环孢素A治疗难治性免疫性复发性流产随机对照研究

原创2016-07-05付锦华中国实用妇科与产科杂志

本文刊登于《中国实用妇科与产科杂志》2016年5期441-445页

连续发生2次或2次以上的自然流产称复发性流产（recurrentspontaneous abortion， RSA）。据估计，RSA在育龄妇女中的患病率为1%。目前，RSA公认的病因有：父亲染色体异常（主要是相互易位或罗伯逊易位），传染病，内分泌因素如甲状腺缺陷、糖尿病和多囊卵巢，子宫异常，抗磷脂抗体综合征或其他自身免疫性疾病。其中，50%以上的RSA与免疫有关。妊娠时，子宫组织中的Th1细胞产生的白细胞介素2（IL-2）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）具有细胞毒作用，而Th2细胞产生的IL-2、IL-6和IL-10具有免疫抑制作用，正常情况下Th1/Th2系统处于平衡状态。当Th1/Th2系统失衡时，母体对胚胎同种异体移植物的排斥作用增强，进而导致RSA。从20世纪90年代至今，潍坊市人民医院对可查到免疫异常的RSA，应用泼尼松、肝素、阿司匹林、丈夫淋巴细胞免疫治疗、静脉注射免疫球蛋白制品（intravenous immunoglobulin，IVIG）进行治疗，成功率达85％，但仍有15％的患者治疗失败。治疗失败的这些患者，考虑其主要原因为应用现有的治疗方案，免疫抗体滴度不能降低到理想的状态，致使妊娠失败。

CsA能够显著抑制自身免疫反应，在器官移植后的患者中广泛应用，已经成为肾移植合并妊娠的一线治疗药物。其在母-胎免疫调节中可能起双重作用，既可抑制母体对胚胎抗原的免疫排斥，又可促进滋养细胞生长、运动及侵袭，从而可能成为治疗反复自然流产等妊娠疾病的有效药物。研究表明，在器官移植后妊娠的病人，为了预防免疫排斥反应，长期服用常规剂量的泼尼松和CsA，未发现因药物导致的对胎儿及新生儿的不良影响。

由于CsA对滋养层具有积极的作用，我们在获得患者同意的情况下，使用CsA对传统治疗（泼尼松、低分子肝素、阿司匹林、丈夫淋巴细胞免疫治疗、IVIG治疗）失败的患者进行治疗。报道如下。

1.1 病例资料 选择潍坊市人民医院产科2011年1月至2014年1月收治的难治性免疫性RSA（从未妊娠成功）的患者作为研究对象。所有妊娠事件的定义和诊断均依据中华医学会围产医学分会的标准。本研究通过了潍坊市人民医院医学伦理委员会的评估和审批，其中的临床研究根据我国法律和赫尔辛基宣言进行管理。

研究对象的纳入标准和条件：年龄＜39岁，流产次数≥4次，找到免疫性原因，即抗磷脂抗体（antiphospholipidantibody，APA）[抗心磷脂抗体（anticardiolipinantibody，ACA）、狼疮抗凝物（lupus?anticoagulant，LA）、抗磷脂/磷脂结合蛋白（β2-GP1）抗体）]、抗核抗体（antinuclear?antibodies，ANA）或甲状腺自身抗体[（抗胸腺细胞球蛋白（antithymocyte globulin，ATG）、抗甲状腺过氧化物酶抗体（anti-thyroid peroxidase antibody，ATPO）]中任何一种抗体阳性。传统治疗失败，未发现所有其他已知的RSA原因（染色体异常、子宫异常、传染病、内分泌因素、凝血功能障碍或血液高凝状态）。夫妻双方的染色体核型正常，男方的精液检查也正常，宫腔镜或子宫及双附件超声检查未发现任何子宫异常，血清激素[卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，FSH）、促黄体生成激素（luteinizing hormone，LH）、催乳素、雌二醇、雌酮、孕酮、Δ4雄二酮、脱氢异雄酮、睾酮、17α-OH孕酮]、胰岛素和糖耐量均在正常范围。优生四项（toxoplasma rubella cytomegalo herpes，TORCH）检测以及其他传染病的检查阴性。未发现抗凝血酶Ⅲ，促凝固蛋白C和S，凝血因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅻ和同型半胱氨酸的异常。此外，所有患者均无凝血因子Ⅴ基因Leiden点突变。另外，纳入患者最近一次流产（传统治疗）的胚胎组织中均未查出染色体核型异常，包括88例46/XX和80例46/XY。夫妻双方均无任何生育能力缺陷，均未经历过不孕治疗[如体外受精（in vitrofertilization，IVF）]。

1.2 方法 总计172例患者符合纳入标准，其中168例同意参与本研究并签署了知情同意书。告知所有患者本次治疗可能对母亲和胎儿带来的风险，如CsA可能的发育毒性。所有患者被计算机生成的随机数列随机分配到两组中，一组使用基本治疗（叶酸、黄体酮、IVIG、丈夫淋巴细胞免疫治疗）+CsA；另一组使用基本治疗+安慰剂。采用单盲的方法，患者不知道自己被分到了哪个组。患者只能被随机选择1次且不能重新进入本研究。CsA组中的85例患者，从月经结束起至月经来潮、抗体转阴或妊娠第10周止，服用CsA（新山地明）2～4 mg/kg，每日2次，并在服药第15天、第30天，查最低血CsA浓度，使药物剂量维持在80～150 mg/L。安慰剂组的83例患者，在与CsA组同样的时间段服用相同外观和剂量的淀粉药片，并在相同时间检测相关血液指标。所有患者均在研究开始3个月内妊娠。妊娠期间，两组患者均从妊娠第4～8周每周查β-人绒毛膜促性腺激素（β-HCG），并与45例正常育龄孕妇（设定为正常组）使用相同方法得出的检测值进行比较。本研究全程跟踪了所有患者的妊娠期，并且从妊娠3～15周，每3周进行1次经阴道超声检查观察胎心和胚胎发育状况或诊断流产（不包括生化妊娠）。所有新生儿均经过儿科医生检查，以排除先天性异常。根据超声检查得到的顶臀长度和妊娠囊尺寸计算流产的胎龄。主要结果为活产1名健康的没有先天性异常的婴儿。次要结果为：治疗的副反应、可能的妊娠并发症（子痫前期、早产、妊娠期糖尿病、妊娠期高血压疾病、出血和血栓形成）和新生儿体重。检测所有入组患者的免疫学指标，包括抗心磷脂抗体、狼疮抗凝物含量的比较、抗β2-GP1抗体、抗核抗体、抗甲状腺过氧化物酶抗体和抗胸腺细胞球蛋白抗体。

1.3 统计学分析 使用SPSS 17.0进行统计学分析。计量资料应用不成对资料的双尾学生t检验伴Bonferroni校正评估其统计学意义。应用Fisher确切概率法和χ2检验评估计数资料。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.1 患者的基本情况 两组患者在妊娠开始时年龄、流产次数、体重指数（BMI）和流产孕周方面差异无统计学意义（P＞0.05）。无患者中途退出研究。严格随访了所有患者的整个妊娠期，没有患者违反研究的规定。见表1。

2.2 主要及次要结果 CsA组85例中73例活产婴儿（85.88%），安慰剂组83例中57例妊娠成功（68.68%）,差异有统计学意义[P=0.01，OR=2.78，95% CI（1.29～5.97）]。CsA组每增加1名活产新生儿需要治疗的患者数量（thenumber of patients needed to treat，NNT）为5.81。CsA组妊娠期并发症发生率比安慰剂组低，差异有统计学意义。两组间流产时的孕周、新生儿体重、治疗副反应差异均无统计学意义。CsA组中2例出现皮疹，3例出现妊娠期高血压疾病；安慰剂组1例出现皮疹，10例出现妊娠期高血压疾病（见表2）。所有新生儿均未发现任何异常，且围产期发育正常。38例流产者中23例的胚胎组织可以查到染色体核型，其中染色体异常5例，2例在CsA组，3例在安慰剂组（在染色体正常的18例中，46/XX 10例、46/XY 8例）。

2.3 免疫抗体比较 妊娠结束时（活产或流产后次日清晨），患者升高最明显的免疫抗体（患者之间可能不相同）的含量，CsA组比安慰剂组低，差异有统计学意义。见表3。

2.4 β-HCG水平比较 妊娠4～8周，CsA组妊娠成功患者的β-HCG水平高于安慰剂组和正常组，差异有统计学意义（P＜0.01，见图1）。

治疗RSA的相关研究中，结果出现了不同程度的差异，原因有三：第一，所有研究都有问题自发拆分偏倚；第二，样本含量有限；第三，研究的纳入标准（特别是患者年龄和流产次数）不同，而流产风险随孕妇年龄和流产次数的增加而升高。最近的一篇Meta分析表明，所有对RSA的免疫治疗，只有丈夫淋巴细胞免疫治疗确实有效。进行一项检验某疗法对RSA治疗效果的理想试验，需要考虑到孕妇年龄和流产次数，应该使用随机区组设计，而不是完全随机设计。显然，这篇Meta分析中的所有研究均无这些特征。尽管本研究在纳入患者的年龄和流产次数方面纳入标准十分严格，但是由于样本量有限，依然在一定程度上表现出这种偏倚。

本研究只纳入年龄＜39岁且夫妻双方均无生育能力异常的患者，从而消除混杂因素。另外，患者都有RSA治疗失败的经历且流产胚胎染色体核型正常；所有这些标准都使我们更加接近Christiansen等提出的理想试验。由于多中心大样本量的试验必然会降低纳入标准和增加混杂因素，本研究适当减少了样本含量。本研究中妊娠并发症的发生率很低，可能的原因为：医生对患者的监管，患者妊娠期间安全的生活方式以及患者年龄相对较小。

本研究中，CsA治疗难治性免疫性RSA效果明显，妊娠成功率显著增加，流产率显著降低，难治性免疫性RSA患者增加1名活产新生儿的NNT为5.81，这与传统治疗方法的NNT差异很大。据报道，丈夫淋巴细胞免疫治疗和IVIG的NNT分别为10和6。可能是由于本研究样本量较小或纳入标准比其他研究更加严格，导致研究结果不能扩展到所有RSA患者身上。结果表明，除了轻微的局部皮疹（数天内就可消退）外，CsA治疗基本安全，没有重大的不良反应发生。并且，两组间新生儿体重和Apger评分差异无统计学意义，可以认为本研究中CsA未对新生儿产生不良影响。然而，本试验缺少对CsA在妊娠期潜在毒性的观察。动物实验表明，只有在血浓度为本次10 000倍的小鼠中出现了胚胎死亡和产仔率降低，在大鼠、斑马鱼中均未发现任何不良反应。临床研究中，地中海贫血、再生障碍性贫血和炎症性肠病（克罗恩病等）合并妊娠的患者，长期使用CsA治疗，并未发现对母亲和胎儿的严重不良反应。在联合CsA治疗难治性不明原因复发性流产的研究中，也未发现任何异常。综上所述，在妊娠期使用CsA安全。但是，应该谨慎地对难治性免疫性RSA保留使用。

免疫性RSA患者，由于免疫抗体的作用，容易形成广泛胎盘栓塞，导致部分患者出现妊娠期高血压疾病。Piao等发现，在蜕膜基质细胞(decidualstromal cells, DSCs)和蜕膜免疫细胞(decidualimmune cells, DICs)的帮助下，CsA通过增加滋养层中Th2型细胞因子，诱导母胎界面Th2型免疫偏倚形成，同时抑制滋养层细胞中DICs和TNF-α等Th1型细胞因子的产生，从而抑制妊娠时免疫反应的发生。本研究也表明，CsA可以有效降低免疫抗体滴度，减少血栓形成，降低妊娠期高血压疾病的发生率。

在早孕期，有效剂量范围内的CsA能够促进滋养细胞生长，改变细胞形态，增加侵袭力。本研究中，妊娠4～8周，CsA组妊娠成功患者的β-HCG水平高于安慰剂组和正常组，与以上研究相符，说明CsA对滋养层细胞生长和代谢具有积极作用。

本研究为攻克难治性免疫性RSA提供了一条可能的道路，但是远没有证明CsA对所有免疫性RSA患者的治疗作用和安全性，且没有足够数量的接受CsA治疗的孕妇来排除任何可能的致畸作用，所以对CsA的使用仍应十分谨慎。目前，关于CsA对人类生殖功能影响的研究甚少，CsA对人类滋养细胞代谢和生长的作用机制及其与免疫系统相互作用的机制还有待研究阐明。