王强二十五届全国泌尿外科学术会议(CUA2018) 论文

苗药结石草体外预防草酸钙结石成核及生长形成的研究

---民族药物治疗尿石病的机制探讨

王强陈绪龙谷江孙发

贵州医科大学附属医院泌尿外科

目的：观察苗药结石草体外预防草酸钙结石成核及生长形成的作用，探讨苗药结石草预防草酸钙结石形成的机制。

方法：把成核抑制率作为苗药结石草提取物体外对磷酸钙、草酸钙晶核形成的动力学指标；扫描电镜观察苗药结石草对草酸钙晶体生长情况的影响。

结果：苗药结石草组最大诱导时间明显低于空白对照组，晶核形成速率明显高于空白对照组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。1.5g/ml苗药结石草组最大诱导时间明显低于枸橼酸钾组，晶核形成速率明显高于枸橼酸钾组，差异有统计学意义（P＜0.05）；扫描电镜观察，苗药结石草组草酸钙晶体尺寸变小、橄榄形、圆形、四方体形甚至片状的不规则形晶体增多。

结论：苗药结石草体外通过促进磷酸钙、草酸钙晶核形成，抑制草酸钙晶体生长，预防草酸钙结石形成。

尿石病是最为常见的泌尿外科疾病之一，虽然外科治疗技术发展迅速，但是发病率却逐年上升，南方地区高达10%左右，新发人口近200万。外科治疗常有并发症多、残石率高的缺点，西药治疗毒副作用大、依从性差的弊端，多年来，临床上一直积极寻找一种既能有效治疗尿石病，又兼具安全的药物。

植物药因其资源非富而广泛的服务于世界各国人民，WHO组织报道大约800多种常用的植物药服务了全球75%以上的人口，这种情况在发展中国家更为普遍[1]。研究发现，早在魏晋南北朝之前，我国就有《神农本草经》、《名医别录》等著作中记载榆皮、连钱草、虎杖根、车前子、结石草等植物药治疗“石淋”（尿石病）[2]。苗药结石草民间使用治疗结石在贵州地区由来已久，效果确切，但一直缺乏从尿石病成石的机制方面探讨药物的机理，本论文着重从草酸钙结石形成中晶核形成、结晶生长开展结石草体外实验，系统的研究结石草体外对草酸钙结石形成的影响。

1实验方法

1.1结石草提取物对羟基磷灰石晶核、草酸钙晶核的影响

体外模拟人体体温，所有操作在37℃恒温水浴中操作，分光光度计使用前均预热30分钟，单色光波波长620nm,固定灵敏度档位，调节T＝100%，每组实验重复操作3次。将氯化钙（12mmol/L）、氯化钠（300mmol/L）、乙酸钠（15mmol/L）和草酸钠（1.5mmol/L）混合获得草酸钙亚稳态溶液。实验组结石草((0.5g/mL、1g/mL、1.5g/mL)分别加入配置的一水草酸钙亚稳态溶液中，充分混合静置30分钟，将1mL体积的氯化钙溶液通过恒温水浴转移置比色皿中，然后再加入1mL草酸钠溶液与1mL含结石草的一水草酸钙亚稳态溶液，充分混合（混合液中钙的最终测定浓度为4mmol/L、草酸盐为0.5mmol/L）。加入氯化钙后的比色皿放置分光光度计后每20秒测试读取一次数据，共计30分钟。实验结束时溶液中的平均pH值为5.7±0.01。

1.2结石草提取物对草酸钙晶体生长的影响

构建草酸钙晶体体外生长环境：37℃恒温水浴箱，将1.5mLCaCl2（10mmol/L）、1.0mLNaCl（500mmol/L）、重蒸水42mL、空白组（0mL）或对照组2.0mL枸橼酸钾(1.0mmol/L）或结石草组2.0mL结石草((0.5g/mL、1g/mL、1.5g/mL)、1.5mLNa2C2O4（10mmol/L）、添加重蒸水至50mL,充分混匀后纳米膜过滤。选取单晶硅片作为电镜基片，置于烧杯底部，过滤后的溶液倒入烧杯中，薄膜覆盖密闭烧杯，静置3天后取出基片，常温干燥，制样进行SEM观察，设定加速电压15Kv,放大倍率15000，观察各组晶体生长情况。

1.3统计学方法

应用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，t检验数据正态性，方差齐时采用独立样本t检验，方差不齐时采用秩和检验，P＜0.05为差异有统计学意义，P＜0.01为差异有显著统计学意义。

2结果

2.1结石草提取物对羟基磷灰石晶核形成的动力学检测结果

溶液中的微粒数量越多吸光度数值越大，在一定范围内吸光度数值的增长与诱导时间相关，当吸光度数值达到最大值时，即溶液中微粒数量最多，此时可认为是晶核形成时刻。检测波长为620nm时HCP的吸光度数值变化，可以反映结石草提取物对HCP晶核形成的影响。反应后晶核形成的时间与吸光度数值之间的关系，称为620nm时成核变化曲线。

反映了620nm波长下各组HCP溶液吸光度数值与反应时间的关系，各组吸光度数值随反应时间逐渐达到最大值，

而最大诱导时间（Tmax）就是指从反应开始到达吸光度数值最大的这段时间。

到达最大诱导时间这段曲线的斜率（K），即是HCP晶核形成的曲线速率K=（最大吸光度数值-起始吸光度数值）/最大诱导时间。通过数据收集得出各组Tmax,通过对620nm时成核变化曲线进行回归分析，计算各组曲线上升支的斜率，此斜率即是各组晶核形成速率。

如表1所示，结石草组最大诱导时间明显低于空白组，晶核形成速率明显高于空白组，差异有显著统计学意义

（P＜0.01）。1.5g/ml结石草组最大诱导时间明显低于枸橼酸钾组，晶核形成速率明显高于枸橼酸钾组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1各组羟基磷灰石晶核形成最大诱导时间和晶核形成速率比较

注：#，P＜0.01与空白组比较；

*，P＜0.05与枸橼酸钾组比较；**，P＜0.01与枸橼酸钾组比较

2.2结石草提取物对草酸钙晶核形成的动力学检测结果

同上，检测波长为620nm时CaOx的吸光度数值变化，可以发现结石草提取物对草酸钙CaOx晶核形成的影响。空白组中草酸钠与氯化钙反应后晶核形成的时间与吸光度数值之间的关系，称为620nm时成核变化曲线。到达最大诱导时间这段曲线的斜率（K），即是CaOx晶核形成的曲线速率K=（最大吸光度数值-起始吸光度数值）/最大诱导时间。通过数据收集得出各组Tmax，通过对620nm时CaOx成核变化曲线进行回归分析，计算各组曲线上升支的斜率，此斜率即是各组CaOx晶核形成速率。

如表2所示，结石草组最大诱导时间明显低于空白组，CaOx晶核形成速率明显高于空白组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。1.0g/ml结石草组最大诱导时间明显低于枸橼酸钾组，CaOx晶核形成速率明显高于枸橼酸钾组，差异有统计学意义（P＜0.05）。1.5g/ml结石草组最大诱导时间明显低于枸橼酸钾组，CaOx晶核形成速率明显高于枸橼酸钾组，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。

表2各组草酸钙晶核形成最大诱导时间和晶核形成速率

注：#，P＜0.01与空白组比较；*，P＜0.05与枸橼酸钾组比较；

**，P＜0.01与枸橼酸钾组比较

2.3结石草提取物对草酸钙晶体生长的影响

草酸钙晶体主要有三种形式存在，从热力学稳定程度的方面分为最稳定的一水草酸钙（COM），第二稳定的二水草酸钙（CDM）和最不稳定的三水草酸钙（COT）,晶核形成的基础上，在晶面界面不断生成，受到外界环境的影响可以生长出形态各异晶貌，COM常见的有蔷薇花状、长六边形、叉生型、聚集体，COD常见的有哑铃形、橄榄形、四方锥形，COT常见的是长柱形，而SEM是直接观察晶体微观外貌适宜工具。文献报道COM晶面界面富集更多钙离子易与细胞膜粘附难以随尿排出，从防石角度出发，诱变更多COM转为COD、COT或者阻碍更多COD向COM转变是有利于防止尿石病发生的。

实验中外界环境条件稳定，各组溶液中晶体生长均匀，拍摄扫描电镜时随机从每组基片上选取视野观察。可以看出枸橼酸钾组和结石草提取物组草酸钙晶体尺寸减小，且COM减少，橄榄形COD明显增多，说明枸橼酸钾和结石草提取物对草酸钙晶体的生长具有抑制作用。

3.结论

结石草体外通过促进磷酸钙、草酸钙晶核形成，抑制草酸钙晶体生长，预防草酸钙结石形成。

4.讨论

尿路结石的“成”“因”指向了尿路结石“形成”“病因”两个独立而又相互联系的概念[2][,#71]。目前虽然使用了大量的植物药治疗尿石病，但是对药物的机理缺乏系统的研究。

620nm的吸收光值与溶液内颗粒数目是对应的，随着时间的发展，吸光度达到极值所需的时间我们称之为最大诱导时间，时间越长成核越慢。实验中结石草组对羟基磷灰石与草酸钙两种晶核形成最大诱导时间随浓度的增加而大，说明结石草提取物随浓度的增加羟基磷灰石与草酸钙两种晶体成核增，成核的位置一般认为在髓袢小管细段内，快速成核有利于迅速降低小管局部尿液成石成分的浓度，阻止了晶体的进一步生长和髓袢小管的阻塞。国内有学者对结石草系统的进行化学成分的分离，主要包含萜类

黄酮和黄酮苷类、有机酸、挥发油类、甾体类、醇类共六大类，特别是萜类、黄酮和黄酮苷类含量最多[5]，饱和溶液中这些物质会通过降低溶液系统能量壁垒、加快晶核的球面半径增长、或者是增加了溶液中有机基质的含量加快了自发成核和异相成核[3]。

瑞典的Tiselius教授提出磷酸钙在草酸钙结石形成过程中具有重要作用[6]，就提出成石始于羟基磷灰石成核后发生羟基磷灰石溶解，增加了局部钙的含量，从而促进了草酸钙成核和生长，从结石形成的总体过程来看，结石草促进了羟基磷灰石和草酸钙的成核，可以迅速降低局部草酸、磷酸和钙的饱和度，阻止了成核后的快速生长，而晶核则因为体积小而随尿液及时排出[4]。

参考文献：

[1]那彦群,叶章群,孙颖浩,等.中国泌尿外科疾病诊断治疗指南手册[J].2014.

[2]孙西钊,吕建林,叶章群.泌尿系感染性结石的病因和诊治[J].中华泌尿外科杂志,2010,31(2):141-143.

[3]Ming H,Sha L,Hor Yue T,et al.Current Status of Herbal Medicines in Chronic Liver Disease Therapy:The Biological Effects,Molecular Targets and Future Prospects[J].International Journal of Molecular Sciences,2015,16(12):28705-28745.

[4]孟洗,张鼎.食疗本草[M].人民卫生出版社,1984.

[5]Lee K J,Ham I H,Bu Y M,et al.Antidiabetic Effect of Glechoma longituba(Nakai)Kupr in Diabetic Rats induced by Streptozotocin[J].2008.

[6]Tsujihata M,Yoshimura K,Tsujikawa K,et al.Fibronectin inhibits endocytosis of calcium oxalate crystals by renal tubular cells[J].International Journal of Urology,2006,13(6):743-746.