低氧环境下GDF-5诱导人骨髓间充质干细胞“自组装”成工程化软骨的研究

低氧环境下GDF-5诱导人骨髓间充质干细胞

“自组装”成工程化软骨的研究

张波 杨述华 张宇坤D 夏天 杨操 许伟华 叶树楠

【摘要】目的 探索低氧环境下生长分化因子-5（GDF-5）诱导人骨髓间充质干细胞（hMSCs）“自组装”形成工程化软骨的可行性和有效性。方法 分离培养hMSCs，流式细胞学方法鉴定。将hMSCs用含100ng/ml GDF-5软骨诱导液（conditioned medium ，CdM）分别在低氧 (1% O₂)和正常氧(20% O₂)环境下诱导培养3周， RT-PCR检测Ⅱ型胶原蛋白和Aggrecan表达情况。将低氧环境下GDF-5诱导3周的hMSCs消化后，按一定密度接种于2%琼脂糖包被的24孔板, CdM继续诱导3周，采用免疫组织化学方法检测组织Ⅱ胶原表达情况，阿利新蓝染色和甲苯胺蓝染色，检测软骨特异成分的表达。结果 hMSCs呈梭形漩涡状生长，高表达CD44、CD29 ，不表达CD45分子。含生子分化因子5(GDF-5)的CdM诱导3周后， RT-PCR检测Ⅱ型胶原和Aggrecan表达阳性，且低氧组较正常氧组Ⅱ型胶原和Aggrecan表达量均明显增加（P＜0.05）。低氧环境下GDF-5诱导人骨髓间充质干细胞可“自组装”形成一定形状大小类软骨样组织，HE染色可见软骨陷窝样结构，免疫组化检测Ⅱ型胶原表达阳性。阿利新蓝染色和甲苯胺蓝染色可见特异性基质成分异染。结论 低氧促进hMSCs向软骨分化，低氧环境下GDF-5诱导软骨分化的hMSCs可在体外通过“自组装“技术成功构建组织工程软骨。

【关键词】 低氧；干细胞；生长分化因子-5；软骨；自组装

Experiment study on Self-Assembly Cartilage Tissue Engineering with Chondrogenically Differentiated Human Mesenchymal stem cells induced by growth differentiation factor 5 in hypoxia

ZHANG Bo, YANG Shu-hua,ZHANG Yu-kun, et al. Department of Orthopedics Affiliated to Union Hospital, Tongji Medical College of Huazhong Science and Technology University, Wuhan 430022, China

【Abstract】Objective To explore the feasibility and effectiveness of the self-assembly cartilage tissue engineering with chondrogenically differentiated human bone mesenchymal stem cells（hMSCs） induced by growth differentiation factor 5 in hypoxia. Methods hMSCs were isolated from ilium and purified by density gradient. Flow cytometry was performed to detect the cell surface markers of the hMSCs of the fourth. hMSCs were exposed to cartilage inducing medium containing 100ng/ml GDF-5， respectively, in a hypoxic environment (2% oxygen) and normoxic (20% oxygen)conditions. RT-PCR was performed to detect the expressions of type II collagen and aggrecan in the cells at the time points of 3 weeks. In the hypoxic environment, conditioned medium (CdM) containing the GDF-5 induced hMSCs 3 weeks, and then digested hMSCs ,according to a certain density of inoculated on 2% agarose-coated 24-well plates, CdM to continue to induce 3 weeks. The examples were detected with histology and collagen typeⅡimmunohistochemistry. Alcian blue staining and toluidine blue staining to detect the expression of cartilage-specific components. Result hMSCs growth of spindle-shaped whirlpool with high expression of CD44 and CD29 and negative expression of CD45.In MSCs exposed to CdM containing the GDF-5, in a hypoxic environment, the expression of collagen II and Aggrecan was significantly greater than that observed when cells were exposed to the chondrogenic growth factors under normoxic conditions（P>0.05）. hMSCs in the hypoxic environment through the GDF-5 induced by 3 weeks after the inoculated agar surface, and continue to induce three weeks with CdM can be "self-assembled" to form cartilage-like tissue with proper shape and size, Hematoxylin-eosin staining appeared cartilage lacuna. Immunohistochemical detection of positive expression of collagen type Ⅱ. Alcian blue staining and toluidine blue staining showed specific metachromatic matrix components. Conclusion Hypoxia promote the differentiation of hMSCs into chondrocytes, Chondrogenically differentiated human mesenchymal stem cells induced by GDF-5 in hypoxia can be in vitro through "self-assembly" technology to build a successful tissue-engineered cartilage.

【key words】 hypoxia，stem cells，GDF-5，Cartilage，Self-Assembly

关节软骨缺损临床上十分常见，由于软骨组织自我修复能力有限，其再生和修复一直是骨科界亟待解决的难题之一。近年来,以干细胞为种子细胞体外构建具有一定形状和生物学功能的组织工程化软骨用于临床治疗逐渐成为软骨缺损修复的研究热点。目前最常用的方法就是将细胞种植在生物相容和生物降解的支架材料上再生软骨，而细胞-材料复合物构建的组织工程软骨由于诸多的缺点而限制着它的继续发展和应用^[1]。本实验分离并诱导人骨髓间充质干细胞（hMSCs）成软骨分化，采用低氧环境优化诱导条件，结合 “自组装”（Self Assembly）技术，探讨在体外构建无支架的组织工程软骨的可行性和有效性。

材料与方法

1.1试剂 DMEM-L、胎牛血清、购置于GIBCO公司；重组人生长分化因子5( GDF-5)购置于peprotech公司； ITS⁺、L-脯氨酸、丙酮酸钠、阿利辛蓝、甲苯胺蓝等购置于Sigma公司；FITC anti-human CD44、PE anti-human CD29、FITC anti-human CD45购置于Biolegend公司，兔抗人Ⅱ型胶原抗体（Santa Cruz）；TRIzol Reagent（Invitrogen）、ReverTra Dash（TOYOBO）、2×Taq PCR MasterMix（TIANGEN），GoldView；、SABC，DAB显色试剂盒；人淋巴细胞分离液、琼脂糖；三气培养箱（德国BINDER）。

1.2 方法

1.2.1 hMSCs的分离、扩增及鉴定 骨髓取自本科室因创伤需要行髂骨移植的成人患者,共4例，平均年龄35岁，经检查无重大疾病。经过患者同意后，在手术过程中，采用肝素处理注射器无菌条件下抽取骨髓5 mL，立即加入盛有抗凝培养液5ml的离心管,迅速轻轻吹打制成细胞悬液。然后将悬液沿管壁轻轻加入到预置等体积淋巴细胞分离液的离心管中,2000 r/min离心20 min,收集云雾状白膜层的单个核细胞于另一离心管中, DMEM洗涤两次(1000 r/min, 5 min),弃上清液,用含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的DMEM-L完全培养基重悬细胞,调整细胞密度，以1×10⁶/ml细胞密度接种于培养瓶中,置于37 ℃、5% CO₂恒温培养箱中，并标记为原代(Passage 0,P0)。以后每隔3 d换液,换液后于倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态特征。待细胞接近融合时用0.25%胰蛋白酶消化,以1∶3比例传代。取P4 MSCc，0.25%胰蛋白酶消化悬浮细胞，PBS洗涤3次，加入相关抗体( CD44、CD45、CD29) ,4 ℃ 孵育避光作用30 min ,再用PBS洗涤1次后将细胞悬于 PBS中，采用流式细胞仪检检测表面抗原表达。

1.2.2 低氧环境下hMSCs向软骨细胞诱导 取生长良好的P4代细胞，以2×10⁴cells/孔均匀接种于6孔板内，加入含10%胎牛血清的DMEM-L完全培养基，置于37 ℃、5% CO₂常氧恒温培养箱中培养12h。然后更换为含100ng/ml GDF-5的软骨诱导液（conditioned medium ，CdM），实验分两组，其中A组置于1% O₂的三气培养箱内（5% CO₂，其余用N₂填充），B组继续置于37 ℃、5% CO₂常氧恒温培养箱中培养，以后每隔3天更换含100ng/ml GDF-5的CdM，连续诱导3周。CdM成分为含10^-7M地塞米松、1％FBS、1%ITS⁺、40mg/ml L-脯氨酸、50mg/mlVitC和100mg/ml丙酮酸钠的DMEM高糖溶液。

1.2.3 RT-PCR检测诱导后细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan表达 A、B两组细胞分别诱导3周后，按Trizol说明书提取总RNA，进行RT-PCR。Collagen II引物序列：上游TTCAGCTATGGAGATGACAATC，下游AGAGTCCTAGAGTGACTGAG，扩增片段长度为472 bp；Aggrecan引物序列：上游TGACCACTTTACTCTGGGTTTTCG，下游ACACGATGCCTTTCACCACG，扩增片段长度为462 bp；GAPDH引物序列：上游引物ACCACAGTCCATGCCATCAC，下游：TCCACCACCCTGTTGCTGTA，扩增片段长度为450 bp。

RT和PCR步骤按常规进行。反应条件为：94℃预变性3min；然后执行40个循环：94℃变性30 s，退火30 s，Collagen II为56℃，Aggrecan为52℃；72℃延伸1min；最后总延伸72℃5 min。反应结束后取PCR扩增产物5μl，在含有Goldview的2%琼脂糖凝胶中电泳分离，将电泳凝胶置于BioSpectrum®AC凝胶成像系统照相。

1.2.4 hMSCs软骨诱导“自组装”形成工程化软骨 配置2%琼脂糖50ml，高压灭菌，待温度降至60℃左右时，采用无菌20ml注射器抽吸琼脂糖溶液，推注到24孔培养板孔内，每孔1ml,轻轻转动培养板，小心包被培养板孔的侧壁，然后用吸管将培养板内的琼脂糖吸弃。取生长良好的P4代细胞,按1×10⁶/ml接种于75T的培养瓶内培养12h。待细胞贴壁后，采用含100ng/ml GDF-5的CdM换液，置于低氧环境下诱导培养，以后每隔3天更换含GDF-5的CdM，于诱导第21天，用含0.25%胰酶+0.02%EDTA消化15min，200g离心5min后用CdM液重新悬浮细胞，分别以1×10⁴、2×10⁴、1×10⁵ 、1×10⁷孔接种至上述包被24孔板内，每组设置3个复孔。每隔3天更换CdM，继续诱导3周。取出“自组装”形成的组织，分析天平称量湿重，游标卡尺测量直径。

1.2.5 工程化软骨组织鉴定 将“自组装”形成的组织用PBS洗涤3次后置于体积分数4%的中性甲醛中固定12h，脱水、石蜡包埋后切片,分别进行：①常规HE染色。②Ⅱ型胶原免疫组化染色: 石蜡切片常规脱蜡、水化,抗原微波修复10 min,自然冷却后蒸馏水洗2min×2次,3%的H₂O₂室温灭活10min,PBS冲洗3min，3次。应用SABC免疫组织化学染色试剂盒,以兔抗人Ⅱ型胶原多克隆抗体，作为一抗检测组织中Ⅱ型胶原的表达,按照试剂盒说明染色，DAB试剂盒显色。阳性反应呈棕黄色。以PBS代替一抗作阴性对照染色。③甲苯氨蓝染色:切片脱蜡至水, 1%甲苯胺蓝液染色15min, 蒸馏水洗涤，体积分数95%的酒精急速分化,水洗后以梯度乙醇逐级脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。④阿辛蓝染色：蜡切片脱蜡至水；滴加1%阿利辛蓝液染色30min，蒸馏水洗，体积分数95%的酒精急速分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明中性树胶封固。

2．结果

2.1. hMSCs的分离、扩增及鉴定 倒置显微镜下观察，接种后24h观察可见少部分细胞贴壁，第2～3d 有细胞团形成，细胞呈纺锤状或多角突起状。随着培养时间延长, 第7d细胞团明显增多，贴壁细胞开始分裂增生,成平行排列生长或旋涡状生长。2周可达90%融合，并出现明显漩涡状排列.应用流式细胞仪对hMSCs表面分子进行分析，结果显示：CD29、 CD44为阳性，CD45为阴性（图1）。连续传代后hMSCs表面分子表达无明显改变。

图1a P4 hMSC形态（×100）；图1b 流式细胞检测Gate图；图1c CD29阳性细胞占hMSCs总细胞数的87.16%；图1d CD44阳性细胞占hMSCs总细胞数的87.26%；图1e CD29阳性细胞占hMSCs总细胞数的0.45%

Fig.1a Characterization of Passage4 hMSC colonies（×100）. Fig.1b Flow cytometry gate map. Fig.1c CD29-positive cells accounted for hMSCs total cell number 87.16%, Fig.1d CD44-positive cells accounted for hMSCs total cell number 87.26%, Fig.1e CD29-positive cells in hMSCs accounted for 0.45% of total cell number

2.2 低氧环境下hMSCs向软骨细胞诱导形态变化 A、B两组细胞在诱导5 d后细胞形态变化不大,仍保留hMSCs典型的梭形， A组较B组增殖明显。诱导10天后细胞形态逐渐由长梭形向多边形、多角形转化，A组细胞体积较B组小，呈现均一增长(图2a)，B组细胞体积大，聚聚成团块(图2b)。继续诱导，A,B组细胞均增大逐渐变得宽大扁平，此时细胞胞浆丰富,并分泌大量基质。

2.3 RT-PCR检测诱导后细胞Ⅱ型胶原和Aggrecan表达 hMSCs用含GDF-5的CdM导3周后，A,B两组均可检测到II型胶原和Aggrecan在mRNA水平的表达。A组II型胶原相对表达量较B组明显增加，其差异具有统计学意义（P＜0.05）(图3a)。A组Aggrecan mRNA的相对含量较B组增加，其差异具有统计学意义（P＜0.05）(图3b)。

图2a 低氧环境下hMSC诱导10天（×100） 图2b 正常氧环境下hMSC诱导10天（×100）

Figure 2a. hMSC induced by hypoxia environment for 10 days (× 100 ); Figure 2b. hMSC induced in normal oxygen environment for 10 days (× 100)

图3a 低氧组II型胶原表达较正常氧组显著增加 图3b 低氧组Aggrecan表达较正常组显著增加

Fig.3a Expression of collagen type II in hypoxic group compared with the normal oxygen group significantly increased. Fig.3b Expression of Aggrecan in hypoxia group significantly increased compared with the normal group .

2.4 hMSCs 软骨诱导“自组装”形成工程化软骨形态 细胞接种后逐渐聚集，4-6h后可形成肉眼可见的类圆形白色细胞组织团块，呈聚集状生长（图4）。随着接种密度增加，形成的组织团块直径和湿重增加（表1），镊子夹取组织，组织富有弹性和一定韧性，表面光滑。

2.5 工程化软骨组织鉴定 组织固定包埋切片后用HE染色，镜下见细胞排列密

集,细胞周围出现类似软骨陷窝样的空隙(图5a)。Ⅱ型胶原免疫组化染色显示，细胞内可见Ⅱ型胶原蛋白的表达,阳性信号主要位于细胞浆内,细胞和细胞之间的间充质内也有表达(图5b)；阿利辛蓝染色和甲苯胺蓝染色是软骨细胞的特异性染色方法，阿利辛蓝使得软骨细胞基质呈蓝色,组织切片染色可见天蓝色的物质弥漫分布(图5c)，甲苯胺蓝染色将软骨细胞基质染呈蓝紫色,细胞核呈深蓝色(图5d)

图4“自组装”形成工程化软骨形态

Fig.4 the general concept of "self-assembly" engineered cartilage

表1 不同接种密度形成工程化软骨直径和湿重 （n=6, ）

Tab.1 The diameter and wet weight of Engineered cartilage according to different inoculation density

密度(cell/孔)	直径平均值（mm）	湿重平均值（mg）
1×104	0.33±0.04	40.6±4.22
2×104	0.41±0.02	80.5±6.74
1×105	0.83±0.03	119．5±2.8
1×107	3.5±0.27	576±40.1

图5a HE染色 （×400） 图5b Ⅱ型胶原免疫组化染色（×400） 图5c 阿利辛蓝染色（×400）

图5d 甲苯胺蓝染色（×400）

Fig.5a HE staining (× 400) Fig.5b Ⅱ collagen immunohistochemical staining (× 400) Fig.5c Alcian blue stain (× 400) Fig.5d toluidine blue stain(× 400)

3.讨论

组织工程首要的问题就是选择一种有效的种子细胞。早期组织工程研究多用自体软骨细胞作为种子细胞。自体软骨细胞是终末分化细胞，其获取困难，体外增殖能力差，容易反分化，且软骨细胞移植后移植物与软骨下骨间的愈合不良常导致使移植物脱落或退变^[2]。hMSCs具有多向分化潜能和强大扩增能力，取材创伤小，临床并发症轻微，体外扩增简便，扩增时细胞的性状和分化特性不会改变和丧失，在特定的成软骨诱导培养条件下, hMSCs在体内外均可分化为软骨细胞，使其成为软骨组织工程理想的种子细胞。本实验选用hMSCs作为软骨组织工程的种子细胞,并成功的对hMSCs进行分离、扩增及鉴定。

自体MSC软骨分化后的组织工程软骨远期效果并不理想，如何优化诱导培养方式是当前软骨组织工程亟待解决的一大挑战。关节软骨细胞的生长环境为低氧环境，不同区带关节软骨组织氧分压不同,软骨表层氧分压为6%,深层<1%^[3]。在机体发育及骨折愈合时,骨髓间充质干细胞在低氧环境分化为软骨细胞,形成软骨基质,随后软骨细胞增殖、肥大、凋亡、骨基质替代软骨基质。这些现象提示我们低氧也许更能促进骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化。Risbud等^[4]研究发现,在20%和2%氧浓度下诱导大鼠骨髓间充质干细胞向髓核分化,低氧更利于间充质干细胞向软骨细胞细胞分化。本研究在早期实验结论基础上，分别在低氧与正常氧环境下，采用GDF-5诱导hMSCs向软骨细胞分化。研究发现低氧环境下，软骨特异性基质II型胶原和Aggrecan表达量较正常氧培养下明显增加，验证了低氧促进hMSCs向软骨细胞分化，实验结果与Risbud等一致，为组织工程软骨构建优化了诱导条件。低氧促进软骨分化，可能机制是低氧环境下，MSCs分泌的低氧诱导因子-α（HIF-α）增多，HIF-α可以通过AKT途径激活SOX9转录而增强MSC的软骨特异性基因表达^[5]。低氧促进软骨分化调控机制尚有待进一步深入研究。

体外诱导MSCs向软骨分化最常用方法就是改变细胞生长的条件。前期的研究证实了浓度为100ng/ml GDF-5能最有效诱导MSCs向软骨细胞分化，并具有分泌软骨细胞特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖基质的功能^[6]。本研究检测GDF-5诱导hMSC后“自组装”所形成的组织，通过形态学，组织学，甲苯胺蓝，阿利辛蓝等特异性染色进一步证实了，GDF-5能有效诱导hMSC向软骨方向分化。GDF-5是近年发现的一种生长因子，属骨形态发生蛋白（BMP）家族成员，也是转化生长因子-β（TGF-β）超家族一员 ，主要通过影响生长板软骨细胞肥大时期的持续时间来调节内生软骨的骨生长速度^[7]，在肢体骨骼发育和关节形成中有着很重要的作用。同时在长骨发育过程，GDF-5可以通过Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯来增强细胞间信号的传导和协调^[8]，从而促进间充质细胞聚集同时向软骨方向分化，促进软骨细胞合成代谢，增加软骨细胞合成特异性ECM氨基葡聚糖，维持软骨表型和自稳状态^[9].刘振宁等^[10]研究发现,一定浓度的GDF-5诱导还能诱导的兔脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化，表达Ⅱ型胶原和蛋白多糖表达明显增加。关于GDF-5在骨骼发育和软骨分化的机制还有待进一步研究。

软骨组织工程更为关注的是要培养出与正常生物化学和生物力学相似的软骨组织，目前最常用的方法就是将细胞种植在生物相容和生物降解的支架材料上再生软骨。支架材料用于组织工程时，在细胞接种，生长和移植的每一步骤都需要不断的优化条件，这是一个耗时费力的过程。首先在接种细胞时，可能暴露于毒性的化学物质、改变的温度、pH及剪切应力等环境下^[11]，其次在种子细胞生长阶段，有些支架材料会引起细胞形态的改变或者表型的丧失^[12]；凝胶类材料将种子细胞锚定于一个位置，阻碍细胞间的交流并对机械刺激起到应力遮蔽的效应；最后，细胞材料复合物植入体内后，其降解毒性，炎症反应以及其他细胞入侵支架等问题都有待解决。为此，本实验探讨无支架条件下构建组织工程软骨的新方法，即“自组装”技术，该技术用于组织工程，避免了支架材料引起细胞表型改变、应力遮挡、炎症反应以及降解毒性等一系列问题。将体外软骨诱导分化的细胞接种于琼脂糖包被的培养板，琼脂糖膜阻止软骨诱导细胞的黏附和伸展，从而保持软骨诱导细胞的圆形形态。细胞经历自我聚集过程形成组织团块，外观、组织学和组织化学与正常软骨组织相似。采取密度梯度细胞接种时，随着细胞密度的增大，组织团块体积和重量增加，提示可以通过调节细胞密度，构建组织工程软骨修复不同程度大小的软骨组织缺损。组织块富有弹性和一定韧性，具有软骨外形和力学特性。取组织标本进行Ⅱ型胶原免疫组化染色和甲苯胺蓝染色、阿利辛蓝染色,结果证实低氧环境GDF-5诱导hMSCs“自组装”工程化软骨具有软骨特征性Ⅱ型胶原和蛋白聚糖，并有少许Ⅹ型胶原表达。组织学检测，软骨细胞周围有基质环绕，可见类似软骨陷窝样的空隙，这于正常的软骨结构相似。

正常组织微环境下细胞-细胞外基质(extracellular matrix,ECM）间的微生物力学在胚胎组织发育模式过程中起着关键作用，细胞-ECM间生物力学的传导能够控制细胞的形态、极性、生长和分化，ECM重构改变局部微生物力学和细胞生长模式，最终形成组织的特异性结构和功能^[13]。 “自组装”细胞唯一的底物就是其它细胞，可以增强细胞间的信号传导和通讯来维持表型；琼脂糖则防止细胞贴壁和扁平化维持其形态；细胞分泌的ECM直接与细胞接触，有利于细胞-细胞和细胞-ECM间生物力学传导，基质在细胞周围沉积形成网架结构为细胞的生长提供了三维空间，诱导组织重构并恢复细胞固有的生理特性，这对维持软骨组织的功能尤为重要^[14]。同时细胞有自分泌功能，分泌生长因子, 在聚集培养过程中，细胞因子的浓度得到提高，有利于细胞表型的维持^[15]。

本试验结果表明，低氧环境促进GDF-5诱导hMSCs向软骨细胞分化，验证了低氧环境下GDF-5诱导hMSCs “自组装”形成工程化软骨可行性，是无支架条件下构建组织工程软骨的新方法，为深化软骨组织工程研究提供了新思路和实验依据。因关节软骨是在关节内复杂的生物理化环境下工作的，“自组装”所构建的组织工程软骨修复关节骨软骨缺损的效能需在生物体内进行进一步的研究。

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