阵发性睡眠性血红蛋白尿症诊断的新方法——Flaer分析法

阵发性睡眠性血红蛋白尿症（paroxysmalnocturnalhemoglobinuria,PNH）是一种或几种造血干细胞X染色体上PIG-A基因突变使GPI锚链蛋白合成受阻，引发细胞膜上锚链的一组膜蛋白丢失，补体活化异常所致的造血功能衰竭症。Flaer检测法提高了诊断的敏感性，为PNH的早发现、早治疗打下了良好的基础。

流式细胞术是诊断PNH的金标准，并可以对PNH血细胞进行定量分析。随着研究的不断深入，人们已经注意到了传统的流式细胞术对于PNH克隆检测的局限性。CD55、CD59等一些补体调节蛋白的表达还会受到其它因素的影响，如MDS、细胞发育不全或炎症反应等均有可能导致膜蛋白的缺失[1]。在这种情况下人们找到了FLAER分析法来补其不足。FLAER试剂是一种嗜水气单胞菌毒素的变体，从患暴发性传染病的鲫鱼中分离出嗜水气单胞菌株，该菌株培养的上清液中可分离到嗜水气单胞菌毒素，对其进行灭活等处理得到FLAER试剂。FLAER分析法对诊断的敏感性和特异性都有所增加。有文献报道[2]FLAER对PNH克隆检出的敏感性为0.1%，其它靶向标记检出率的敏感性为1%；FLAER可以特异地与细胞膜上的GPI锚蛋白结合，可直接反应锚蛋白的缺失情况，而PNH本身就是由于GPI锚蛋白合成异常所致的疾病，其它靶向标记只是单纯与锚链的抗原特异性结合，且这些抗原的表达不稳定，还会受到其它因素的影响，因此FLAER诊断的特异性与其它靶向标记相比较而言有所提高。由于红细胞表面某些糖蛋白的存在使FLAER不能很好的与锚蛋白结合，FLAER分析法一般只用于粒细胞和单核细胞的检测，且不受溶血与输血的影响[1]。有文献报道[3]了536例疑似PNH患者FLAER分析法与传统流式分析法对比结果，发现FLAER分析法63例患者检测到了PNH克隆，检出率11.8%，并且克隆数都较大，不受溶血和输血的影响；而传统分析法只有33例患者被检测出有PNH克隆，检出率6.2%，检测出的克隆数都较小，很容易受到溶血和输血的影响。

Battiwalla[2]等的对PNH患者多参数流式细胞术诊断进行了对比研究，靶向标记分别为：粒细胞FLAER、CD55、CD16，单核细胞FLAER、CD55、CD14，每个细胞系的靶向标记分别两两组合，研究的结果显示FLAER+CD55对粒系及单核系的PNH克隆的检出率最高。此文献还分析了单独应用CD16、CD14对粒系、单核系PNH克隆的检出率≥1%，单独应用FLAER粒系、单核系PNH克隆的检出率≥0.1%。考虑到FLAER技术对PNH诊断的敏感性和特异性都有所增加，因此对于PNH小克隆的监测已不再是问题。综合近年来多篇文献，对多参数流式诊断监测PNH小克隆意义总结如下：①PNH患者移植后微小残留病灶及嵌合状态的监测。移植有效PNH克隆会逐渐减小，移植无效或移植后复发PNH克隆会变化不明显或克隆增大。移植后嵌合状态好，FLAER与其它靶向标记会同向运动，既二者同时减小。反之，二者反向运动，既相互矛盾。移植有效使GPI锚蛋白正常表达，单纯FLAER分析法检测不到锚蛋白的缺失。CD55、CD16、CD14等锚链蛋白受到炎症、嵌合状态等因素的影响而表达缺失，并不是锚蛋白异常引起的其表达缺失。因此，单独FLAER分析法更能反映PNH患者移植后PNH克隆动态变化情况，二者结合分析更能反映机体的嵌合状态。②反应免疫抑制治疗效果。AA或MDS患者接受免疫抑制治疗骨髓状况改善后PNH克隆会逐渐减小。AA-PNH综合征患者接受强化免疫抑制治疗后，骨髓处于抑制期时，PNH克隆有可能会因获得生存优势而增大。PNH红细胞克隆的监测，国际上首推CD59，但Höchsmann[4]等对CD58、CD59对网织红细胞和成熟红细胞PNH克隆检测的对比研究显示，前者的敏感性高于后者，检出的PNH克隆前者大于后者。

对哪些患者要进行PNH的筛查呢？PNH诊断指南[5]建议对Coombs试验阴性或伴铁缺乏的溶血性贫血、血红蛋白尿、再生障碍性贫血、难治性贫血、不明原因血栓形成或少见部位血栓形成、血栓与溶血共存、不明原因血细胞减少尤其是年轻患者都要进行PNH筛查。有文献报道大约26%的PNH患者由于血红蛋白尿而被诊断[6]。日本的一项研究表明大约有45%的PNH患者有AA或MDS病史[7]。70%的AA患者可以检测出PNH克隆，细胞数通常小于10%，偶尔也可见到大克隆，经研究证实这部分患者确实存在PIG-A基因突变。由MDS转变为PNH的患者有以下特点：难治性贫血、骨髓增生低下、HLA-DR阳性、遗传学正常、中重度血小板减少、对免疫抑制治疗效果好。对免疫治疗敏感的患者可能存在误诊的可能性，是AA而非MDS，事实上AA转变为PNH较常见，而MDS转变为PNH很少见[8]。MDS患者也可检测到锚链蛋白的缺失，是否存在PIG-A基因突变仍有待进一步研究[8]。

参考文献

[1]．RobertA,BrodskyMD.AdvancesintheDiagnosisandTherapyofParoxysmalNocturnalHemoglobinuria.Blood,2008,22:65–74.

[2].Battiwalla1M,HepgurM,PanD,etal.MultiparameterFlowCytometryfortheDiagnosisand

MonitoringofSmallGPI-deficientCellularPopulations.CytometryBClinCytom,2010,78:348–356.

[3]．SutherlandDR,KuekN,Azcona-OliveraJ,etal.UseofaFLAER-BasedWBCAssayinthePrimaryScreeningofPNHClones.AmJClinPathol,2009,132,564-572.

[4].HöchsmannB,SchrezenmeierH.Paroxysmalnocturnalhemoglobinuria(PNH):highersensitivityandvalidityindiagnosisandserialmonitoringbyflowcytometricanalysisofreticulocytes.AnnHematol,2011,90:887–899.

[5].BorowitzMJ,CraigFE,DiGiuseppeJA,etal.GuidelinesfortheDiagnosisandMonitoringofParoxysmalNocturnalHemoglobinuriaandRelatedDisordersbyFlowCytometry.ClinicalCytometrySociety,2010,78B:211–230.

[6].ParkerC,OmineM,RichardsS,etal.Diagnosisandmanagementofparoxysmalnocturnalhemoglobinuria.Blood,2005,106:3699-3709.

[7].KanakuraY,OhyashikiK,ShichishimaT,etal.SafetyandefficacyoftheterminalcomplementinhibitoreculizumabinJapanesepatientswithparoxysmalnocturnalhemoglobinuria:theAEGISClinicalTrial.IntJHematol,2011,93:36–46.

[8].BrodskyRA.HowItreatparoxysmalnocturnalhemoglobinuria.Blood,2009,113:6522-6527.