供者HLA特异性抗体在异基因造血干细胞移植中的挑战与机遇

－来自59届ASH会议的报告

彭群艺李纯团翻译朱雄鹏审校

福建医科大学附属泉州第一医院

异基因造血干细胞移植受者可能产生直接针对外源HLA抗原的抗体。接受HLA部分不相合的异基因造血干细胞受体需要检测外周血是否存在供者HLA特异性抗体（DSAs）。如果存在DSAs，在造血干细胞回输时，会增加移植失败的风险。最新开展的技术采用固相免疫测定（SPIS），用荧光染料结合到磁珠上，极大提高了检测和分级DSAs的能力。当结合使用经典的补体依赖淋巴细胞毒性和流式交叉配型试验，SPIs有助于提供DSA强度评估。已生育女性经常带有DSAs。半相合移植中的第一直系亲属作为供者，往往带有更高滴度DSAs。DSA需要定期监测，因为它们的滴度可以随着时间变化。虽然抑制DSA方法尚无统一标准，但从完全HLA相合的异体血液或骨髓移植患者中的经验得出，脱敏技术可影响移植成功率。

前言

异基因外周血或骨髓移植（alloBMT）仍然最后是许多复发和难治性血液系统恶性肿瘤患者可能治愈的方法。对异基因骨髓移植主要难度包括预处理方案毒性，移植物抗宿主病（GVHD），和缺少适合的HLA匹配的供者，这几个问题在老年患者尤为明显。然而，降低预处理强度方案RIC）的出现能显著降低毒性，有合并症的老年患者或严重预处理并发症的患者现在都可以进行异基因骨髓移植。同时移植后使用环磷酰胺预防GVHD，已极大的应用于alloBMT以减少GVHD发生率。使得患者能够增加从相关、无关及脐血等供者池寻找供者机率以进行alloBMT。

值得注意的是，在过去的几年中，使用备选或HLA不相合alloBMT一直在稳定增长。95%以上的患者无论种族，都可容易地应用alloBMT，半相合供者可来自他们的父母、兄弟姐妹、子女、亲戚或者是第一直系亲属。2009年，在美国急性髓系白血病alloBMT中，不相合的alloBMT占5%，但65%的alloBMT是在约翰霍普金斯的西德尼Kimmel综合癌症中心（SKCCC）进行。从那时起，在SKCCC不相合的alloBMT比例逐渐增加：2011年有76%，2015年占81%，其中85%都是半相合移植。此外，在美国，半相合供者是唯一的供者型，自2015以来在数量一直增加，有其他供体类型呈现下降或稳定使用。然而，部分HLA不相合供者的使用出现了一个新的问题-HLA供体特异性抗体（DSAs）。

HLA DSAs在受体针对候选供体的I类或II类HLA抗原产生的抗体。I类抗原HLA-A，B，C在大多数细胞中表达，而II类抗原，HLA-DR、DQ和DP，主要表达在抗原呈递细胞上。使用部分HLA不相全的供体需要预防DSAs的可能性。重要的是，典型的“10个位点相合”alloBMTs是HLA-A，-B、-C、DRB1、DQB1相合，而HLA-DPB1、DRB3、DRB4和DRB5不一定相合，这机率超过50%以上。患者针对这些外源细胞或组织暴露的HLA抗原产生抗体。常见的暴露包括妊娠、血液制品输血和以前的器官或血液移植。重要的是，HLA抗体是动态的。在炎症反应后，如感染或组织损伤，静止的HLA特异性记忆B细胞被激活，这可能导致在没有外源组织重新暴露的情况下产生DSAs。⁷因此，HLA抗体的评估需要随着时间重新评估。

检测DSAs

HLA抗体检测方法先前已陈述过，下面进行简要讨论。^8-10两种方法经常被用来监测患者循环HLA抗体：交叉配型和固相免疫检测（SPI）。交叉配型试验需要供体组织：病人的血清与供者的T和B淋巴细胞共孵育，并以这种方式，交叉配型试验可直接评估抗体与供体细胞表面抗原的反应。在SPIs试验中，病人的血清与结合到固体基质上的可溶性HLA抗原共孵育。这些测试是用来评估HLA抗原特异性抗体的存在和相对强度。一种有意义的评估DSAs特异性和相对强度的方法，需要SPIs结合交叉配型试验使用。SPIs显示特异性和敏感性，而交叉配型试验辅助抗体强度评估。

在基础样版中，补体依赖的细胞毒交叉配型试验（CDCXM）是监测补体激活的抗体。更为敏感的流式细胞交叉配型实验中（FCXM），荧光标记的抗人免疫球蛋白G（IgG）是用来检测细胞结合的抗体。细胞毒性程度或荧光信号都是衡量供体反应抗体的相对强度。FCXM比CDCXM更灵敏，更客观和简便。交叉配型实验是一个直接检测供体抗体的相对强度的方法，包括供体细胞表达抗原的变异性和多种DSAs的结合强度。然而，非HLA抗体，如自身抗体和治疗性抗体，可能会混淆检测的结果。HLA抗体筛选和鉴定目前通过SPIs检测。SPIs利用HLA分子结合到固体基质。固体基质可以是微量滴定板用来酶联免疫吸附测定，或者是聚苯乙烯磁珠用于传统的流式细胞仪或粒子流分析仪分析。最常用的是基于Luminex的SPIs。这些方法的主要优点是高特异性和灵敏性，半定量的，多用功能。靶点是最大100种不同荧光标记的微球群悬浮液的，表面包被着HLA抗原，而这些HLA蛋白是来自细胞膜或转染的细胞系表达的单一重组蛋白。与血清共孵育后，加入结合报道荧光的IgG抗体，与HLA抗体结合，在Luminex平台上对磁珠分析检测，Luminex平台是双激光颗粒分析仪。报道信号的平均荧光强度（MFI）与结合到每个磁珠的抗体数量成比例，用半定量法来估计抗体的水平。

根据作用的靶点，试剂盒有3种规格：来自多种细胞的抗原筛选，在表型板中每个磁珠群都带有来源于单个个体中一个细胞系的I类或II类蛋白和单个抗原磁珠，每个磁珠群中是HLAI类或II类抗原组合，包被的是多种单一的重组蛋白抗原（图1和图2）。筛选试验用于检测HLAⅠ类或II类抗体的存在或缺失，以及监测抗体水平的变化。表型和SAB磁珠是用于评估抗体的特异性和水平。SAB阵列覆盖最常见的（和一些罕见的）所有的多态位点的等位基因HLA-A，B，和C，DRB1，DRB3，DRB4，DRB5，DQA1，DQB1，DPA1与DPB1。他们是在复杂的血清中明确抗体特异性的方法，鉴定表位特异性以及监测HLA-Cw、DQA、DPA和DPB抗体。虽然SAB的检测是最灵敏和特异的，重组蛋白质变性可导致新的或“神秘”的表位结合非HLA抗体（假阳性）。此外，当几种DSAs存在时，抗体的强度是难以评估的因为MFIs是不具有可加性的。由于变性表型组更不倾向人工蛋白，并能更好地估计抗体强度，因为抗原密度更能代表细胞表面发现的HLA密度。将两者方法结合使用可以使结果更准确，SABs提供特异性和表型磁珠辅助强度评价以及排除由于SAB蛋白变性的假阳性。最近，SAB试验已被修正用于补体结合抗体的监测（如C1q，在经典途径开始产生的片段），度图表述出抗体功能特性。

SPI结果解释需要了解HLA分子多态性和交叉反应的血清学模式。HLA抗体识别的结构基序（抗原表位）含有少量的氨基酸存在于供体中，而不是受体。每个HLA分子含有多个表位，同时，不同的HLA分子有共同的表位。通常情况下，共同表位是个体对接触到的单个抗原产生的抗体，不仅对源抗原有特异性，而且对他或她以前未暴露过的抗原也有特异性。识别针对共同表位的反应性模式需要准确的特异性评估和抗体复杂性的评估。模式识别对于区分真阳性和真阴性反应也是必不可少的。如果未观察到预期的共同表位反应性，则单个阳性磁珠可被识别为假阳性。在光谱的另一端，抗原表位反应模式中持续低于MFI阈值通常被认为是阳性，如果仅以MFI值作为阳性的标准，则可以归于假阴性。

需要注意的是，SPIs不是定量分析试验。MFI值不能直接转化为抗体水平。从文中提取的MFI值是非常有意义的，但既不能定义抗体特异性，也不估计抗体水平。MFI值受批内和批间变异的影响。在不同磁珠群中包被的蛋白变异，会混淆同一阵列中HLA抗体水平交叉特异性比较以及同样特异性交叉点。⁸例如，SAB磁珠还有更多的HLA-Cw，DQ和DP的蛋白质，因此MFI值过高。MFI值的使用能更好的理解抗体的水平，当表位分布在多种磁珠中，如公共表位Bw4和BW6。此外，SAB的MFI值可能低估了多种DSAs的累积强度。强的抗体可能饱和磁珠，实际的抗体水平可能只有在血清稀释后才能显示。此外，一些血清提供关于稀释的MFIs，由于干扰物质的存在，如IgM和补体。多种血清处理可用于清除干扰物质，如低渗透析、EDTA和分子量排阻柱。血清治疗引起的MFI值水平普遍升高，这种影响根据使用方法不同，在比较不同实验室获得的结果时，这一点是很重要的。尽管有这些缺点，MFI值可以预测交叉配型的结果和评估免疫风险。将MFIs与cdcx和FCXM关联可用于评估DSAs的临床相关性，设定的阈值是根据适用每个个体移植程序的免疫风险。此外，实验室间的协调是可能的，通过由专业协会能力验证计划证明，如美国的组织相容性和免疫遗传学和美国病理学会协会。认可的实验室必须满足水平测试的要求，样本分配于参与的实验室当中，并比较交叉配型和SPI抗体评估结果。

DSAs的意义

通过使用部分HLA不相合的供体，DSAs的存在是一个障碍，以前仅限于实体器官移植受体：抗体介导排斥（移植）。事实上，存在高水平的DSAs通常认为是实体器官移植的一种禁忌。⁸25年以前，Anasetti等⁹确定在一个阳性CDCXM试验中提出检测DSA阳性增加原发移植衰竭风险，对于清髓性条件下的病人来说。同样，使用CDCXM测定，奥廷格等¹⁰表明，对于第二次原发性移植衰竭的患者，交叉配型阳性可以预测出较差的总生存期。最近，通过SPI检测DSA阳性提示原发性移植失败的风险增加，¹¹包括DPB1 DSAs.¹²整体而言，DSA的存在可预测原发性移植风险增加10倍，^13-15尤其是MFI>1000。¹⁶Ciurea等¹⁷报道一例更高的移植衰竭风险，病人的DSA水平>5000并且补体结合DSAs。Chang等¹⁶报道DSAs（MFI≥10000）与原发性移植物排斥的相关性和DSAs（MFI≥2000）与原发性移植物功能不良相关性。如前所述，比较不同实验室所获得的结果需要谨慎，考虑到MIF值的差异，由于不同方法的变化，如血清处理。

目前还不清楚哪一种特定的I类或II类HLA抗原的抗体与原发性移植物衰竭更为相关，我们正在积极研究在同种异体移植物中不同细胞因素中HLA抗原的表达和密度。DSA介导的原发性移植衰竭的机制可能涉及补体介导的干细胞溶解和巨噬细胞和自然杀伤细胞通过FCR1产生的抗体依赖细胞介导的细胞毒作用。¹⁸

半相合alloBMT供体中DSAs的发生率

2006年1月和2011年3月之间，对296个连续的成年患者进行评估他们的第一次半相合alloBMT，通过使用SPIs筛选DSAs。¹⁷在这段时间内，一般有5个供体进行初步筛选评价。如果评估兄弟姐妹<5，不全相合供者（父母或子女）也要进行评估。总共对957个潜在供体进行评估，其中包括853个潜在亲缘供体和104个潜在的非亲缘供体。在这些潜在供体中，87%为HLA不相合。HLA特异性抗体的总体发病率为23%，无论是针对供体还是第三方抗原。女性携带HLA特异性抗体的可能性是4倍（43%）。与未育女性检出率31%相比，经产妇女有52%的抗体发生率。更重要的是，我们的骨髓移植（BMT）候选者中DSAs≥1的潜在供体鉴定为14.5%。然而，与我们女性alloBMT c供体DSAs检测的30.6%比较，男性供体的只有4.9%。相对于DSAS，经产女性有43%的发生率，而未育女性发病率12.5%。¹⁹这些结果与其他已发表的报告相似，发生率范围在20%到40%之间。^{3,12-14,16,20-22}

半相合alloBMT供体中DSA的相对强度

评估是否存在循环HLA抗体及其特异性和强度是供体选择中评价免疫风险的重要步骤。存在I类（HLA-A，B，和C）和/或II类（HLA-DR,-DRB3,-DRB4,-DRB5,-DQA,-DQB,-DPA,和-DPB）DSAs，在alloBMT中，有潜在原发性移植衰竭的危害。评估DSA的相对强度需要使用SPI结合交叉配型实验。交叉配型试验具有可变性；然而，在一个实验室，当测试的结果是在CDCXM中已给出的稀释滴度，和FCXM中质控血清或中位荧光通道已给出的比例，一系列检测可以提供抗体相对强度一致的方法。因为他们的灵敏度更高，进一步受固有的SPI测试变化，在最好的情况下，当使用MFI值作为抗体相对强度的指示时可以进行半定量。SPI结果与交叉配型试验结果的相关性（虚拟交叉配型试验）可用于评估DSAs的临床相关性。与单一抗原组比较，我们已经找到交叉配型结果与在固相表型组中进行的血清检测更好的关联性。²³使用一个1000 MFI的阳性阈值，我们发现阳性的FCXM试验一般与表型组MFI≥5000和单一抗原组≥10000-15 000相关。当检测稀释在1:8时，阳性的CDCXM结果与≥10000 MFI的表型组和>10 000 MFI单一抗原组相关。^17,21需要注意的是，在SAB测试前我们对所有样本进行低渗透析，这使得更高MFI值。当比较实验室使用其他血清处理方法的结果时应考虑到这一点。因为抗原浓度加强SAB对HLA-C，DQ和DP，有助于提高检测，高阈值（~23）对于高阳性率可用于呈现针对这些抗原的所产生抗体的特征。

我们认为抗体对低水平表型组有弱相关性，MFI值从1000到3000；中度从3000到5000；高强度时5000。基于上述抗体相对强度的相关性，我们发现半相合供者的DSAs往往是中度强度。在检测DSAs的患者中，半相合供体抗体约70%为中高强度。相比之下，当他们对无关供体不相合配型时，一半患者的DSAs是弱强度。¹⁹这种差异可能是由于母体子宫内接触到她孩子HLA抗原。

即使一个潜在供体在初始测试中DSAS是阴性，因为HLA抗体是动态的，在开始部分不相全alloBMT移植之前，应考虑用多种DSA分析。在SKCCCs中，每月的HLA抗体筛查是评估供体的时候，最后的交叉配型是在230天和214之间进行。由于输血或感染可引起HLA抗体的增加，敏感性患者每周都要进行筛查，来监测DSA的发展情况。

脱敏

进行alloBMT往往是迫切的需要，这得花时间排除供体有没有DSA，因此许多移植中心开展多种方法监测DSA水平。²⁴总之，用金黄色葡萄球菌A蛋白柱的抗体吸收技术（在美国不可用）和供者HLA相合的血小板回输已经有过报道。IVIg的使用频率更高。治疗性血浆置换（TPE）去除直接抗体已被使用，化疗药物或单克隆抗体，如硼替佐米和利妥昔单抗靶向抗体生产已被使用。此外，许多方法已经尝试结合，并取得了不同的成功。

在SKCCC，alloBMTDSA脱敏方案中使用改进的脱敏方法，在>200肾移植患者中一直是非常成功的。²⁵我们最初的研究结果发表在2013和最新的2015.^19,26我们的脱敏方案实际地应用于不相合的alloBMT供体，并整合到我们的RIC方案当中，包括低氟达拉滨（30毫克/平方米；天，-6至-2），环磷酰胺（14.5毫克/公斤；天，-6和-5），和全身照射（200 cGy；天-1）由未经处理的干细胞输注（0天；目标4.0×10⁸有核细胞/kg），移植后环磷酰胺（50毫克/公斤，+3天和+4），其次是他克莫司或西罗莫司和霉酚酸酯和粒细胞集落刺激因子（+5天以后）。脱敏治疗的目标是减少DSA水平低于流式细胞交叉配型一致的阳性结果。

部分HLA不相合供体，无相关的注册供者，脐带血BMT都要对基于DSA水平脱敏进行评估。虚拟交叉配型结合实际的交叉配型一起评估相对抗体强度。当实际交叉配型是无法解释的时候，虚拟交叉配型作为独立考量（例如，细胞存活率差，自体，或治疗性抗体的干扰）。在我们目前的方法中，用CDCXM监测患者DSAS水平被推荐为其他选项（不是主要推荐）。例如CDCXM阴性和FCXM阳性认为供体要脱敏。但低水平的DSAs患者通常不需要脱敏。

脱敏过程在开始前1至2周，包括隔日，单次血浆体积TEP，用5%白蛋白作为替代液用post-TPE/IVIG（0.1克/千克），他克莫司（1毫克/天），霉酚酸酯（1克每日两次），和1 TPE/IVIG治疗第-1天（图3）。在脱敏治疗-7天，DSA水平重复监测以确保在操作进行前MFI减少到阴性FCXM推荐范围。此后，TPE和IVIg停止，但他克莫司和霉酚酸酯继续到-1天。一些预处理TPE/IVIg治疗计划是基于交叉配型试验相关的DSA水平。患者的DSAs在弱至中度阳性的FCXM，处理次数为3至4。患者拥有强阳性的FCXM或者交叉配型试验中存在II类抗体，这个处理数量增加到5至6。因为以我们的经验，这些很被控制减低，^25,27或当其他危险因素存在，如多DSAs，以前移植的HLA不相合供体重复移植，一个孩子-母亲移植，如果治疗之前相对DSA水平明显增高。-1天进行额外的DSA测量。对于那些在-1天引塌的DSA反弹，到流式交叉配型试验将是阳性的点，1到2个额外的TPE/IVIg处理给药在+1天和潜在的+2天，和额外的监测在+3进行，+5天确定是否需要进行额外的post-BMT处理。对于DSA水平较低的患者，如果额外的危险因素（见上文）存在，1 TPE/IVIg处理在-1天。

在我们2015的更新中，我们报道了使用前面描述方法对15例alloBMT供者的脱敏效果。12例FCXM阳性DSA水平，另有3例脱敏；2例低水平DSAs在开始之前增高了，1例有多种低水平的DSAs。基中14例（93%）患者的DSA水平低于流交叉配型阳性并进行alloBMT。一例患者移植取消由于没有达到脱敏目标。只有2名患者在治疗期间出现了大量DSA反弹。所有14例患者移植后+60天进行移植。4例伴有皮肤受累的1级移植物抗宿主病。尽管是初次移植，7名患者在移植后3至12个月内复发。所有这些病人后来都死于复发性疾病。另外两名患者死于感染，1人死于非移植相关原因。4例患者在BMT后无病生存1至3.9年。少数的病人和他们的疾病的异质性排除任何比较这些结果，我们要更大的移植患者群体没有DSAs。

这些结果与其他报告表明，脱敏可以减少DSAs达到可以进行供体移植的水平。^{11,16,24,28-32}脱敏低反应相关因素包括有阳性的补体依赖细胞毒性交叉配型实验一致的初始DSA水平和某些II类DSAs，因为我们观察到对HLA-DQ、-DR51、-DR52,和-DR53抗原弱反应的抗体。²⁵虽然明确DSAs高水平与原发性移植物衰竭有关，它还没有被定义，如果有一个“允许”的DSA水平用于alloBMT。从已发表的研究中得出任何结论，都被DSA水平定义的不同所困扰。在4篇发表的研究中有3篇使用不同的MFI值定义DSA阳性，3篇报道与最高的MFI截点发现DSAs的存在会影响移植。Yoshihara等³²比较半相合alloBMT患者移植成功率基于DSA MF≥5000，发现DSA阳性的患者有62%的移植成功率而DSA阴性的患者有94%。Ciurea等¹¹比较比较半相合alloBMT患者移植成功率基于DSA MF≥1500，DSA阳性的患者有25%的移植成功率而DSA阴性的患者有95%。Takanashi等¹⁵比较不相关脐血移植基于DSA MF≥1000，DSA阳性的患者有32%的移植成功率而DSA阴性的患者有83%。然而，Brunstein等²⁰比较脐血移植基于DSA MF≥500，发现DSA阳性的患者有83%的移植成功率而DSA阴性的患者有78%，并得出DSA存在并不能影响移植。

我们未发布的数据也支持弱和低水平的DSA不影响移植，针对HLA-A、-B、和DR定义SAB MFI<5000。在2011年和2014年之间，我们分析了192个连续的强度降低的不相合供体alloBMT。结果：20例（10%）患者DSA阳性，172例（90%）DSA阴性。DSA阳性患者的移植成功率为86%与DSA阴性的89%无临床意义。然而，低MFI的移植研究采用不同的干细胞来源（外周血和骨髓以及脐血），这在产物比较和细胞结构差异较大，比较低FCXM阴性不宜进行。

总之，备选供体作为造血干细胞来源应用于alloBMT的作用正在扩大。然而，患者通常产生可以针对供体HLA抗原不配合的抗体，尤其是女性患者针对她们父亲的HLA抗原产生的抗体。因为这些DSAs是动态的，它们的相对强度随时间的变化。重要的是，alloBMT时存在DSAs会严重的移植成功率。开展SPIs能极大的增加监测DSAs的能力。然而，SPIs有先天的局限性并不能代表评价DSA强度的定量或定性试验。构建DSA的标准尚不清楚，然而，脱敏技术可以成功地将DSA降低到安全的范围，并限制原发性移植失败。