高脂血症之谷固醇血症三例的临床、基因分析及治疗

发表于中华儿科杂志2018年第六期

邱文娟 房迪 梁黎黎 范燕洁 孙昱 闫慧余 永国 顾学范

【摘要】目的研究3例谷固醇血症患儿的临床、实验室检查及基因变异特点。方法回顾性分析了2016年6月-2017年6月因皮肤黄瘤病就诊的3例患儿临床和实验室检查特点，通过全外显子测序对3例患儿致病基因进行分析，Sanger测序验证所发现的ABCG5和ABCG8基因变异及父母来源，气相色谱质谱分析其植物固醇水平。结果3例患儿（男1例、女2例）于15月龄～6岁2月龄因关节附近的皮肤皱褶处多发线状或颗粒状黄瘤就诊，3例患儿血总胆固醇（14.45、15.47和15.85mmol/L）和低密度脂蛋白胆固醇（9.02、13.54和12.47 mmol/L）明显升高。全外显子测序发现2例携带ABCG5基因复合杂合变异，1例携带ABCG8基因复合杂合变异，共发现3种ABCG5基因变异，包含2种已报道变异（p.N437K，p.R446X）和1种新变异（p.Q251X）及2种ABCG8基因新变异（p.R263Q，c.1528_1530delATC）。3例患儿的菜油固醇、豆固醇及β-谷固醇明显升高，菜油固醇分别为111.35、102.86和58.91μmol/L，豆固醇分别为14.97，29.43，17.79μmol/L，β-谷固醇分别为231.2，177.66和114.2μmol/L，确诊为谷固醇血症。采取限制植物固醇和动物固醇的饮食治疗后，3例患儿血脂基本恢复正常，其中2例患儿皮肤黄瘤变小甚至消失，另一例未见改变。结论3例黄瘤病的高胆固醇血症患儿，经全外显子测序和植物固醇测定确诊为ABCG5/ABCG8基因复合杂合变异所致的谷固醇血症，发现1种ABCG5基因新变异（p.Q251X）及2种ABCG8基因新变异（p.R263Q，c.1528_1530delATC），3例患儿对低植物固醇/动物固醇饮食治疗反应良好。

谷固醇血症（Sitosterolemia，OMIM210250）又称植物固醇血症，是罕见的植物固醇代谢障碍的常染色体隐性遗传病，致病基因为三磷酸腺苷结合盒家族G（ATP binding cassette，subfamily G;ABCG）的ABCG5和ABCG8，二者所编码的sterolin-1和sterolin-2蛋白在小肠和肝细胞表达，可将植物固醇主动转运入肠道和胆汁中，任一缺陷均可致病[1-3]。该病主要表现为皮肤黄瘤，早发型动脉粥样硬化，关节炎，部分可有肝脾肿大，口型红细胞、巨大血小板及血小板减少等[4]。多数谷固醇血症患者有血总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的明显升高，儿童患者国内罕见报道[5]。本研究对2016年6月-2017年6月因皮肤黄瘤和高胆固醇血症就诊于上海交通大学医学院附属新华医院儿内分泌遗传科的3例谷固醇血症患儿，分析其临床、实验室检查、ABCG5和ABCG8的基因变异特点及对饮食治疗的反应。

对象和方法

一、研究对象

选取2016年6月-2017年6月因皮肤黄瘤和高胆固醇血症就诊的3例患儿，其中男1例，女2例，分别来自不同家庭，就诊年龄1岁3月龄～6岁2月

龄，父母均非近亲婚配，均无黄瘤、高胆固醇血症及早发型心血管疾病和猝死的家族史。该研究得到新华医院伦理委员会批准（XHEC-D-2017-074），所有检查均获得家长或患儿的知情同意。

二、研究方法

1.患儿的临床表现及辅助检查的分析和随访：收集上述3例患儿的临床资料及实验室检查结果（血常规、肝肾功、血脂、甲状腺功能等）。

2.血浆固醇谱检测：患儿空腹8小时抽取EDTA抗凝外周静脉血2ml，立即分离血浆后，低温送北京摩尔美康分离检测技术有限公司，经萃取后气相质谱仪（GCMS-QP2010Plus，日本岛津）检测血浆固醇谱[6]。

3.全外显子测序：使用患儿基因组DNA用于文库生成，按照生产商的方案（Illumina Truseq文库构建）准备配对末端DNA文库，并在Illumina Hiseq X上对150bp配对末端序列进行测序。测序数据通过Burrows-Wheeler Aligner（BWA）与人参照基因组hg19比对以获得原始对比结果。收集与基因组区域一致的序列进行变异鉴定并进行随后的分析。

4．Sanger测序：进行Sanger测序以验证全外显子测序所发现的基因变异并确认变异位点的父母来源，使用GoTaq PCR扩增试剂盒（Promega）扩增目标区域，ABI Prism 3730分析仪（Applied Biosystems）测序。

5.基因变异功能预测：使用COBALT在线工具对新错义变异相关的氨基酸位点在不用种属间进行同源性分析，采用Polyphen及MutationTaster在线工具对新变异的致病性进行预测。按照美国ACMG遗传变异分类标准的指南对新变异分级[7]。

结果

一、临床表现及实验室检查

例1，男，6岁2月。因双手和臀部皮肤皱褶处出现黄瘤6个月就诊。体格检查发现双手背拇指的掌指关节处及臀部皮肤皱褶处见对称的线状排列颗粒状黄瘤（图1a），肝脾未及肿大。

例2，女，5岁。因肘关节、腕关节附近及臀部皮肤逐渐出现黄瘤一年就诊。患儿从3岁半开始每天吃一个炖蛋加麻油调香。体格检查发现肘关节及臀部皮肤皱褶处见结节状黄瘤、双手腕关节皮肤皱褶处见多处对称的线状黄瘤（图1b），肝脾未及肿大。

例3，女，1岁3月。因肘、踝关节和腕关节附近逐渐出现线状黄瘤且逐渐增多3个月就诊。患儿母乳喂养至10个月，从10个月开始经常食用牛油果。体格检查发现双肘足踝关节、双手腕关节皮肤皱褶处见多处对称的线状黄瘤（图1c），肝脾未及肿大。

3例患儿的实验室检查均显示血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及载脂蛋白B显著升高，血清总胆固醇分别为14.45、15.47和15.85mmol/L(正常范围3.36～6.46)，低密度脂蛋白胆固醇分别为9.02、13.54和12.47 mmol/L(正常范围<3.36)，载脂蛋白B分别为3.27、3.03和2.54g/L(正常范围0.6-1.2)。其他检查如血常规、尿常规、肝肾功及甲状腺功能均未显示异常。3例患儿的颈动脉动脉彩超均未见斑块形成，心脏彩超均未见异常。既往无溶血史。3例患儿的父母血脂检测均在正常范围。

二、谷固醇血症的诊断

初诊后即对3例患儿开始低脂饮食治疗，建议动物胆固醇摄入量不超过250 mg/d。初诊后4个月全外显子测序结果显示例1携带ABCG8基因复合杂合变异，例2和3携带ABCG5基因复合杂合变异，变异均分别来自其父母亲（表1）。ABCG5发现2种已报道变异p.N437K和p.R446X、1种新无义变异p.Q251X，ABCG8发现1种新缺失变异c.1528_1530delATC和1种新错义变异p.R263Q（图2）。对所发现的3种新变异相应蛋白的氨基酸位点进行不同种属同源性比对发现，sterolin-1蛋白的第251位点，sterolin-2蛋白的第263、510位点的氨基酸在人类、小鼠、大鼠、斑马鱼、牛等种属间高度保守。全外显子测序分析提示谷固醇血症后，收集患儿空腹血浆经气相质谱分析血浆固醇水平显示菜油固醇、豆固醇及β-谷固醇明显升高，超过正常参考上限的5～15倍（表1）。3种新变异中ABCG5基因的p.Q251X与ABCG8基因的c.1528_1530delATC经Polyphen和Mutation taster预测为致病变异，而ABCG8基因的p.R263Q新错义变异Polyphen预测为良性变异，Mutation taster预测为致病变异，但该突变在人群数据库中的频率为0，在本科室超过1000人的全外显子测序的数据库中也未发现携带者，结合例1有典型的临床表现及生化指标异常，按照ACMG遗传变异分类标准的指南对新变异分级，判定为可能致病变异。结合临床表现、实验室检查3例患儿确诊为谷固醇血症。

三、谷固醇血症的随访和治疗

3例患儿确诊谷固醇血症前进行了低动物固醇饮食控制4个月后，发现血脂水平较前明显下降，但仍高于正常（表1）。确诊谷固醇血症后建议采取严格限制植物固醇（植物油、粗粮、牛油果、坚果类食物、巧克力、海藻类）摄入、部分限制动物固醇的饮食方案，例1和2食用正常谷类，例3每日40%碳水化合物替换为土豆、红薯和芋头等，总热卡为293～418kJ/(kg·d)（70～100kal/(kg·d)）,蛋白、脂肪、碳水化合物的比例按照18%、25%、57%，治疗4个月后3例患儿血总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇及载脂蛋B明显降低，几乎降至正常范围。例1菜油固醇和谷固醇较前降低，黄瘤明显变小，数量变少；例2仅菜油固醇和豆固醇降低，谷固醇较前升高，黄瘤大小和数量与饮食控制前无明显变化；例3菜油固醇、豆固醇与前类似，谷固醇较前升高，但黄瘤减少最明显，几乎消失（图1，表1）。3例患儿饮食治疗8个月期间生长速度与同年龄同性别儿童类似，肝肾功能及血常规基本正常。

讨论

遗传性高胆固醇血症是一组异质性的脂质代谢紊乱疾病，其特征为低密度脂蛋白胆固醇升高所致的高胆固醇血症、黄瘤病及早发冠心病[8]。可由常染色体显性遗传的LDLR、APOB、PCSK9和APOE基因或常染色体隐性遗传的ABCG5/ABCG8、LDLRAP1和LIPA基因缺陷所致[9]。婴幼儿罕见黄色瘤和严重高胆固醇血症，若父母有高胆固醇血症，最常见的是LDLR缺陷的纯合子家族性高胆固醇血症[10]。若父母胆固醇正常，可能为常染色体隐性遗传的其他疾病。本研究的3例患儿父母胆固醇均正常，故对常染色体隐性遗传高胆固醇血症的鉴别诊断至关重要。测定血植物固醇水平是诊断谷固醇血症的可靠方法，但需气相色谱质谱或高效液相色谱法[1]，这些方法多数实验室不常规检测，因此基因检测就非常重要。本研究的3例患儿通过全外显子测序提示为ABCG8或ABCG5基因变异所致谷固醇血症，后经气相质谱分析植物固醇水平明显升高确诊。谷固醇血症目前患病率不明，但可能比以前认为要高[11]。随着下一代测序技术的应用会有更多患者得以早期确诊。

正常人饮食中约40%～60%的胆固醇被吸收，而植物固醇的吸收却低于5%，肝脏优先将植物固醇通过胆汁排泄，正常人血植物固醇浓度很低[12]。谷固醇血症由于ABCG5或ABCG8基因缺陷导致植物固醇从肠腔吸收增加和泵入胆管排泄减少，造成血浆和组织中谷固醇蓄积，表现为皮肤皱褶处及肌腱附近黄瘤，关节痛和关节炎、肝脾肿大以及早发动脉粥样硬化；部分可有溶血、异常形状红细胞和巨血小板减少症[13]，临床表现异质性大，仅通过常规生化检查和临床症状体征很难确诊。本研究3例患儿均表现为皮肤皱褶的线状或颗粒状黄瘤，无关节痛和关节炎、动脉粥样硬化及血液学异常表现，血胆固醇明显升高。多数谷固醇血症儿童血胆固醇水平明显高于成人[5]，原因可能与儿童肝低密度脂蛋白受体活性被体内高浓度植物固醇抑制而表达下调及儿童和成人的脂质代谢调节不同相关[14]。谷固醇血症的患儿中，早发动脉粥样硬化和早发心肌梗塞有报道5岁即可发生，对有黄瘤及严重高胆固醇血症且父母血脂正常的患儿，应仔细询问病史，结合植物固醇检查和基因检测以便早期明确诊断。

谷固醇血症致病基因为ABCG5和ABCG8串联定位在染色体2p21[3]。迄今已报道的107例患者中，亚裔患者主要为ABCG5基因变异所致，白种人患者主要为ABCG8基因变异所致[1,15]。例1携带ABCG8的新错义变异p.R263Q及新缺失变异c.1528_1530delATC，缺失变异多对蛋白影响较严重，p.R263Q新错义变异可能为较温和变异，因该患儿5岁多起病且黄瘤数量最少。例2和3均携带ABCG5杂合无义变异p.Q251X，例2携带杂合错义变异p.N437K和而例3携带杂合无义变异p.R446X，无义变异可导致编码蛋白截短，对编码蛋白影响严重，例3发病年龄较例2明显早，提示ABCG5基因所致的谷固醇血症的基因型和表型有相关性。

谷固醇血症的治疗包括限制植物固醇和动物固醇的饮食疗法及消胆胺、依泽替米贝等药物治疗[1,15]。有研究报道饮食合并药物治疗可有效降低血植物固醇[16]。由于消胆胺味道较难耐受，依泽替米贝国内无药可用，故本研究3例患儿仅采取饮食治疗。3例患儿在诊断未明时限制动物胆固醇4个月后发现血脂明显下降，但仍高于正常水平；确诊后采取严格限制植物固醇、部分限制动物固醇4个月后血脂几乎降至正常。例1和3黄瘤明显减少，饮食控制欠佳的例2黄瘤无明显改变。上述治疗经过与以往所报道的本病对饮食治疗反应良好相一致[11]。3例患儿治疗后菜油固醇降低至正常上限的6～8倍，豆固醇仅超过正常上限的2～3倍，谷固醇治疗后仍超过正常上限12～28倍，文献报道谷固醇血症植物固醇约超过正常的30～100倍，但无植物固醇饮食几乎不可能完成，因所有植物食物中都包含植物固醇，低植物固醇饮食仅可使血浆植物固醇水平降低30％[11]。例1和3黄瘤明显变小减少，但其血谷固醇的水平仍明显升高。谷固醇血症患者应达到的理想治疗目标尚无统一标准，需进一步随访观察，多数谷固醇血症通过饮食和/或药物治疗可达到较好效果。

本研究报道了3例黄瘤病的高胆固醇血症患儿，经全外显子测序和植物固醇测定确诊为ABCG5/ABCG8基因复合杂合变异所致的谷固醇血症，3例患儿对低植物固醇/动物固醇饮食治疗反应良好。本研究加深了对谷固醇血症儿童患者的临床表现、实验室特点、ABCG5/ABCG8基因变异谱及治疗反应的认识。

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表13例患儿限制动物胆固醇后4个月后和限制植物固醇及动物固醇后4个月后的血脂和植物固醇水平

注：TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；ApoB：载脂蛋白B；/：未检测LDL-C