关节软骨细胞生存微环境的研究

关节软骨细胞生存微环境的研究

李 伟 肖德明

提要：滑液环境、低氧环境、基质环境、力学环境对软骨细胞生存的影响最大，并且调节着其基质的合成。认识它，对于理解和治疗因软骨细胞生存的微环境而引起的骨关节炎、类风湿关节炎等骨关节病有重要意义。

关键词:软骨细胞 生存 微环境

软骨细胞处于细胞外基质之中，软骨基质之外是滑液、关节滑膜等构成的关节腔，关节腔之外还有肌肉、肌腱等等，它们共同构成关节，也构成软骨细胞生存的关节微环境。随着对骨关节炎、类风湿关节炎及功能性软骨组织工程等的认识，对其研究日益深入。

1、滑液环境

1．1滑液

滑液(synovial fluid，SF)由滑膜产生，实际是血浆渗出液，为清亮、微黄的粘液，弱碱性，但有些成份也高于血浆。软骨依靠高浓度的VitC水平来合成胶原,Stabler等^[1]在猪的关节中就发现SF的抗坏血酸维生素C(Ascorbic acid ，VitC)高于对应的血浆水平，软骨内的VitC高于对应的滑液水平。正常软骨内的VitC浓度以介于肝(最低)和肾上腺(最高)的VitC浓度之间。这种高浓度的VitC主要依靠软骨的SVCT2(一种钠依赖性的VitC通道)的表达来获得。

SF主要为软骨细胞的合成提供营养，较培养基有独特作用。Lee等^[2]分离牛软骨细胞并在正常的SF中培养，与对照组比较，正常的SF中培养的牛软骨细胞有高水平的GAG的合成和低水平的细胞分化能力，这达到与体内软骨细胞功能相同。

血液中的因子还能通过SF作用于软骨细胞，如机体的运动可改变SF的成份变化(可能通过改变SF中IGF-I的含量，但它不可能是唯一的因子)，可以部分地影响软骨细胞的代谢活性，从而提高多糖的合成和减少多糖的崩解, 影响软骨基质中多糖含量的变化 ^[3]。

SF还具有理想的润滑作用，不但磨擦系数极低，而且有高表面张力的特征，

作者单位: 518020 深圳 暨南大学医学院附属二院骨科

作者简介：李 伟 (1976- )，男，医学硕士在读；住院医师；研究方向：骨折内固定与生物力学研究

即使在强大的压力下，仍能在两关节面之间保持一薄层SF，而使两软骨面不直接接触，从而减少压力对关节和软骨的磨损。

1．2滑膜

滑膜产生的重要物质透明质酸(hyaluronate acid ,HA)主要由滑膜内衬层细胞产生。正常浓度及正常属性的HA对维持关节功能起着重要作用，它能与糖蛋白结合附着于关节软骨表面,保护关节软骨，能与蛋白质结合并游离于关节液中起润滑作用。而且以HA为主的聚合体有修复软骨的能力，体外的软骨组织工程实验也显示HA藻酸钠海绵体的支架，更适合组织软骨的形成^[4]。

正常的滑膜是保证关节软骨细胞生存的重要微环境，相反滑膜的炎症打破微环境，将直接危及到关节软骨细胞生存。在骨关节(osteoarthritis,OA)患者的滑膜组织，分泌大量IL-1 (正常的滑膜细胞只产生微量的IL-1), IL-1刺激滑膜增生，增加细胞因子分泌，进一步加重OA病变的进展^[5]。IL-1引起软骨分解的主要机制在于介导金属蛋白酶组织抑制因子与金属蛋白酶之间失衡，导致金属蛋白酶大量生成，破坏胶原纤维 ^[6]。同时，IL-1也引起软骨下骨的损伤性或反应性的改变。IL-1还可刺激滑膜成纤维细胞增殖，促进滑膜细胞与炎性细胞反应性增强^[7]，使关节力学特征因滑膜纤维化(甚至瘢痕化)而改变，也造成滑膜的血管通透性下降，阻碍滑液与血浆正常的交换，使关节软骨生存的微环境进一步恶化。

2．低氧环境

低氧环境是软骨细胞生存的重要的微环境，软骨细胞对低氧环境有良好的适应能力。软骨细胞的整个代谢在一个低氧分压下(从表面的10%到深层的<1%)进行，所以软骨细胞内没有丰富的线粒体，能量大部分来自糖酵解，即使这样，仍能合成胶原纤维、蛋白多糖、非胶原蛋白、糖蛋白等，表现出活跃的代谢特性。Hansena等^[8]研究表明减少氧分压比在21%氧分压下更能刺激软骨细胞的增殖和II型胶原、IX型胶原的分泌，延迟I型胶原的表达，有利细胞表型的稳定。

软骨细胞对低氧环境的适应大部分通过基因调节来实现。氧就是一种重要的基因表达调节因子，主要通过缺氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)（是细胞在缺氧条件下产生的具有转录活性的核蛋白,它能够与靶基因相结合,通过转录及转录后的调控,使机体的对缺氧、缺血产生适应反应）的激活来调节。在正常氧的条件下，HIF-1α能在人正常的软骨细胞和OA的软骨细胞培养中也表达；在低氧和TNFα处理的培养液中，HIF-1α能使关节软骨里进一步诱导或稳定，它相对高的表达可能是软骨细胞在低氧环境下的一种重要的适应^[9]。Charles等^[10]也发现当软骨培养在一个低氧分压范围内(<0.1%–20%)，许多重要的合成代谢基因在低分压氧中上调，如TGF和相连组织的生长因子。软骨细胞通过HIF-1 和激活蛋白-1(activating protein-1,AP-1 )（是一种核转录因子）的高度表达，并且AP-1在缺氧情况下表达增强，它也反映了软骨细胞在转录水平上对低氧环境的适应。

还有一些细胞因子的参与，Grimshaw等^[11]发现在氧的低分压下软骨细胞的培养中，IL-1β，TGF，组织生长因子都上调，而β-整合素、胶原蛋白II(COL2A1)都下调，但蛋白聚糖mRNA的水平没变。

虽然软骨细胞对低氧环境有一定的适应能力，但在氧分压过低的情况下，也会影响细胞的胶原和糖胺多糖(glycosaminoglycan，GAG)的合成量。Murphy等^[12]在体外软骨细胞培养中，发现在每个培养基上和每个细胞成份中，胶原和GAG合成量在低氧分压下较少。特别是，在1%的氧浓度中，基质的GAG成份达到一个稳定的水平，在以后的二周内没有增加。然而在20%的氧浓度中，基质的GAG成份随时间而增加。可以断定氧气浓度在细胞外基质大分子合成上有重要的影响。

3．基质环境

关节软骨由软骨细胞和细胞外基质(Extracellular Matrix, ECM)构成，前者占软骨组织的5%，后者占90%，后者构成软骨细胞接触的基质环境。软骨细胞为维持ECM的结构和功能的性质，通过分解代谢和合成代谢的细胞因子来调节保持其平衡。根据细胞的调节功能，可以把细胞因子分为分解代谢的细胞因子，增加ECM的分解，包括：IL-1， TNF-α， IL-17， IL-18， OSM；抗分解代谢或抑制分解代谢的细胞因子，它能抑制或对抗分解代谢，包括：IL-6， LIF，IL –11；合成代谢的细胞因子，它是软骨细胞生长和分化因子，能增加合成的活性，包括：IGF-1，TGF-β1,2,3， BMP-2,4,6,7,9,13；还有几种调节细胞的活性细胞因子，包括；IL-4、IL-10 、IL-13、IL-1ra。不同细胞因子形成网络并相互作用，形成保持一个抑制和刺激效应平衡的调节系统 ^[13]。

关节软骨还依靠大量的自分泌因子维持软骨细胞的表型和基质的代谢,这些因子通过协同刺激和反馈调节,对关节软骨细胞起最重要局部调节作用。如当损伤或疾病引起软骨基质降解时，IGF1、TGFβ、FGFs和BMPs便是软骨细胞最重要自分泌生长因子。甲状旁腺激素有关蛋白作为旁分泌因子,不但在软骨膜细胞中,而且在关节和骨骺软骨细胞中也高水平表达，也对关节软骨细胞功能起重要调节作用。生长因子还可抑制分解因子的效应，维护基质平衡，像TGFβ能刺激软骨细胞的胶原和蛋白多糖的合成，减少IL-1促进金属蛋白酶的活性，抵抗IL-1对基质的抑制和分解效应^［25］。

很多实验证明，在基因水平上，转录因子Sox9调控着软骨基因，在体外细胞的培养中，如果细胞没有Sox9的表达，将无法形成软骨组织，但加入了细胞基因的诱导剂，如TGFβ和地塞米松，也能形成软骨组织^[14]。

基质环境中最重要的成份是蛋白聚糖和II型胶原纤维构成的蛋白聚糖聚合物，它是蛋白多糖类结构最为复杂的一种,是由HA、蛋白多糖单体和连接蛋白共同组成的一种结构庞大的聚集体。在压缩到它们外形的30%的长度，蛋白聚糖聚合物显示抵抗力 ^[15]，而HA只有在压缩到它们的外形的5%长度时才显示抵抗力。在蛋白聚糖聚合物中最重要的是GAG侧链（主要由硫酸角质素和硫酸软骨素组成），对平衡关节软骨的压力弹性系数起50%–75%的作用^[16]。这个基质的环境对于软骨细胞适应力学环境有重要意义。

4．力学环境

如果关节在固定、没有运动或异常高压力环境下，易产生OA。如果在软骨接触压力降低，易导致软骨软化，主要由于低应力致使软骨细胞变性,蛋白多糖合成量减少;与此同时,软骨细胞释放胶原酶等降解蛋白多糖,使软骨蛋白多糖含量进一步减少。而且由于关节软骨没有像血液循环那样的营养交换系统，只有滑液交换，此时压力便是其交换的重要动力。很多实验也证实力学环境是关节正常生存的必要条件之一。

4．1关节周围结构

在每天的日常活动中保护软骨避免受伤的关节周围结构包括肌腱、韧带、关节囊、和机械性刺激感受器。软骨下骨也可能包其中。当有关节负荷时，肌肉和肌腱能调整正确的张力和位置使负荷布满整个关节表面，或减少负荷作用于关节的频率。机械性刺激感受器能提供肌肉、肌腱、韧带、关节囊正确的信息来确保它们调节到保护性位置。韧带和关节囊也限制了关节的移动。软骨细胞就依靠这些系统来把负荷分布在整个关节表面和保护其免受突然的冲力。许多研究者认为软骨下骨有很强的吸收震荡的能力。不稳关节的软骨下骨密度增高，软骨下骨硬化，使软骨下骨失去作为一个“震荡吸收器”的作用。在关节软骨和软骨下骨之间形成陡然的硬度变率，使得反作用于关节软骨的应力增大，是软骨破坏的重要原因。

4．2 软骨表层

在关节软骨中，软骨表层有软骨表层蛋白(superficial zone protein， SZP)，它是糖蛋白的同源物，IL-1抑制了SZP的合成，TGF-β和IGF-1增加了它的合成。SZP有细胞保护、润滑的特性^[17]。Wong等^[26]实验显示软骨在压力下表面层在软骨各层中承担主要的滑液渗出和压力(在60%左右)，然而放射层承担极少的滑液渗出和压力。这些显示软骨表层对软骨细胞维持力学平衡也有重要的作用。

4．3 软骨的生物力学性能

从生物力学性能角度可以把关节软骨看作有机基质和水的二相材料，承载时软骨的性能取决于基质性能和渗透性，渗透性为液体流过软骨基质时的摩擦阻力。随着关节软骨的受压，软骨变形逐渐增大，其渗透性也逐渐降低，液体便不易流出，相反当压力减少，液体便易流出。这个反馈机制对关节的营养、润滑、承载和摩擦至关重要。同时Jurvelin等^[18]显示人关节软骨在压力下是各向异性的，即软骨表面平行和垂直的压力刚性有明显差别，压力下的平衡系数比张力下的平衡系数低,它有利于受压组织变形.这个各向异性可能成为理解正常关节软骨生物力学性能的关键。

4．4渗透压变化的环境

软骨基质的蛋白聚糖具有伸展的结构(60nm) ,使其在组织中占据较大空间, 在生理PH值上有很高的电负荷（主要是Na+）,能结合了大量水分子。在机械压力下，水从组织中排出，而保留了Na+，使软骨细胞处于高渗压下。相反在压力消除后，渗透压迅速降低，形成一个渗透压变化极大的环境。在体外实验中，所有的软骨细胞在高渗的环境里萎缩，在低渗的环境里膨胀。Bush等^[19]发现原位的牛关节软骨细胞在180mOsm 或250mOsm低渗液中，细胞迅速膨胀(在大约90秒内)。软骨细胞然后表现出迅速的调整容量减少 ( Regulatory volume decrease ，RVD)， 软骨各区的细胞在8分钟内增加1/2，但在以后的20分钟只达到它们最初的容量的3%。这种表现在分离的软骨细胞有同样的效果。它反映了软骨细胞对渗透压的变化有极强的适应力。

关节对机械力学的反应是通过高渗压变化作用于软骨细胞，软骨细胞发生RVD。RVD也可能是一种信号(RVD的反应能被REV 5901所抑制^[19])，从而引起细胞内广泛的基因调节的变化^[20]，合成基质来适应环境需要^[21]。

细胞外微环境的成份和结构的完整性也是保证软骨细胞对渗透压正常反应的条件之一。Hing等^[22]发现对经过机械萃取软骨素的环境中培养的软骨细胞对渗透压的RVD最小，分离培养的软骨细胞开始对渗透压的RVD最大，但随着时间而下降；经过酶萃取软骨素的环境中培养的软骨细胞对渗透压的RVD处于其中，随着微环境的增大而下降。显示在有关节负荷作用的微环境中培养的软骨细胞能更好调节对渗透压正常反应。

但在过高渗透压下，软骨细胞会出现凋亡现象，并且损伤因子能致使软骨细胞生成大量细胞因子打破了基质的平衡，促使软骨细胞丢失。相反，由于在低渗压中，肌动蛋白迅速脱位和重新联结而使粘弹性改变，软骨细胞的弹性和粘性降低，丧失了一些对力学对抗的特性^[23]，但在高渗压下没有弹性和粘性的改变。

5、问题与展望

随着对骨关节的免疫学、生物力学以及软骨组织工程研究的进展，对关节软骨的生存环境有一个全新的认识，并且对软骨力学机制和软骨的细胞因子的相互作用的研究也在增多^[24]。但是对软骨细胞的微环境的认识还只是一个开始，对于它各种环境的相互关系以及对于各种关系的影响因素等等，还有待进一步探讨。随着软骨细胞生存的微环境的认识的深入，将对OA、RA的预防和治疗、组织软骨的构建带来新的方法和手段。如对滑液的补充疗法，给予关节腔注射维生素C、HA等，对基质的补充疗法，给予关节腔注射GAG等，在生物反应器中行软骨组织培养等等已有了一些新的探索。

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