骨科生物材料

三嵌段高分子骨组织工程支架材料的表面多肽修饰与细胞粘附性研究

郝杰¹ 郑启新² 郭晓东² 吴永超² 宋玉林² 杨大志²

（1.重庆医科大学附属第一医院骨科，重庆 400016；2.华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科，武汉 430022）

摘要：目的 用甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸对三嵌段髙分子骨组织工程支架材料进行表面修饰，并检测其细胞粘附性。方法 利用异双官能交联剂将甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸多肽固定在聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料表面，并进行X线光电子分光镜检测和表面接触角测定；体外培养骨髓基质细胞，接种至表面修饰的材料上，测定细胞粘附力，并和未修饰材料对比。结果 固定交联剂和多肽后X线光电子分光镜检测示硫元素的含量分别为0.3﹪和0.2﹪；硫元素的结合能是164eV和163.9eV；表面接触角为60.2±2.364度；细胞粘附力为(521.45±134.98)×10^-10牛顿。结论 甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸-脯氨酸-半胱氨酸能共价固定在聚丙交酯/乙交酯/天冬氨酸-聚乙二醇材料表面；多肽修饰后的材料能特异性的介导骨髓基质细胞粘附，增强其粘附力。

关键词：骨；组织工程；支架材料；表面修饰；多肽

The Surface Modification and the Cellular Adhesion Study of PLGA-[ASP-PEG]

Hao Jie¹ Zheng Qi-Xin^2* Guo Xiao-Dong² Wu Yong-Chao² Song Yu-Lin² Yang Da-Zhi²

（1.Department of Orthopaedic Surgery, The First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016；2.Department of Orthopedics, Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong Science and Technology University, Wuhan 430022）

Abstract: Objective To modify the surface of poly(lactic acid/glycolic acid/ asparagic acid-co-polyethylene glycol)(PLGA-[ASP-PEG]), using Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Cys(GRGDSPC) peptide, and then test the cellular adhesion. Methods Use the heterobifunctional reagent Sulfo-LC-SPDP(Sulfosuccinimidy l6-[3’-2-(pyridyldithio)-propionamido] hexanoate) to immobilize GRGDSPC peptide onto the surface of PLGA-[ASP-PEG], which was proved by XPS（X-ray photoelectron spectroscopy）. The contact angles were measured. Then marrow stromal cells (MSCs) were seeded onto the modified surfaces and the cell adhesive forces were measured. Compared the results with that of the PLGA-[ASP-PEG]. Results XPS analysis showed that sulfur element was 0.3% and 0.2% respectively, with sulfur’s binding energy of 164eV and 163.9 eV, indicating GRGDSPC was immobilized on the surface. The contact angle was 60.2 degree, and the cellular adhesive force was (521.45±134.98)×10^-10 Newton. Conclusion The GRGDSPC peptide was covalently immobilized on the surface of the PLGA-[ASP-PEG], which enhancing PLGA-[ASP-PEG]’s adhesive force to the MSC.

Key words: bone; tissue engineering; scaffold; surface modification; polypeptide

0 引言

理想的骨组织工程支架材料不仅要求具有良好的生物相容性、良好的生物降解性、三维立体多孔结构以及一定的力学强度，更要求具有优良的材料－细胞界面，有利于细胞的粘附、增殖，甚至激活细胞特异性基因表达。聚酯类（聚乳酸、聚乙醇酸以及两者的共聚物）可降解材料是目前骨组织工程研究中最常用的细胞支架材料，但是这类材料亲水性不够理想，细胞粘附性较差。我们通过本体开环共聚法合成了PLGA-[ASP-PEG] 三嵌段共聚物，在材料的表面引入了氨基基团^[1]；用固相肽合成技术合成含-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-（-RGD-）序列的GRGDSPC；然后利用异双官能交联剂Sulfo-LC-SPDP将多肽共价固定在PLGA-[ASP-PEG]表面^[2]，制成受体专门性材料，实现对骨组织工程最佳种子细胞---- MSCs的特异性结合，为人工智能材料的研制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1主要仪器和试剂

多功能电子能谱仪（XPS，XSAM800型）；2AP高温显微镜（西德莱茨公司）；倒置相差显微镜（Axiovert 35,Zeiss Corp,Germany）；显微操作器（MR5170,Eppendorf Corp,Germany）；摄像记录系统和时标发生器（VTG For A Corp,Japan）；负压控制、加载装置和图像处理器（Vidas 21,Kontron Corp,Germany）；吸管拉制器（P87 model,Sutter Instrument Corp, USA）；GRGDSPC（上海吉尔生化有限公司）；Sulfo-LC-SPDP（Pierce公司，USA）；低糖DMEM培养基（Gibco）。PLGA-[ASP-PEG]材料由我们和中山大学高分子研究所共同研究制备。

1.2 PLGA-[ASP-PEG]的表面多肽修饰

将PLGA-[ASP-PEG]材料制成约0.6cm大小，超声清洗，放在用2ml注射器制成的小容器内，加入10mg/ml的Sulfo-LC-SPDP磷酸盐缓冲液（PBS，PH：8.0）0.5ml，室温下不停振动，反应24h；PBS冲洗3次，加入1mg/ml的GRGDSPC多肽PBS溶液（PH：8.0）0.5ml，室温下不停振动，反应24h；PBS冲洗3次，自然干燥。每一步均用XPS检测。反应过程如下所示：

1.3 MSCs培养

自健康SD大白鼠骨髓中优化获取并培养MSCs^[3]，取第3代的细胞进行测定。

1.4 表面接触角测定

取多肽修饰的PLGA-[ASP-PEG]材料和PLGA-[ASP-PEG]材料膜片各6块，去离子水冲洗，常温干燥，用高温显微镜（放大14倍）于常温下进行膜表面的接触角测定，结果取平均值。

1.5 细胞粘附力测定

微吸管吸吮法 通过测量在脱吸附过程中细胞在材料表面上接触面积的变化以及细胞的变形性等力学参数测量单个细胞的粘附力。用吸管拉制器拉制微吸管，外径2mm，内径1mm，长100mm。用丙酮作为溶剂，按31.25mg/ml的浓度制备PLGA-[ASP-PEG]材料的聚合物溶液。制备以玻璃为底的特制圆形小腔室，直径约25mm。将聚合物溶液0.3ml滴入小腔室内，离心300转/分，在玻璃表面形成聚合物薄膜。按照1.2描述的方法用多肽修饰PLGA-[ASP-PEG]材料作为实验组，对照组不用多肽修饰。在小腔室内滴入浓度为1×10⁴/ml细胞悬液100µl，于孵育箱内孵育12h，用微吸管吸吮法测定系统测量细胞的粘附力。每组各6个材料，每个材料测量7个细胞，结果用均数±标准差表示。

1.6 数据处理

检测结果应用SPSS统计软件对数据进行统计学分析，采用t检验。

2 结果

2.1 XPS结果

PLGA-[ASP-PEG]、PLGA-[ASP-PEG]-SPDP和PLGA-[ASP-PEG]-SPDP-RGD的XPS结果如图2-8所示。PLGA-[ASP-PEG]材料表面N元素的结合能为399.9eV；PLGA-[ASP-PEG]-SPDP表面N元素的结合能为399.9eV，S元素的结合能为164.0eV；PLGA-[ASP-PEG]-SPDP-RGD表面S元素的结合能为163.9eV。表1是各材料表面的元素比例。

3 讨论

表面修饰法的最终目的是尽可能为细胞提供一种近似天然的细胞外基质，从而有利于其生长。生物材料表面修饰方法一般包括: 表面固定法，等离子体法，杂化改性法，化学改性法及离子注入法等。表面固定法主要是将一些活性物质固定在材料表面，充当临近细胞、基质或可溶性因子的配基或受体，使材料表面形成一个能与生物活体相适应的过渡层。该法包括固定蛋白质、固定多肽类物质、固定细胞生长因子、固定酶类等方法。

多肽固定的方法包括共价键和非共价作用。共价键的形成一般需要材料表面的反应部分和多肽的氨基酸侧链或氨基、羧基末端的参与，多利用不同的交联剂将材料的反应基团和多肽连接起来。经常选用的交联剂有：N-羟基琥珀酰亚胺基-3-（2-吡啶基二硫）-丙酸酯（SPDP）、二环己基碳二亚胺（DCC）、戊二醛以及碳二亚胺等^[2]。Sulfo-LC-SPDP是一种水溶性的SPDP，它含有两个反应基团：N－羟琥珀酰亚胺基团和2－吡啶基二硫化物基团。第一步，N－羟琥珀酰亚胺基团和伯氨基（－NH₂）反应生成稳定的酰胺键；第二步，2－吡啶基二硫化物基团和巯基（－SH）反应生成二硫键^[4]。反应于室温下分步进行，每一步反应后均将反应体系彻底冲洗干净，不会产生GRGDSPC肽自身的交联反应，没有其他副反应发生。

PLGA-[ASP-PEG]材料仅含有C、O、N和H元素，没有S元素，在PLGA-[ASP-PEG] 的XPS图谱中也没有发现硫元素，两者是一致的。第一步反应后，XPS发现材料表面出现S元素，分析其含量为0.3％，这是由于交联剂Sulfo-LC-SPDP分子中含有S元素。比较第一步反应前后XPS结果，我们还发现N元素的结合能均为399.9eV，没有发生明显的变化，这是由于反应前N元素与C元素结合，反应以后也是与C元素结合，其结合能没有改变；同时测得S元素的结合能为164.0 eV。第二步反应后，表面仍然有S元素，并且其含量为0.2％，比第一步反应后较小，是由于第二步反应中苯环脱落，由GRGDSPC取代，而GRGDSPC的分子量比苯环较大的缘故。测得S元素的结合能为163.9 eV，是因为反应以后S与苯环结合变为S与C结合，而S与苯环的结合能较大，所以反应以后S元素的结合能下降了0.1 eV。在整个XPS分析中我们没有注意H元素的含量变化，是由于H的原子量较小而忽略不计。通过XPS分析结合能以及S元素的含量变化，我们证明GRGDSPC肽共价固定到材料表面。

如上所述，固定多肽可以选择的交联剂很多。Sulfo-LC-SPDP本来是用于修饰蛋白、蛋白与蛋白交联、制造抗体与毒素的共聚物以及荧光标记抗体等。在本试验中，我们将其作用在理论上扩大化；之所以选择Sulfo-LC-SPDP，首先是由于其是水溶性的，反应条件简单，反应体系容易控制；再者，其N－羟琥珀酰亚胺基团只能和－NH₂反应生成稳定的酰胺键，不能和仲氨基（-NH-）、叔氨基（ ）反应，反应具有选择性；并且其2－吡啶基二硫化物基团只能和－SH反应生成二硫键，我们在设计多肽的同时既考虑到这一点，所以将半胱氨酸（C，其分子中含有－SH）放在了多肽GRGDSPC的末端，这样既保证了多肽在材料表面的固定；而且，参与反应的氨基酸距离活性中心较远，确保了－RGD－能充分的暴露在材料表面发挥其作用。

Yu G^[5]等用RGD肽修饰PLA-PEG共聚物，材料的表面接触角变小，提高了材料的亲水性，更好的促进了软骨细胞的附着和扩增。GRGDSPC肽是一种水溶性很强的物质，将其固定到材料表面后，我们测得材料的表面接触角为60.2±2.364度，比未固定多肽前减小，并且具有显著性意义（P<0.05）。

通过在GRGDSPC肽修饰后的PLGA-[ASP-PEG]材料表面培养MSCs，并测量其粘附力，为521.45±134.98×10^-10牛顿，细胞粘附力明显增加，与PLGA-[ASP-PEG]材料相比具有显著性意义（P<0.05）。RGD是细胞粘附蛋白的最小功能单位，是细胞外基质粘附蛋白的活性序列。目前，研究较多的RGD肽有RGD、GRGD、RGDS、GRGDS、GRGDSY、YIGSR、GRGDSPC等。RGD肽应用最早，它对多种细胞的粘附都有增强作用。以RGD为模板，在RGD的前端或后端加上不同的氨基酸，形成新的多肽，不断改良RGD性能。RGDS可促进成骨细胞的附着、分化，抑制凋亡^[6]；RGDS和GRGDS对MSCs有较高的粘附力，GRGDSPC在MSCs的粘附能力最强^[7]。

RGD肽能与细胞膜表面的受体——整合素（integrin）特异性结合。整合素是一种跨膜蛋白，包括16个α亚单位和8个β亚单位，每个亚单位包含3个节段：一个长的细胞外节段、跨膜节段和一个短的细胞内节段，每个整合素分子由一个α亚单位和一个β亚单位组成异二聚体。α和β链亚单位不同，它们结合的配体亦不尽相同，每一种整合素分子可有几种细胞外基质做配体，而每个细胞外基质中的配体也可能被不同的整合素识别；但是，整合素均识别含RGD的序列多肽。整合素与细胞内蛋白：踝蛋白（talin）、纽带蛋白（vinculin）、紧张蛋白（tensin）、吻蛋白（paxillin）以及肌动蛋白丝（actin filaments）连接，激活后可以调节跨膜信号以及胞浆内信号的传导^[8]。

综上所述，我们利用异双官能交联剂Sulfo-LC-SPDP成功的在PLGA-[ASP-PEG]三嵌段材料表面共价固定了GRGDSPC肽，多肽修饰后的材料表面亲水性和对MSCs的粘附性均优于未修饰材料。在试验中也发现了一些问题有带于进一步研究：GRGDSPC肽的最佳用量、多肽在材料表面的密度、MSCs粘附后细胞内信号的表达与调控以及如何有效的在三维多孔支架材料表面固定多肽。

参考文献

1. 郝杰，郑启新，郭晓东，等. 三嵌段高分子骨组织工程支架材料的制备及细胞粘附性研究[J]. 中国生物医学工程学报，2005，24（2）：129-133.

2. 杨大志，郝杰，郑启新. 多肽对生物材料表面修饰的研究现状[J].国外医学生物医学工程分册,2004，27（2）：65-68.

3. 王运涛，郑启新，郭晓东，等. 大鼠骨髓间充质干细胞的优化获取及生物学鉴定[J]. 华中科技大学学报（医学版），2003，32（5）：526-529.

4. 潘海涛，郑启新，郭晓东.特种肽支架材料对骨髓基质干细胞粘附、增殖及成骨分化的影响.中华医学杂志，2006,86(39):2766-2770.

5. Yu G, Ji J, Zhu H, Shen J. Poly(D,L-lactic acid)-block-(ligand-tethered poly(ethylene glycol)) copolymers as surface additives for promoting chondrocyte attachment and growth.. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 2006,76(1):64-75.

6. Secchi AG, Grigoriou V, Shapiro IM,etal. RGDS peptides immobilized on titanium alloy stimulate bone cell attachment, differentiation and confer resistance to apoptosis. J Biomed Mater Res A, 2007,83(3):557-584.

7. Syed S Lateef, Samuel Boateng, Thomas J Hartman, et al. GRGDSP peptide-bound silicone membranes withstand mechanical flexing in vitro and display enhanced fibroblast adhesion[J]. Biomaterials, 2002,23:3159-3168.

8. Richard G, Athanasiou. Extracellular matrix cell adhesion peptides: functional applications in orthopedic materials[J]. Tissue engineering, 2000, 6:85-103.