临床常见的免疫组化指标在乳腺癌诊治中的应用

近年来，由于免疫组化实验方法在各医院病理科的迅速普及，许多患者的术后标本可以进行免疫组化检查。这对于患者的诊断、分型以及术后的综合治疗有着重要的意义。本文就临床上常见的一些指标及其意义进行综诉。
一、激素受体（ER）和孕激素受体（PR）
人类最先发现乳腺癌细胞和激素的关系始于1896年。Bentson观察到乳腺癌患者切除卵巢后可使乳腺癌细胞的生长受到抑制。1967年Jensen发现人类乳腺癌中含有ER。从此开始了真正意义上的乳腺癌内分泌治疗的研究。女性正常乳腺的细胞上存在ER和PR，雌激素和孕激素通过ER和PR对细胞功能进行调节。当细胞恶变时，肿瘤细胞可以部分地或全部保留正常的受体系统，其功能与正常细胞相似。这种肿瘤细胞的生长仍然依赖原来的激素环境调节，称为激素依赖性肿瘤，临床上称为ER阳性乳腺癌。有些细胞在癌变过程中，其受体系统保留很少或完全丧失，不能再作为激素的靶细胞，其生长不再受激素的控制与调节，临床上表现为ER阴性乳腺癌。Jensen发现ER后，很快又发现PR，并证明PR的合成与雌激素和ER复合物在核内发生的变化过程有关，PR的形成直接受ER的控制和调节，故PR阳性的乳腺癌，ER大多为阳性。
临床上可以通过对雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）的检测，得出肿瘤细胞内激素受体含量的水平，从而提示乳腺癌的预后信息和指导内分泌治疗。据报道乳腺癌ER、PR检测的阳性率分别为40％～60％、30％左右。许多文献均已证实，ER、PR变化与乳腺癌病人预后密切相关，亦与其他公认的预后因素，如肿瘤分级、倍体性及分期有关。高分化肿瘤或临床分期较低的肿瘤ER、PR更可能阳性，受体阳性肿瘤细胞的明显减少与细胞增殖分级增高、c－erbB－2癌基因扩增增加及EGFR表达增加有关。免疫组化抗受体检测可预测乳腺癌对激素治疗的反应性。无ER或PR表达的肿瘤对激素治疗通常反应性差，而ER及PR阳性肿瘤则对激素治疗反应性高。
1974年美国Bethesde国际会议，综合世界各国400多例各种方式的内分泌治疗报道，表明事先未经激素受体测定的乳腺癌患者，应用内分泌治疗有效率只有30％；而经ER测定阳性者有效率达55％～60％，受体阴性者有效率5％～8％。TAM治疗无效的原因与ER的异常结构有关。其后多年病例不断积累，报道的有效率基本在这一水平。1998年美国临床肿瘤年会（ASCO）国际权威协作临床研究报道 37 000例乳腺癌患者的结果表明：①乳腺癌术后辅助三苯氧胺（TAM）治疗可以明显降低复发率、死亡率；②TAM对绝经后患者有效，绝经前患者也有一定疗效；③ER阳性患者用TAM效果最好，ER不明的患者也有效；④辅助化疗后加用TAM，能进一步提高疗效；⑤延长服药时间能提高疗效；⑥服用TAM明显降低对测乳腺癌发生率；⑦长期服用TAM会增加患子宫内膜癌的风险。
乳腺中存在ER和PR,当乳腺上皮细胞发生癌变时,ER、PR会部分或全部缺失。如果乳腺肿瘤组织仍表达这两类受体,表明该肿瘤细胞仍受内分泌调节,仍可采取内分泌治疗。据文献报道,乳腺癌ER阳性率约为50%~80%,PR阳性率约为50%。两种受体对于指导治疗、疗效预测及预后评价有很大价值。ER和(或)PR阳性患者较ER和(或)PR阴性患者有较好的预后,前者的5年及10年生存率均高于后者,且前者接受内分泌治疗较后者有更好的疗效。

在今年的ASCO会议上,Roche报告了一项Ⅲ期临床试验(PACS01)结果,对1190例淋巴结阳性、可手术的乳腺癌患者进行的的回顾性分析表明,ER+/PR+和ER-/PR+患者较ER-/PR-或ER+/PR-患者的临床转归更好(P值均<0.001);Bhatia等报告的研究结果同样证实了 ER阳性乳腺癌患者较阴性患者具有更好的预后,但这种优势在非裔美国人中却并不明显。
二、PS2基因
PS2蛋白是Masialowski于1982年从激素依赖性乳腺癌MCF－7细胞株中提取出来的雌激素诱导蛋白之一，在乳腺癌中表达阳性率约为43％～58％。PS2基因受雌激素调节和控制，在雌激素诱发和控制下才能转录，产生PS2蛋白。换言之PS2依赖于ER的存在。可以认为，PS2基因的存在与ER、PB存在着密切正相关关系。Gion研究446例原发性乳腺癌，观察PS2与ER、PR关系。结果68．5％ PS2阳性病例，其ER、PB均阳性；而PS2阳性其ER、PR均阴性者不足3％。Gillesby等报道ER（＋）者中有59％，PR（＋）者中有60％ PS2呈阳性。大量研究表明，PS2蛋白可以显示功制性雌激素调节系统，能更好的指导临床抗雌激素治疗。目前认为PS2对判断预后及指导内分泌治疗均有价值，阳性者预后好，复发率及死亡率均较低，且内分泌治疗有效。作为内分泌治疗效果预测的指标，PS2可以补充ER、PR的不足，甚至有学者认为PS2更优于ER、PR。如果将三者结合使用，可达到相当满意的效果。当三项均阴性时，内分泌治疗很少有效，预后甚差。
三、c－erbB－2癌基因
c－erbB－2癌基因是乳腺组织细胞中较常见而易激活的原癌基因。在多种腺癌细胞中此癌基因均有高水平表达，报道最多的是乳腺癌。c－erbB－2癌基因的异常表达扩增见于25－30％的原发性乳腺癌病例，并且仅限于癌细胞，而不出现于正常乳腺上皮。c－erbB－2扩增与雌、孕激素受体表达呈负相关，与肿瘤级别较高有关。c－erbB－2基因表达阳性者可使ER阳性病人对内分泌治疗的反应率降至20％；ER阴性病人内分泌治疗几乎无效。c－erbB－2癌基因的扩增或过度表达还与乳腺癌的复发、转移及生存期明显相关。过度表达者其术后早期复发率和远处转移率增加，生存期缩短，淋巴结阳性的乳腺癌c－erbB－2的过表达是预后不良的重要因素。另有研究表明，乳腺癌c－erbB－2表达阳性病例其瘤肿往往大于2cm，因此推测其蛋白产物p185过量表达可能与肿瘤的生长速度有关。因而c－erbB－2的强阳性表达可作为识别早期乳腺癌的有效指标。
近年来有人提出四联检测，包括ER、PR、PS2以及c－erbB－2。ER、PR、PS2阳性表达的乳腺癌激素治疗的敏感性高，无c－erbB－2基因过度扩增的乳腺癌同样治疗敏感性增加。相反，前三者阴性而后者阳性的乳腺癌，通常其复发率、死亡率均高，预后差。
erbB-2是一种原癌基因,该基因编码一种跨膜糖蛋白HER-2,参与调控细胞的生长、增殖及分化,是公认的重要肿瘤分子标志之一,其过度表达是多种恶性肿瘤的的表型,现也被广泛用于乳腺癌的预后评价及指导治疗。Slamon等认为,除了淋巴结转移情况这一因素外,erbB-2是乳腺癌预后评价中最有价值的分子标志。erbB-2高表达提示预后不好,许多研究显示,erbB-2高表达乳腺癌患者对蒽环类药物较敏感,CMF方案难以取得预期的效果,随后的治疗宜选用含蒽环类药物的化疗方案,如选用CAF(环磷酰胺、多柔比星、氟尿嘧啶)方案作为一线化疗。erbB-2(HER-2)检测用于指导曲妥珠单抗的治疗已写入NCCN治疗指南。

在今年的ASCO会议上,Roche等的回顾性研究还显示,在1190例淋巴结阳性,可手术的乳腺癌患者中,erbB-2过度表达者的无病生存期(DFS)及总生存期(OS)均较不表达患者差(分别P=0.0002和P<0.0001)。erbB-2高表达患者的术后辅助化疗中,选择蒽环类+多西他赛将使生存受益,Learn等的研究提示,erbB-2表达情况可用于预测新辅助化疗中加用多西他赛的疗效。Vizio等采用组织芯片技术进行的研究也表明,erbB-2是一个可靠的预后评价指标。
四、p53抑癌基因
p53是一种抑癌基因，是人类研究最多的基因，分野生型（Wtp53）和突变型（Mtp53）。Wtp53在正常组织内含量低，半衰期短，仅30～60分钟，而免疫组化的敏感性无法检测如此微量的抗原成分。当p53突变后，能和进入组织内的各种病毒蛋白、Wtp53蛋白、正常等位基因蛋白和热休克蛋白等结合形成稳定的复合物，在组织内的半衰期长，含量逐渐积累，为免疫组化的检测提供了条件。其阳性表达率约２５％－３５％。Wtp53在正常组织中能参与细胞从G0期进入G1期的负调节。从而控制细胞的增生，同时诱导细胞的程序性死亡。当p53突变后则丧失了启动细胞凋亡的能力，结果使肿瘤细胞数目增加，从而使细胞呈现无休止生长而凋亡受到抑制。在乳腺癌增生过程中有Mtp53基因表达，并随着非典型增生程度的增加而增加。p53表达水平与细胞的高度增生及肿瘤细胞的分化程度有关，分化越低恶性程度越高的肿瘤，p53基因水平越高。p53基因蛋白阳性和ER阴性的乳腺癌患者预后不良，生存期短。Kai等报告,p53过度表达提示对第三代芳香化酶抑制剂疗效不佳,该指标可能成为确定激素受体阳性绝经期后妇女内分泌治疗的一个重要因素。Do等的研究结果也验证了p53可做为淋巴结阳性浸润性乳腺癌患者的一个独立的预后评价指标。
五、nm23
nm23又称为抗转移癌基因，是一种抑癌基因，产物是由152个氨基酸组成的蛋白质，与二磷酸核苷激酶（NDPK）的氨基酸序列具有高度同源性。人类nm23基因有2个亚型：nm23H1和nm23H2，两者有88％同源性，nm23H1与乳腺癌的预后关系更密切。nm23蛋白具有NDPK功能，通过影响微管聚合而调节细胞运动，并通过影响G蛋白的信号传递而发挥负向调节作用，从而抑制肿瘤转移。但其作用并不依耐于NDPK的活性。有实验结果表明，与转移潜能有关的是nm23NDPK的表达水平而不是NDPK的活性。nm23是独立预后指标，其表达与年龄、肿瘤大小、ER、PR和C－erbB－2无关，与淋巴结转移状况、组织学分型、分级及临床分期均有显著关系，nm23高表达者的预后明显好于低表达者。nm23表达降低的乳腺癌分化较低，ER表达水平低，并常常出现淋巴结转移，预后不良。在乳腺癌进展过程中，nm23的表 达水平降低。通过检测nm23可以把腋淋巴结阳性病人中可能发生远处转移和腋淋巴结阴性病人中有潜在高转移倾向的病例筛选出来，进行相应的预防性治疗，从而提高治疗效果。
六、多耐药（MDR）基因
肿瘤细胞耐药是化疗失败的主要原因，引起耐药的重要原因之一是多药耐药性，即肿瘤细胞接触一种抗癌药物产生耐药性后，对多种结构和作用机制不同的其它抗癌药也产生耐药性。多药耐药（MDR）基因的产物P糖蛋白（P－gp）是一种跨膜蛋白，作为“药泵”功能引起癌细胞产生耐药，它具有膜转运蛋白的许多结构特征，一旦与抗癌药物结合，在ATP供能下，将药物由胞内泵出胞外，因而胞内药物浓度不断下降，以致无法发挥细胞毒作用，出现耐药性。阳性表达的细胞对化疗剂尤其是蒽环类和长春花碱类及阿霉素等化疗剂，具有固有和获得性耐药。P－gp表达可见于高度固有耐药的肿瘤，在这些肿瘤，P－gp的高水平表达亦见于产生这些肿瘤的正常组织。对化疗敏感的肿瘤通常P－gp表达率低，那些对系统化疗最敏感的实体瘤（精原细胞瘤和胚胎性癌）很少出现P－gp表达，曾接受过化疗患者发生的肿瘤常有P－gp表达增强。检测P－gp表达有助于确定可能对常规化疗耐药的肿瘤，从而提供适合于这些病人合理的替代治疗方法，对肿瘤病人选择化疗方案和预后的判断具有重要的临床意义。
拓扑异构酶II与TopoII有关的MDR称为非典型的MDR(at-MDR)不同的抗癌药物通过TopoII诱导产生的DNA断裂位置不同，直接影响到体内与细胞增殖有关的基因。与TopoII有关的MDR具有如下特点，①对许多天然来源的抗癌药物呈现抗药性，但对长春碱类药物则不呈现交叉抗药性；②膜活性药物（如VRP）不能逆转抗药性；③药物在细胞内积聚与保留没有变化；④未见P-gp过度表达及MDR基因扩增；⑤TopoII数量及活性均有所下降，但各亚型在MDR中的作用还有待进一步研究证实。

笔者注：Topo II介导的MDR开成的主要机制有(1) Topo II基因的点突变或缺失；(2) Topo II磷酸脂化水平提高；(3) Topo II酶水平的降低；(4) Topo II alpha, beta同功能酶比值发生改变。
七、血管内皮细胞生长因子（VEGF）
血管形成在肿瘤生长、浸润、转移中起关键作用，它受到一系列促进和抑制因子的调节，其中最重要的促进因子之一是肿瘤细胞在生长过程中分泌的VEGF，它的编码基因位于6P21.3，由8个外显子构成，由于mRNA不同的剪切形式，形成5种不同的VEGF，分别含有121、145、165、189、206个氨基酸，其中以VEGF165最重要，在各种细胞中表达占优势，VEGF121和VEGF189在大部分表达VEGF的组织和细胞中均能检测到，VEGF145和VEGF206非常少见，其中VEGF206只在人胎肝 cDNA 库中可以检测到。VEGF通过二硫键结合形成二聚体后才有活性，它的受体为酪氨酸蛋白激酶型膜受体，具有高度特异性。当VEGF与受体结合后，可以刺激血管内皮细胞增殖，促进血管形成，并增加血管通透性，这样肿瘤细胞一方面可以获得充分的营养而迅速增殖，另一方面也容易通过血管内皮细胞进入血流从而发生远处转移。VEGF主要由肿瘤细胞产生，小部分来自细胞间质，它是独立预后指标，与年龄、绝经状态无关，与ER、PR呈负相关，高表达者易转移复发，预后不良，且内分泌治疗和化疗的效果差，建议对VEGF高表达者联合应用抗血管生成治疗，如利用VEGF单抗阻断与受体结合，重组VEGF与VEGF竞争受体，将VEGF与小分子毒性物质结合，利用反义核酸技术抑制VEGF表达等等，VEGF单克隆抗体阿瓦斯汀、伊利替康。
实验表明,循环中的VEGF是预后指标,高表达者易发生转移复发,且该指标可用于指导治疗。在今年的ASCO会议上,Ghosh等报告,VEGF在乳腺癌组织中的表达明显高于基质,而且与一些预后不良因素相关,高表达患者在20年生存上提示预后不良。Ryan等对399例乳腺癌患者的检测分析显示,VEGF表达与新的肿瘤标志物生存素(survivin)的表达呈正相关,survivin表达增加提示乳腺癌患者预后不良。Traina报告了一项来曲唑+VEGF单克隆抗体贝伐单抗治疗激素受体阳性转移性乳腺癌患者的研究,在此研究中,通过检测组织中的VEGF来指导治疗并评价与疗效的相关性。。
八、肿瘤细胞增生标志物
目前被广泛采用的两种增殖相关标志物是Ki－67及PCNA（增埴细胞核抗原）。PCNA （增殖细胞核抗原）：是一种仅在增殖细胞中合成或表达的核内多肽，其表达与细胞周期有关。主要表达于增殖细胞的S期、G1期和G2初期。Ki－67与PCNA一样，为细胞增殖的一种标记，在细胞凋亡中S、G2、M期均有表达，G0期缺如。Ki－67增殖指数高低与许多肿瘤的分化程度、浸润、转移以及预后密切相关。Ki－67与PCNA免疫反应性与细胞增生的形态学特征关系密切，特别是与有丝分裂数及肿瘤分级相关。在乳腺肿瘤中，其表达还与其他分化及预后指标相关，如与雌孕激素受体表达呈负相关，而与P53基因异常呈正相关。在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌、胃癌和一些淋巴瘤及肉瘤，采用Ki－67与PCNA免疫组化分析，均显示有增殖证据，提示这些肿瘤病人更容易进展。高Ki－67及PCNA标记指数的病人无病生存率及总生存率明显下降。
九、p27抑癌基因

研究表明,p27是乳腺癌的一个独立的预后标志,p27低表达与TNM分期晚、淋巴结转移、局部复发、远处转移相关,而且p27低表达与生存期短、预后差显著相关。在今年的ASCO会议上,Porter等采用组织芯片技术进行的研究表明,在接受AC方案化疗的乳腺癌患者中,p27不表达或低表达均提示在OS和DFS上预后不佳。