抗结核药物超敏反应实验室诊断方法研究进展及期望

见中国防痨杂志2015年第9期

世界过敏组织（The World Allergy Organization,WAO）2003将药物过敏定义为“免疫介导的药物高敏反应”，又称超敏反应。

药物超敏反应占药品不良反应（adverse drug reactions, ADR）的3.4%～17.8%^[1]。抗结核药物超敏反应（过敏反应）的诊断仍然是结核病临床和实验室工作者的难题，其金标准仍然是药物激发试验（drug provocation test，DPT）^[2]。但DPT的临床风险较大，有可能引起患者死亡^[3]。其他专科医生在遇上药物超敏反应时通常是停用所有可能的过敏原性药物，结核病的治疗通常采用多药联合方案，如果出现药物超敏反应时将此前所用药物全部停用，则可能因高效抗结核药物有限而给结核病的有效治疗带来极大困难。因此，寻求准确且安全的药物超敏反应体外实验检测方法，一直是结核病临床工作者和实验室工作者的努力方向。

对超敏反应及其分型的认识

要找到准确且安全的药物超敏反应体外实验检测方法，必须对超敏反应的发生机制有清楚的认识。药物超敏反应属于特异性免疫反应范畴^[4-5]，实质是异常的或病理性特异性免疫反应。超敏反应公认分为4型，亦有分为6型的意见。

Ⅰ型超敏反应由Ig E抗体介导，无补体参与。包括Ig E抗体产生、转移和结合到靶细胞上的致敏阶段，相同抗原再次进入机体与肥大细胞或嗜酸性粒细胞膜表面的Ig E发生特异性结合反应的发敏阶段。临床表现为过敏性休克、药物性皮炎中的荨麻疹和神经血管性水肿、消化道过敏、呼吸道过敏反应等。由于过敏性休克之外的Ⅰ型超敏反应不像过敏性休克那样反应快速且可持续存在，亦有学者将其称为Ⅰ型超敏反应性炎症或持续Ⅰ型超敏反应^[1]，抗组胺药对此类患者效果良好。近期McNeil等^[6]指出，肥大细胞是过敏反应中的主要效应细胞，通过分泌组胺在各种炎症反应和免疫调节物有关疾病中发挥重要作用。Mrgprb2（人类G蛋白偶联受体同源基因）是促使肥大细胞分泌的基础。Mrgprb2突变鼠不会出现促分泌作用导致的组胺释放、炎症反应和气道收缩。从而认定Mrgprb2是发现和治疗过敏反应的靶标。

Ⅱ型超敏反应又称细胞溶解型或细胞毒型超敏反应。参与的抗体主要为Ig G，少数为Ig M。这些抗体与靶细胞本身的表面抗原或膜表面吸附的半抗原结合，或抗原抗体复合物吸附于靶细胞表面后，可以通过3个不同的途径损伤靶细胞：（1）激活补体，引起靶细胞溶解；（2）单核吞噬细胞吞噬并裂解靶细胞；（3）通过杀伤性淋巴细胞(killer lymphocyte，简称为“K细胞”）的Fc受体与靶细胞表面的抗体Fc段特异性结合，激活K细胞继而破坏靶细胞。临床上主要表现为血液细胞的损伤和溶解破坏。有的学者将K细胞途径的超敏反应列入Ⅵ型超敏反应，又称抗体依赖性细胞毒性反应。某些抗细胞成分的抗体直接作用于细胞，刺激该细胞代谢功能增强，分泌功能亢进，但不破坏靶细胞，如过敏性甲状腺功能亢进；也有学者将该类型列入Ⅴ型超敏反应，又称为刺激型超敏反应。

Ⅲ型超敏反应又称免疫复合物型超敏反应。是在一定条件下，可溶性抗原抗体免疫复合物沉积于血管壁，激活补体，吸引中性粒细胞吞噬免疫复合物并释放溶酶体酶，引起血管炎，导致全身性或局部性炎症反应。临床表现为血清病、肾小球肾炎、类风湿性关节炎、内源性哮喘、过敏性肺泡炎、其他免疫复合物病（如过敏性肝损伤）等。

Ⅳ型超敏反应又称迟发性超敏反应。在某些抗原刺激下，T淋巴细胞被致敏，并大量增殖。当再次接触相同抗原时，致敏淋巴细胞大量增殖，直接杀伤特异性变应原或破坏带有变应原的细胞。临床主要表现为传染性变态反应、接触性皮炎（表现为局部红肿、硬结、水泡甚至剥脱性皮炎）、移植排斥反应。

从以上机制可以看出，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型超敏反应主要是以B淋巴细胞介导或B淋巴细胞联合辅助性T细胞（Th细胞）2型CD₄ T淋巴细胞介导的体液免疫反应，只有Ⅳ型超敏反应属于CD₄ T淋巴细胞和CD₈ T淋巴细胞介导的T淋巴细胞免疫反应范畴。有些变应原也可在同时或先后在同一个体引起不同类型的超敏反应。

在特异性免疫反应中存在免疫记忆细胞（长命淋巴细胞）和效应淋巴细胞（短命淋巴细胞）。免疫记忆细胞包括记忆性B淋巴细胞（memory B cell）和记忆性T淋巴细胞(memory T lymphocytes)；效应淋巴细胞包括浆细胞（plasma cell，PC）和效应T淋巴细胞。记忆T淋巴细胞中又分为中枢记忆T淋巴细胞（存在于淋巴器官中，以CD₄ T淋巴细胞为主）和外周记忆性T淋巴细胞（存在于外周组织和外周血液中，以CD₈ T淋巴细胞为主）^[7-10]。

再次接触抗原时，首先是刺激记忆性淋巴细胞，记忆性淋巴细胞发挥免疫调节作用，促使淋巴细胞的动员、外周淋巴细胞增殖并转化为效应淋巴细胞，发生对特异抗原的免疫反应。

抗结核药物超敏反应实验室诊断技术研究进展

探讨安全有效的药物超敏反应体外试验方法一直是结核病工作者的努力方向。药物超敏反应的实验室诊断技术研究不断进展，但至今未形成确定可在临床推广应用的方法。临床上仍然依赖药物激发试验。实验室研究进展概括为以下方面：

一、非特异性抗体检测

免疫球蛋白Ig E、Ig G、Ig M、Ig A和补体是体液免疫反应的重要组成部分，参与Ⅰ型超敏反应的抗体是Ig E；参与Ⅱ型超敏反应的抗体主要是Ig G，少部分是Ig M；参与Ⅲ型超敏反应的抗体可以是Ig G、Ig M或Ig A及免疫复合物，该型超敏反应肯定需要补体的参与。因此，抗体Ig E、Ig G、Ig M、Ig A和补体检测，特别是超敏反应发生前后的检测结果对比，有利于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型超敏反应的诊断和鉴别诊断^[4-5,11-13]。但大多数患者在发生超敏反应前并未进行Ig E、Ig G、Ig M、Ig A和补体的检测，一次性的检测结果虽然有一定的参考意义，但临床意义相对有限。

二、相关细胞因子检测

Porebski等^[14]认为细胞毒性分子颗粒酶B(granzyme B)、颗粒溶素（granulysin）、CD107a的检测，CD69细胞表面活化标志分子、淋巴因子[白细胞介素（IL）-2、IL-5、IL-13和γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）］的评估，有利于过敏反应的判断。根据免疫反应的一般原理，出现超敏反应前后的检测数据对比分析更有意义，特别是分离的淋巴细胞进行体外特异性药物刺激试验产生的细胞因子分析可能具有诊断意义。

三、特异性抗药抗体及补体检测

已发现人体内有很多种特异性抗药抗体的存在。抗药抗体可用于药物免疫测定、可作为毒素、药物、激素的特异性拮抗剂和药物研究的工具。并不是体内存在特异性抗药抗体者都会发生超敏反应^[15]，还需进行补体及相关免疫复合物检测^{[1,4-5,11-13]}，结合用药史和超敏反应的临床表现，特异性抗药抗体检测肯定有着重要的诊断参考价值。笔者^[13]于2001年提出，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型超敏反应的早期安全诊断，有待于特异性抗药抗体体外检测试剂的开发。但由于临床医生对抗体检测方法学缺乏认识，实验室人员又对这一领域未予重视，至今未见特异性抗结核药物抗体检测用于抗结核药物超敏反应诊断的研究报告。

四、药物刺激淋巴细胞（含B淋巴细胞和T淋巴细胞）增殖试验或称淋巴细胞刺激测试(drug-induced lymphocyte stimulation test，DLST)，或淋巴细胞转化试验(lymphocyte transformation test，LTT)

用药物刺激分离的外周血单个核细胞（主要为B淋巴细胞和T淋巴细胞），观察淋巴细胞增殖指数，是判断引起超敏反应的药物抗原体外安全检测的方法之一^[16-23]。

当前国内外关于药物刺激淋巴细胞增殖试验的文献报告的样本例数大多较少、缺乏多中心前瞻性研究，虽然报告的特异性较好，但敏感性较低，且使用放射性[³H]胸苷标记淋巴细胞存在放射物储存和处理隐患，不利于临床应用推广。还需要用非放射性的方法替代。一些文献中进行的药物刺激淋巴细胞增殖试验使用的是外周血分离的单个核细胞，却认为增殖的仅是T淋巴细胞，这是不准确的。其实，在特异性超敏抗原药物刺激下，不仅记忆性T淋巴细胞可调节T淋巴细胞增殖并转化为特异效应性T淋巴细胞，记忆性B淋巴细胞和Th2型T淋巴细胞也可调节B淋巴细胞增殖并转化为特异性效应B淋巴细胞（浆细胞）^[4-5,24-26]。

从前述超敏反应发生机制，药物刺激淋巴细胞增殖试验涵盖了由B细胞和T细胞介导的超敏反应，也就是适用于各型超敏反应的检测，应当是敏感度较高的。已有研究报告其敏感度较低，也可能与研究方法不完善有关。比如药物激发试验结果的判断，不能仅凭不良反应的再现就确定是超敏反应，还应结合其他的免疫学检测参数和中毒反应的相关检测结果除外药物中毒反应的可能性，这方面还需要进一步完善。另一方面，由于其适应性广，不能区别超敏反应类型则是其缺点，也还需要进行其他的免疫学检测方法对其进行补充。

五、特异性浆细胞检测

主要是检测药物引起的特异性体液免疫反应，分离外周血单个核细胞，加入药物刺激下培养，用标记浆细胞的方法检测特异性浆细胞。有学者用酶联免疫斑点技术(ELISPOT)检测抗原刺激时分泌抗体的浆细胞计数^[25],用流式细胞技术检测静息B细胞(CD27^－CD38^－)、记忆B细胞(CD27⁺CD38^－)、浆细胞前体(CD27⁺CD38⁺)和浆细胞(CD27^－CD38⁺)^[26]。这些技术同样可用于抗体免疫反应类型的过敏性药物抗原的检测和判断。

六、特异性T淋巴细胞检测

主要是检测药物引起的特异性T淋巴细胞免疫反应，分离外周血单个核细胞，加入药物刺激下培养，用标记T淋巴细胞的方法检测特异性淋巴细胞。

结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT. TB）已用于潜伏结核感染的诊断^[27]。其实T淋巴细胞释放IFN-γ不仅与结核分枝杆菌感染相关^[27-28]，也与其他感染性疾病及炎性疾病甚至肿瘤相关，已有采用ELISPOT方法检测葡萄球菌、疟疾、弓形虫、病毒等许多其他感染的相关研究报告^[29-35]。当将T-SPOT.TB中特异性刺激抗原——结核分枝杆菌早期分泌蛋白6(ESAT-6)及培养滤液蛋白-10(CFP10)更换为其他病原生物的特异性抗原或过敏的特异性药物抗原时，同样可能用于其他感染性疾病或药物过敏原的检测或诊断，应当可用于抗结核药物超敏反应的检测和诊断。

七、过敏相关基因检测

药物超敏反应与患者特异质有关，与患者基因型有关^[1,13]。 药物超敏反应综合征（DIHS）是一种以急性广泛的皮肤损害伴发热、淋巴结肿大、多脏器受累、嗜酸粒细胞增多及单核细胞增多等，血液学异常为特征的严重全身性药物反应。是由药物及病毒再激活引发的免疫过敏反应。近年来，免疫介导的重症药物不良反应的免疫病理学和药物基因学研究方面已取得重大进展，如T细胞介导的Stevens-Johnson综合征、表皮坏死松解性皮炎、药物过敏性肝损伤、其他药物过敏性综合征，研究显示与不同的人类组织相容性抗原也称白细胞抗原（HLA）I类和II类分子（包括HLA-B*15相关抗原）介导有关^[36]。人类G蛋白偶联受体MRGPRX2是与过敏反应相关的许多小分子药物的靶标^[6]。至今未见不同抗结核药物过敏相关基因片段和位点的相关研究报告，建议进行抗结核药物相关的基因学研究。

展望

综上所述，用于药物超敏反应的实验室检测方法是比较多的，包括非特异性抗体检测、相关细胞因子检测、特异性抗药抗体检测、淋巴细胞转化试验、特异性浆细胞检测、特异性T淋巴细胞检测、过敏相关基因检测等方法。当前存在的主要问题是：结核病学界对现代技术的融会贯通、引入应用还不够重视，需要整个结核病学界包括从事结核病学基础研究者、实验室应用研究者、临床结核病诊治研究者、结核病控制管理者共同努力。特别是特异性抗药抗体检测、特异性浆细胞检测、特异性的T淋巴细胞检测和抗结核药物过敏的基因研究值得我们深入探讨。我们应着手系统的、基础的及临床应用的多中心的研究。客观分析现状，找准研究方向，相信在不久的将来我们能找到抗结核药物超敏反应体外试验的最佳方法，形成新的安全的诊断抗结核药物超敏反应的金标准。