白血病干细胞及其相关治疗进展（中）

作者：刘加军 中山大学附属三院血液科

靶向治疗的靶点表达在LSCs上的同时，也可能表达在任何正常细胞；因此，为了能使基于LSC的靶向治疗获得临床应用，这种治疗方式的毒性一定要在可接受范围内^[2]。研究显示，基于LSCs的异质性，一些推定的LSCs标记至少在部分LSCs中不表达，这也使得单一靶向治疗不可能对所有AML患者都有效^[13]。尽管已经提出有一些细胞表面标记可以作为潜在LSC相关靶向治疗靶点，但都没有得到临床上的完全证实^[2]。

CD33是唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素（sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins，SIGLECS）家族的一员，SIGLECS是免疫球蛋白超家族的一个重要分支^[2]。CD33是一个髓系标记，从正常的造血祖细胞到成熟粒细胞和单核细胞都有表达^[2]。但也有争议，很多数据表明CD33没有表达在多潜能造血干细胞表面^[14]。CD33在大多数AMLs中都有表达，而且它在白血病祖细胞中的表达水平比在正常髓系祖细胞中更高。一些病人的LSCs也被发现表达有CD33^[15]。

ALDH是一组具有相同序列的细胞内酶，参与蛋白伴侣活动，并与维甲酸和活性氧（reactive oxygen species ROS）的代谢有关。数项研究表明ALDH尤其是ALDH1对于维持正常造血干细胞的生理起着至关重要的作用，影响着HSCs与骨髓微环境的相互作用以及HSCs的自我更新、分化、细胞内解毒和抗药。

ALDH也参与白血病的发展。敲除范可尼贫血小鼠模型的ALDH2基因，可使其自发产生急性白血病；ALDH1A1和ALDH3A1的缺失促进处于NUP98-HOX10同源融合蛋白治疗中的AML的发展。尽管这些结果提示ALDH基因的缺失可能潜在促进急性白血病的发展，AML幼稚细胞内高ALDH水平却与增强白血病细胞植入NOD/SCID能力以及更坏的临床预后有关。许多研究表明ALDH与其它标记物一起可以识别LSCs^[2]。

CD123（IL-3α受体）在多种造血干细胞来源的CD34+细胞表面都有表达，这些来源包括胎儿肝、脐带血、外周血和骨髓。CD123的表达上调与刺激这些细胞的生长有关。许多研究已经评估了AML中表达的CD123的作用，AML中过表达的CD123时常与FLT3-ITD和NPM1突变有关，并对临床预后有负面影响^[2]。

有些研究专注于探索CD123的表达在LSCs中的作用。Jordan et al.发现大多数幼稚的AML细胞样本中的CD34+CD38−细胞都过表达CD123，并且具有植入NOD/SCID小鼠的能力，正常骨髓中的CD34+CD38−细胞低表达CD123^[16]。Testa et al.在随后的研究中发现，45%的AML病人的CD123过表达，过表达CD123的幼稚白血病细胞具有更高的增殖活性并具有抗凋亡能力，这些抗凋亡能力是通过灭活生长因子和上调STAT5信号转导通路实现的^[17]。

这些研究表明尽管CD123的过表达在AML中并不一致，但它显然与干细胞特性有关。最近发现CD34+CD38−CD123+ LSCs存在于大约75%的AML样本中，这些细胞的比例可以预测AML病人的疾病是否进展以及整体生存率。这些数据提示CD123或许是最特异的LSCs标记^[2]。

C型凝集素样分子是一种跨膜蛋白，主要表达于异常的造血祖系尤其是外周血和骨髓的髓系细胞中，但在正常的CD34+ HSCs上不表达。研究证明CLL-1表达于92%的AML样本中，其中67%的CD33− AMLs表达CLL-1。随后的研究发现86%的CD34+CD38− AML样本表达CLL-1，移植入NOD/SCID小鼠的CD34+CD38−CLL-1+细胞有大量CLL-1+ AML幼稚细胞增殖。最近研究发现CLL-1表达与预后差相关。这些发现突出了CLL-1的表达对于区别LSCs和正常HSCs的作用^[2]。

CD96是免疫球蛋白超家族的一员，最初被发现表达于激活的T细胞。早期研究发现，相比于正常的HSCs，在CD34+CD38− AML细胞中CD96有显著的更高水平的表达。并且在不同的AML样本中，CD96的表达水平有显著差异。值得注意的是，只有CD96+ AML细胞有能成功植入免疫缺陷小鼠的能力，提示CD96是一个与LSC相关的标记。

最近一个关于105个急性白血病样本中CD96的表达水平的研究，再次发现AML样本中CD96表达水平的显著差异；并且CD96表达水平低于10%的病人有更高的CR。相似地，有研究证明表达CD96的CD34+CD38−CD123+ LSCs与更短的中位生存期有关。共表达三种LSC标记物(CD25、CD123和CD96)与AML病人显著低的总体生存率相关^[2]。

CD47，能够向巨噬细胞传递“别吃我”信号（与巨噬细胞表面SIRPα结合）；这种信号分子被发现在大多数原始的AML细胞、巨型肿瘤以及LSCs中高表达，在正常骨髓HSCs低表达。CD47相关靶向治疗的临床试验刚刚开始^[2]。

CD25，也被称为白介素-2α受体（interleukin 2 receptor alpha，IL2Ra），是一种在活化的T细胞和B细胞中表达的跨膜蛋白，一直被作为调节性T细胞的标记抗原。CD32，也被称为FcγRII，是在不同分化阶段的髓系细胞（包括单核细胞、中性粒细胞和树突状细胞等）中表达的表面受体，可以结合IgG。

研究发现AML病人的LSCs表达CD25和（或）CD32，保持长期多系造血功能的HSCs在分化过程中删除了上述两个表面抗原；因此，这些标记物可能成为LSCs相关靶向治疗的靶点。有研究证明CD25的表达与有害的分子突变（例如FLT3-ITD和DNMT3A突变）有相关性。CD25的表达加上细胞遗传和突变的相关信息可以提高对AML预后的判断，提示CD25可以给AML病人提供独立的判断预后信息。在大于60岁的AML病人中CD25的表达，可作为独立的标记预示着更坏的CR、PFS、OS。若病人化疗后残留的AML幼稚细胞表达CD25，则病人有更高的复发率，进行allo-HSCT的OS更低^[2]。

TIM-3最初被认为在生产IFN-γ的CD4+ Th1、CD8+细胞毒性T细胞中特异性表达。研究证实TIM-3在除外APL的大多数AML的LSCs都有表达，但是在正常的HSCs中不表达。TIM-3的表达似乎可以区别LSCs与正常的HSCs，但是它在LSCs中的表达具有异质性^[2]。在LSCs中TIM-3的表达似乎与更好的预后以及对化疗敏感相关^[18]；因为LSCs表达的大部分抗原标记物都与更差的整体预后相关，所以这个发现显得很特别，不过这种关联的真实性也需要进一步的评估。

区分LSCs和普通HSCs的抗原标记物的发现，促使人们研究可以消除LSCs的同时豁免正常HSCs的新型靶向治疗方式。迄今为止，大部分这些靶向治疗的研究停留在临床前期的评估阶段^[2]。此外，如前所述，LSCs的异质性也影响上述靶向治疗的效果，一种单一的靶向治疗不可能对所有的AML病人都有效。

大多数临床研究在观察新的靶向药物活性的时候，以“反应”作为观察的终点。但是“反应”与否测量的是所有白血病细胞，它可能会高估或低估了新型靶向药物对LSCs的作用。因此有学者提出使用长期无病生存作为临床上衡量LSC活性的手段^[19]。最后，在临床背景下评估这些药物，对于确定他们的副作用和毒性至关重要。

CD33或许是临床上研究最多的推定的LSC标记抗原。靶向攻击CD33+细胞的治疗，在复发和年长AML病人中都表现出不错的效果。尽管CD33靶向治疗能够提高临床缓解率，但并不改善整体生存率；这也提示CD33可能主要表达于分化的白血病细胞，而不是LSCs^[20]。

此外，鉴于CD33在造血祖细胞中的普遍表达，CD33靶向治疗出现全血细胞减少的副作用似乎在所难免。有趣的是，在细胞遗传学分型低危组的AMLs中，CD33靶向治疗可以改善病人的整体生存率。这些数据也为低危型AMLs起源于相对分化成熟的CD33+造血祖细胞提供了额外的证据；同时也进一步印证高危型AMLs的LSCs起源于CD33−的造血祖细胞^[2]。

多项研究表明CD123可能是理想的LSC靶向治疗靶点。几乎不管什么表型的LSCs都表达CD123，但正常的HSCs很少表达或不表达。此外，体外靶向攻击CD123清除LSCs，对HSCs无作用^[2]。

最近的临床前研究数据也证实了SGN-CD123A，一种抗CD123抗体，能够结合CD123+ AML细胞并诱导DNA损伤、细胞周期改变、细胞凋亡^[21]。

类似地，相关研究证明CSL362，一种高度亲和的结合CD123的单克隆抗体，在体外对CD34+CD38−CD123+ LSCs具有显著的抗体介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell cyto-toxicity ，ADCC），这种毒作用是由自然杀伤细胞（NK细胞）介导的^[22]。

特别地，CD3xCD123是一种双亲和重靶向（dual-affinity retargeting，DART）抗体，在体内和体外都表现出一种剂量依赖性的T细胞介导的杀灭AML细胞和原始幼稚AML细胞的作用^[2]。最近，Bonifant et al诱导T细胞分泌CD123/CD3双特异性衔接分子，并将这些T细胞注入具有AML异种移植物的小鼠中，结果成功将造血正常化，获得了显著的生存受益^[23]。

有临床前期数据证明，嵌合抗原受体（CAR）T细胞靶向攻击CD123用于治疗AML是有效的^[2]。现在，许多早期临床试验都在进行中，旨在评估不同CD123靶向治疗方法的临床获益。

类似的技术也被应用于靶向攻击CLL-1，因为这种蛋白，与其它LSC标记物相比，在正常造血细胞中不表达，因此可以利用它靶向攻击白血病细胞，并且可以较好地恢复造血功能。特别地，在体外和体内的AML模型中评估了一种双特异性抗-CD3/抗-CLL-1抗体，在减少AML细胞方面展现出不错的前景^[2]。

Laborda et al.设计了抗-CLL-1 CAR T细胞，在体外和在广泛CLL-1阳性的异体移植物小鼠模型中，都表现出对AML细胞和原始幼稚AML细胞的强烈活性，并可以豁免正常的HSCs^[24]。类似地，Wang et al.开发了一种表达CLL-1受体的CAR T细胞，也在异种移植AML小鼠模型中表现出强烈的抗白血病细胞活性，也同时可以豁免正常HSCs，没有显著的骨髓抑制^[25]。根据这些数据，CLL-1靶向治疗看来是一项非常具有前景的治疗方式，尤其因为它在正常HSCs中不表达，但是仍需设计和开发早期临床试验来证实这些结果。

ALDH靶向治疗也可能是一个十分具有前景的治疗AML的新方式，但是ALDH在正常HSCs中的高表达，以及在LSCs中的表达差异很大，使得ALDH靶向治疗的研究极具挑战性。基于ALDH在维甲酸代谢中发挥的作用，研究发现全反式维甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）可以促进non-APL AML中ALDH int LSCs的分化，提示ATRA可能可以靶向治疗表达中等水平ALDH的AML^[2]。

双硫仑，一种ALDH抑制剂，被发现可以通过激活ROS/JNK信号转导通路、抑制NF-κB和Nrf2，来选择性诱导LSCs的凋亡。最近发现，双硫仑可以克服唐氏综合征相关AML患者的ALDH high LSCs对硼替佐米和阿糖胞苷的耐药。进一步研究表明双硫仑可以作为靶向攻击表达ALDH的LSCs的靶向治疗药物。二甲氨基硫酯（dimethyl ampal thiolester，DIMATE），另一种ALDH抑制剂，可以特异性抵抗LSCs，但不会抵抗健康的HSCs。

这些研究结果很有趣，因为正常HSCs通常高表达ALDH，据此推测ALDH抑制剂应该对正常HSCs有更强的抵抗作用，而研究结果却不然。关于出现这种状况的原因，可能是LSCs和HSCs的ALDH下游信号转导通路不同；也可能是LSCs因为DNA的损伤和对活性氧敏感，所以更依赖ALDH的作用。总之，搞清楚ALDH靶向治疗对LSCs的影响以及它对临床结局的影响十分重要^[2]。

靶向攻击其它抗原例如CD96、CD25和CD32还未做过详细评估。不过，抗CD96抗体已经证实可以促进ADCC，所以有望成为一种抗AML LSCs的新方式。MicroRNAs例如miR-330-5p，可以下调AML细胞中TIM-3的表达，但没有相关数据显示这种表达下调对AML细胞生存的影响^[2]。