后小肠菌群的改变有助于理解酒精相关的肠道病变及功能改变，也可为临床治疗提供新思路。
材料与方法
一．动物模型及分组
Wistar雄性大鼠32只(四川大学华西医学中心实验动物中心提供)，体重150～200g，随机分为4组。对照组（8只）：自由摄入标准颗粒饲料 (购自四川大学华西医学中心实验动物中心)，自由饮水。慢性酒精组（11只）：进食同对照组，每日饮水以25%酒精替代，持续6月。 慢性酒精恢复组（5只），进食同对照组，每日饮水以25%酒精替代，持续6月后改为饮水6月。急性酒精组（8只）：进食同对照组，每日给予25%酒精灌胃，连续3d，每日乙醇入量为7.5g /kg体重，分2次灌入。所有动物均单笼饲养在清洁级动物房，处死大鼠前均禁食不禁饮12h。
二．肠粘膜菌群标本收集
颈椎脱臼法处死大鼠后固定于解剖板上，常规消毒，开腹，无菌纱布覆盖切口。距回盲瓣10cm处切下回肠段约5cm，置于无菌平皿中，纵行剖开肠管，生理盐水反复冲洗，玻片轻轻刮取粘膜约0.1g，置于0.9ml无菌磷酸缓冲液（PBS）中。
三．细菌培养计数
1． 将所取标本分别以无菌生理盐水倍比稀释为1×10-2、1×10-3、
1×10-4稀释液，各取10μl接种于下列培养基上：血琼脂（BA）和麦康凯（MAC）需氧培养24小时；脑心浸液（BHI）和乳酸杆菌选择性培养基厌氧培养72小时。
以细菌计数仪计数菌落数，结果用菌落形成单位（colony forming unit，cfu）表示：CFU/ml＝菌落数×100×稀释倍数。
2．菌落纯培养后，根据其形成特征、细菌染色及其形态和生化反应，结合细菌自动生化鉴定仪（Microscan Walkway－40，美国DADE公司）作出细菌鉴定。
四．小肠黏膜组织学观察
取小肠组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚0.5μm，苏木精-伊红(Heamotoxin & Eosine，HE)染色，光镜下观察组织病理学变化。
五．统计学分析
采用SPSS13.0统计软件分析。数据以均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用方差分析，P<0.05为差异有显著性。
结 果
一．动物一般情况观察
急性酒精组大鼠在行乙醇灌胃后15分钟左右逐渐出现站立不稳，行走时摇晃，精神萎靡等现象，持续约3~4小时后消失；所有动物出现腹泻，但无黏液及脓血。慢性酒精组所有大鼠在饮酒2月左右开始出现脱毛，半数出现消瘦、体重不增、腹泻，其中3只大鼠死亡（分别发生在饮酒后第2、3、4月）。慢性酒精恢复组大鼠在最初半年里出现了同慢性酒精组相同的症状，停止饮酒后上述症状消失，脱毛明显改善。
二．小肠粘膜菌群变化
慢性酒精组大鼠需氧菌总量较对照组增加约10倍，P<0.05。其中以肠球菌、链球菌及表皮葡萄球菌增加为主，大肠杆菌数量变化不明显。在需氧菌增加的同时，乳酸杆菌的数量明显减少约10倍，P<0.05。乳酸杆菌和需氧菌的比例下降38%，P<0.05，（表1）。在慢性酒精组3只动物（37.5%）小肠粘膜中检出了奇异变形杆菌，其中一只同时发现有肺炎克雷伯菌，另3只动物厌氧培养检出酵母样菌，细菌量均>4 cfu/ml。
慢性酒精恢复组需氧菌总量较慢性酒精组略有增加，但P=0.05，仍显著高于对照组，P<0.05。其中大肠杆菌、肠球菌和链球菌的数量较慢性酒精组增加约10倍，P<0.05。同时，乳酸杆菌数量较慢性酒精组增加数千倍，乳酸杆菌和需氧菌的比例显著回升，与对照组无明显差别，P>0.05，（表1）。慢性酒精恢复组有1只动物检出奇异变形杆菌，细菌量达到4.24 cfu/ml。
急性酒精组动物的需氧菌总量及菌群种类变化不大，但乳酸杆菌数量较对照组减少百余倍，P<0.05，乳酸杆菌和需氧菌的比例下降45.7%，P<0.05，（表1）。与慢性饮酒不同，表皮葡萄球菌较对照组明显降低10倍左右，P<0.05。
表1 大鼠小肠粘膜主要细菌的变化
|
组 别 |
需 氧 菌 |
乳酸杆菌 |
乳酸杆菌/需氧 | |||
|
需氧菌总数 |
大肠杆菌 |
肠球菌和链球菌 |
表皮葡萄球菌 | |||
|
对照 |
4.43±0.67 |
3.45±0.88 |
3.27±1.52 |
3.37±1.48 |
5.82±0.75 |
1.34±0.29 |
|
慢性酒精 |
5.12±0.55* |
3.62±0.64 |
4.59±0.43* |
4.65±0.88* |
4.01±3.01* |
0.83±0.40* |
|
慢性酒精恢复 |
5.83±0.70* |
4.96±0.49** |
5.60±0.84** |
4.55±0.2* |
7.49±0.61** |
1.29±0.05** |
|
急性酒精 |
4.54±0.52 |
3.83±0.89 |
3.76±1.57 |
2.31±1.46* |
3.2±1.38* |
0.73±0.32* |
注：各细菌数量以对数值(log)表示，x±s；单位：cfu/ml；
*：与对照组比较，P<0.05；**：与慢性酒精组比较，P<0.05；
三．回肠粘膜组织学改变
慢性酒精组大鼠除3只死亡动物的小肠出现明显扩张、肠壁变薄、肠腔内有血性分泌物外，其余大体观均无明显改变。所有急性酒精组大鼠小肠粘膜呈糜烂、出血，绒毛倒伏、脱落和肠腺上皮细胞坏死；慢性酒精组大鼠肠粘膜组织学改变与之基本相同但程度较轻；慢性酒精恢复组大鼠肠粘膜组织病变明显改善（图1）。
对照 急性酒精 慢性酒精 慢性酒精恢复
图1 大鼠小肠粘膜组织学改变（HE染色，×400）
讨 论
灵长类动物及人正常生理状态下经口咽下的细菌大部分被胃酸和胆汁杀灭，少量细菌进入小肠后，在肠蠕动的机械性冲刷下，难以在小肠定居[5]。因此，小肠多为无菌状态，即使有细菌，也主要为乳酸杆菌和肠球菌等[6~7]。本研究观察到，所有正常大鼠小肠均有细菌定植。除肠球菌外，大肠杆菌、表皮葡萄球菌也是小肠的常驻菌群，大鼠与灵长类动物小肠菌群的差异可能与大鼠具有较大盲肠而回盲瓣功能不及灵长类动物发达等消化道器官的解剖差异有关。
小肠细菌过生长的病理生理机制之一是突破黏液层的屏蔽，干扰小肠黏膜生理功能[8]。因此本文观察了饮酒后对小肠黏膜菌群及数量的影响，发现长期饮酒小肠黏膜需氧菌总数增加约10倍，但主要是球菌明显增加。细菌过生长可增加对外源性乙醇的氧化，使更多的乙醇在肠腔被转化为醋酸盐和乙醛[9]，后者与细菌的代谢产物共同作用，导致对肠粘膜的损伤。
肠道乳酸杆菌等被认为是益生菌，它们在肠上皮细胞表面形成一层菌膜屏障，增强肠上皮细胞的紧密连结，促进肠道黏蛋白分泌及肠道运动功能，抑制其它细菌的黏附[10]。乳酸杆菌数量的绝对或相对减少可破坏肠道内环境的稳态，成为肠道炎症发生的病理生理基础[11]。正常时大肠杆菌可通过肠上皮细胞的Toll受体导致肠黏膜的轻微炎症，有助于黏膜免疫的发育。长期饮酒虽然大肠杆菌数量并未明显增加，但乳酸杆菌明显减少，乳酸杆菌/需氧菌比值降低34%，增加了大肠杆菌与肠黏膜接触的机遇，肠黏膜炎症反应加重，致病性提高，这可解释本研究所观察到的慢性饮酒导致大多数动物小肠黏膜轻度糜烂、出血和灶状坏死等现象。部分大鼠的死亡与大肠杆菌相对致病力提高可能有关。长期饮酒削弱乳酸杆菌对肠黏膜的保护作用在后来戒酒大鼠的实验中得到进一步的证实。戒酒大鼠虽然小肠黏膜需氧菌总量仍高于对照组，甚至大肠杆菌数量较长期饮酒大鼠显著增加，但乳酸杆菌以高于对照上百倍的数量增加，其对黏膜产生的保护作用及动物营养状态的改善显而易见。
细菌过生长对肠道局部和全身均可产生诸多不利后果。脂肪吸收不良是细菌过生长的普遍现象。正常情况下胆汁酸和葡萄糖醛酸苷或硫酸盐结合后形成无毒性的结合胆盐，可使肠道内脂溶性物质变成水油混合相，即乳胶颗粒，以便被肠上皮吸收。细菌过生长，使结合胆酸去结合化，非结合型胆酸形成增加，微胶颗粒形成减少，导致脂肪吸收障碍从而出现脂肪泻[12]。另外，过生长的细菌竞争利用肠道内碳水化合物，发酵后产生氢气、二氧化碳和短链脂肪酸[13]，这是小肠细菌过生长常出现的饱胀不适原因之一。本研究表明，长期饮酒后肠道内乳酸杆菌的绝对数量减少，使其对其它细菌及毒素的抑制作用减弱，有利于细菌过生长。这些改变从一个方面解释了慢性酒精组大鼠出现的体重不增、消瘦、脱毛等营养不良现象。
从理化因素的角度考虑，酒精可能是影响小肠细菌的直接因素。但本研究观察到短期与长期饮酒对大鼠粘膜菌群与菌量的影响差异甚大，提示酒精可能不是影响小肠细菌的直接因素，长期饮酒后所致肠道微生态的其它诸多改变导致了小肠菌群及菌量的改变。在慢性饮酒的部分动物，小肠粘膜出现了通常定植于大肠的细菌如奇异变形杆菌和肺炎克雷伯菌等，提示长期饮酒还可降低部分动物的肠道有效传输动力，丧失了肠蠕动的机械性冲刷作用，以致定植于大肠的细菌得以返入小肠，细菌在小肠容易定居、甚至过度生长。
总之，长期饮酒通过对肠道微生态的诸多改变导致小肠细菌过生长，削弱了乳酸杆菌对肠黏膜的保护作用，增加了大肠杆菌等需氧菌的致病性。这些新的知识有助于拓展对长期饮酒者消化吸收功能不良的治疗思路。
参考文献
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发表于：2008-11-07
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