结直肠癌肝转移的分子生物学标记

一，介绍

随着全身疗法对转移性结直肠癌治疗疗效的提高和有资格进行根治性切除术的结直肠癌肝转移（CRLM）患者数量的增加，仔细选择患者并进行个性化治疗以期改善预后变得越来越重要。从历史上看，传统的临床病理特征如肝转移病灶的数量和大小、原发性肿瘤的分期和淋巴结状态、肝外疾病的存在、无病间隔和血清癌胚抗原（CEA）水平已被用作生物标志物推断关于CRLM的预后数据并指导患者选择治疗方案[1]。这些预后生物标志物已用于预测重要的肿瘤学终点，例如无进展生存期（PFS），无复发生存期（RFS）或总体生存期（OS）。但是这些临床变量多已证明与肿瘤学结局不一致，最近人们越来越关注分子和遗传生物标记。实际上，对CRLM肿瘤生物学基础分子机制的迅速扩展，提供了识别具有预测预后作用的潜在分子生物标志物的新机会。在本章中，我们将探讨分子基础和临床使用CRLM的新兴生物标记物（其中包括KRAS，BRAF和PIK3CA）。

二，KRAS

KRAS是RAS原癌基因家族的成员，并起着表皮生长因子下游膜结合的GTP结合蛋白受体（EGFR）的作用。KRAS的激活反过来导致丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的激活，促进细胞生长和增殖：RAS→RAF→MEK→ERK。 KRAS突变导致该途径的持续性激活，并使肿瘤在很大程度上对抗EGFR抗体治疗无反应[2]。在30-50％的CRLM患者中观察到KRAS突变，并且KRAS是转移性结直肠癌中最具特征的预后生物标志物之一（CRC）[2,3]。 在CRC中，一系列原发肿瘤和肝转移肿瘤KRAS突变状态的一致性高达96%。因此，KRAS测试可以在原发肿瘤或转移性病变上进行[4]。 通常，KRAS突变体的状态与预后不良相关，它会使肿瘤更具侵略性，并且与具有KRAS野生型（wt）标志物的患者相比，具有KRAS突变体的患者切除CRLM后疾病复发的风险更高。例如，最近对1800名患者的meta分析表明，切除CRLM之后突变KRAS状态是独立的负预后因素，明显降低OS（HR = 2.24）和RFS（HR = 1.89）[2]。

一项大型的单一机构针对接受新辅助化疗并随后行根治性肝切除术的患者进行的研究表明，突变型RAS状态（KRAS或NRAS）与预后较差相关，并可作为CRML切除后复发的特殊模式 [3]。具体来说，与wtRAS肿瘤患者相比，突变RAS状态术后3年OS和3年RFS显著降低，分别为52％vs.81％和16％vs.34％。此外，RAS突变与疾病肺内复发风险显著增加有关。CRLM切除后3年时的肺内复发率（65％vs.41％），但肝内复发率不高。Kemeny等同样报道，与wtKRAS肿瘤相比，CRLM切除后突变KRAS状态是RFS显著降低（HR1.9；p=0.01）独立相关因素，并且与远距离骨（p=0.01），脑（p=0.05）和肺转移（p<0.01）风险增加相关，但不在肝内复发。相比之下，在一个单一机构的334名进行了肝切除术的CRML患者中，Margonis等人发现KRAS状态尽管与RFS或复发部位无关，但KRAS突变状态与降低所有患者的生存率，尤其是CRLM切除后复发的患者亚群的生存率有关（HR2.02；p=0.002）。

其他研究未能显示KRAS状态与预后的关系或是已经表明了一种与CRLM患者的结局有着更细微的关系。例如，原发肿瘤的位置可能会影响KRAS突变状态对CRML患者预后的影响[5]。最近的研究表明KRAS突变状态对CRLM行肝切除术的患者预后的负面影响仅适用于左侧原发性结肠癌，而右侧原发性结肠癌患者的RFS或OS与KRAS突变状态无相关性 [6]。

KRAS突变的预后影响也可能因具体KRAS基因位点的基因点突变和密码子情况而异。先前的分析证实了KRAS基因座第12位密码子上发生G12V或G12S点突变的患者更差的RFS [7]。另外，由Imamura等人对1075例CRC患者的研究证明了标志物KRAS密码子12突变，特别是G12V点突变的患者，与标志物为wtKRAS的患者相比，存活率更差，而KRAS密码子13突变则与预后无明显关联。随后对接受CRLM切除的患者进行的特定KRAS突变分析，其结果相似地显示出 ：与标志物为wtKRAS的肿瘤患者相比，标志物为G12V（HR1.78；p=0.05）和G12S（HR3.33;p=0.02）点突变患者的OS显著更差[8]。在复发性CRLM患者中， G12V，G12C和G12S突变对不良预后的影响更大。

考虑到RAS突变对生存的负面预后影响，RAS突变CRLM患者的治疗仍存在争议。如从前那样提到，KRAS突变型CRLM患者对全身性EGFR抗体疗法无反应，尚无直接靶向KRAS的药物。然而，在KRAS突变肿瘤患者中，血管内皮生长因子（VEGF）抑制剂仍可能发挥作用并诱发肿瘤反应。MEK抑制剂的开发和RAS-RAF-ERK信号通路的额外靶向可能为将来的治疗提供选择。RAS突变也是已知的也会影响对传统全身化疗的反应。例如，在接受CRLM切除术之前接受新辅助化疗的患者中，RAS突变状态与显著降低有关放射学反应率（11％vs.33％；p=0.006）和主要病理反应率（37％vs.59％；p=0.015），以及降低RFS和OS相关 [9]。

多项研究表明，RAS突变与wtRAS肿瘤患者相比，切除的切缘镜检阳性（R1）的风险增加（11.4％vs.5.4％，p = 0.007）和切缘阴性（R0）的宽度变窄（4mmvs.7mm，p = 0.03） [10]。同样，与wtRAS肿瘤患者相比，RAS基因突变状况与经皮CRML消融术后局部疾病的早期和更频繁的复发/进展相关，即使尝试更大的消融切缘 [11,12]。这些临床发现促使一些组织主张扩大RAS基因突变CRML的切除或消融范围，以克服KRAS突变肿瘤的更具浸润性的生长方式。然而，这种综合措施能否转化为更好的结果尚未得到证实[10，12,13]。其他数据表明，KRAS突变型CRLM切除患者的边缘清除率对不良的生存结果影响不大，因为任何切缘阴性的宽度都不能显示OS较R1切除有任何改善 [14]。

RAS突变体肿瘤更具侵袭性的细胞行为可能导致这些患者不良预后，而不是潜在的可改变的手术变量。虽然1-10mm的非解剖型肝切除术被认为是治疗的标准，但最近一项有趣的分析进一步模糊了切除范围的问题。对KRAS突变的CRML患者队列的回顾性分析发现，与传统的非解剖型切除相比，更广泛的解剖型切除可显著改善5年DFS（46.4％vs. 14.4％；p <0.001）。wtKRAS患者行解剖型和非解剖型肝切除术时，DFS无明显差异。显然，还需要对CRML患者的边缘宽度与RAS突变状态之间的相互作用进行进一步的前瞻性研究。

尽管有越来越多的证据表明RAS突变状态影响接受CRLM切除和/或消融患者的预后，但可能没有足够的研究表明RAS基因突变状态应该常规用于选择接受或不接受手术切除的指标。相反，对于经历CRLM多学科评估的患者，RAS突变状态仍然是重要的进展性生物标志物。实际上，最近的一项研究已经开发出改良的临床风险评分，该评分将RAS状态、原发结肠直肠肿瘤淋巴结状态和CRLM病变直径> 5cm等风险因素纳入其中，成为一种有效的预测CRLM切除后患者生存率的预后工具[15]。基于这一风险评分，考虑到相对wtRAS肿瘤患者的预后较差，肝外疾病的存在或较短的无病间隔可能是KRAS突变病患者切除CRLM的相对禁忌症。

三，BRAF

BRAF激酶在MAPK信号通路内的KRAS下游起作用。在微卫星稳定的散发型大肠原发性肿瘤患者中，BRAF突变的发生率为5％-10％，而在微卫星不稳定的肿瘤中，报道的发病率高达40％-60％。在CRLM切除的患者中观察到的BRAF突变的总体发生率很低，只有2％-4％。这可能是因为BRAF突变似乎与可切除的转移性疾病相关的可能性较小，并且在接受了CRLM切除的患者中，总体预后较差。然而，与KRAS突变不同，BRAF突变的患者保留了更多的系统治疗选择，因为BRAF突变似乎不会对抗EGFR治疗产生抗药性[16]。

多项研究表明，在接受CRLM切除的患者中，BRAF突变的存在与显著恶化的RFS和OS有关，一些研究表明，BRAF突变可能是比RAS突变更强的不良预后标志物 [16]。在一系列切除的CRLM患者中，BRAF突变状态是与5年OS降低相关的独立不良风险因素(HR5.18;多变量分析中p=0.002)，而KRAS状态在本队列中未显示预后意义。在CRYSTAL和OPUS随机临床试验评估西妥昔单抗加入细胞毒性化疗的益处中，对845例wtKRAS的CRLM患者汇总分析中发现，无论治疗组如何，突变型BRAF肿瘤与wtBRAF肿瘤相比，OS显著降低[16]。在突变型BRAF和wtBRAF患者中，加入抗EGFR抗体西妥昔单抗与单纯传统化疗相比均可提高生存率，但BRAF突变型肿瘤患者的OS明显低于野生型患者(p < 0.01) [16]。有趣的是，根据最近一项多机构的有条件生存的回顾性分析，BRAF突变状态对可切除的CRLM患者的影响可能随着时间的推移而变化[17]。在CRLM切除后的第一年内，突变BRAF状态对预后有深远影响，但不能维持肝切除术后12个月以上的预后差异;临床病理变量，例如切除边缘状态和肝外疾病的存在驱动第一年以后的预后[17]。

在最近的单一机构，10年的709例CRLM患者中，BRAF突变总体上在接受化学疗法治疗的患者(n=313)中比那些接受手术切除的患者更常见（n=396），（8.9％vs.3.5％，p <0.001）[12]。特别是，与可切除疾病患者相比，单独化疗的CRML患者中的BRAF的V600E突变更为常见（89％[25/28患者] vs.43％[6/14患者]，p=0.001），这反映了V600E BRAF突变与不良预后的关系 [12]。相比之下，密码子600以外的BRAF突变虽然不常见，但在CRLM患者中似乎与更有利的预后相关。在对9600例转移性结直肠癌患者的多机构回顾性分析中，208例患者(占整个队列的2.2%)发现了非V600型BRAF突变，占观察到的所有BRAF突变的22% [18]。非v600 BRAF突变与较少的右侧原发性结肠癌和较少的高级别肿瘤相关，两者都是已知的不良预后因素。与V600突变患者甚至野生型BRAF患者相比，非V600E BRAF突变患者的中位OS明显改善（60.7 vs. 11.4 vs. 43.0月，p <0.001）。不幸的是，没有足够的证据来评估非V600E BRAF突变对CRLM切除后预后的影响。目前的指南推荐对所有CRLM患者进行BRAF突变状态的评估，因为它是一种潜在的预后生物标志物，并可作为指导化疗方案的预测指标[18]。

四，TP53

肿瘤抑制基因TP53编码调节DNA修复、细胞凋亡和许多其他细胞功能的转录因子，而TP53的功能缺失突变与癌症发展密切相[19]。因此，TP53突变广泛存在于 50％–66％的CRLM患者中[20]。到目前为止，关于TP53突变对CRLM修复后生存结果的预后影响的研究已经报道出相当矛盾的结果，一些系列报道其与OS呈正相关，而另一些报道称没有相关性，甚至与不良预后相关[20,21]。

先前发表的研究中的差异可能是更复杂的分子途径的结果，其中同步、协同突变需要表现出更差的生物表型。例如，最近有证据表明，在接受CRLM切除的患者中，TP53和RAS同时发生体细胞双重突变。由Chun等人最近报道的单机构系列发现，在31％的CRLM患者中发现了TP53-RAS双重突变。虽然RAS或TP53的单独突变与较差的预后无关，但RAS/TP53双突变的存在仍是多变量分析OS降低的独立危险因素(HR 2.62,p=0.002)。

五，PIK3CA

原癌基因PIK3CA编码磷酸肌醇3激酶（PI3K）的催化亚基，该激酶控制参与细胞存活和增殖的PI3K/Akt/mTOR信号级联反应的激活[22]。PIK3CA的突变与腺瘤向浸润性结直肠癌转移有关，据报道在7–28％的CRLM患者中存在PIK3CA 突变[3]。

孤立的PIK3CA突变对CRLM患者预后的影响尚不清楚，因为一些研究表明与RFS和OS降低相关，而另一些研究则未发现预后相关[23]。此外，PIK3CA突变常发生在KRAS和/或BRAF突变的同时，这似乎对预后有更大的影响[23]。PIK3CA的突变也与全身化疗的相对耐药有关，包括在无KRAS突变的情况下也对抗EGFR治疗耐药[23]。PIK3CA位点的不同突变可能对预后有不同的影响，因为一项大型回顾性队列分析发现，PIK3CA的外显子9突变对预后没有影响，而与野生型外显子20相比，外显子20突变与应答率、PFS和OS显著降低有关[23]。PIK3CA突变和大肠息肉病（APC）基因突变似乎相互作用，导致肿瘤的生长和侵袭性显着提高。在CRLM患者中，PIK3CA和APC同时发生体细胞突变是与新辅助化疗反应降低相关的独立不良预后因素(OR2.91;p=0.002)，显著降低OS(HR3.09;与未发生双重突变的患者比较，p<0.001)。

六，APC

APC抑癌基因中的遗传或体细胞功能缺失突变是结直肠癌发生的最早步骤之一，导致β-连环蛋白的失调和Wnt信号通路过度活跃[22]。因此，APC突变非常常见，在CRLM患者中观察到的频率为42％–73％。独立的APC突变对CRLM患者的影响尚不清楚，一些研究报告预后不良，而其他研究发现与复发或生存结局没有关系。如上所述，虽然独立的APC突变对CRLM切除后预后的影响尚不清楚，但越来越多的证据表明，APC可能通过与PIK3CA等其他突变协同作用而影响肿瘤生物学[24]。

七，SMAD4

果蝇蛋白（SMAD4），是一种转化生长因子（TGF）-β信号通路中的重要成员并且已知在结直肠癌的进展中具有重要作用。大约2%-20%的结直肠癌患者发生零星的SMAD4基因突变。最近的证据发现，即使在控制KRAS突变状态后，SMAD4突变在切除CRLM后总体生存率仍显著降低[25]。

八、微卫星不稳定性

错配修复(MMR)系统由多个蛋白质组成，包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，它们的功能是识别和修复微卫星内的插入和删除，以及DNA序列中的重复单元序列。MMR系统中的缺陷（无论是偶然的还是种系的突变）都会导致微卫星不稳定（MSI）状态，从而导致突变积累和肿瘤发生。结直肠癌中散发的MMR突变(占原发肿瘤的10-20%)最常见的原因是MLH1启动子高甲基化，较Lynch综合征或遗传性非家族性息肉病大肠癌（HNPCC）综合征相关的生殖突变更常见，后者占原发结直肠癌的1-5%。

高微卫星不稳定性（MSI-H）被定义为基于免疫组织化学分析检测到的一种MMR蛋白的表达缺失，或肿瘤中微卫星标记中>30％的不稳定性。MSI-H肿瘤通常与肿瘤分化差，粘液组织学和高浓度的肿瘤浸润淋巴细胞有关，通常出现在右侧结肠。实际上，微卫星不稳定性在大肠癌的晚期并不常见，据报道，II期大肠癌MSI-H的发生率约为20％，III期大肠癌占12％，IV期大肠癌仅占4％。虽然与微卫星稳定型(MSS)肿瘤相比，II期和III期MSI-H结直肠癌的远处转移风险降低，预后改善，但这似乎不适用于IV期MSI-H结直肠癌[26]。鉴于CRLM患者中MSI-H的状态非常罕见（2.5％至4％），因此微卫星不稳定性对该患者群体的预后影响很难确定，有几项研究未能证明在CRLM中MSI-H状态与无进展生存期（PFS），RFS或OS之间存在任何关联 [27]。但是，其他研究显示，与MSS肿瘤相比， MSI-H的CRLM预后明显更差。这种差异可能是由于散发性MMR缺陷肿瘤中同时发生的BRAF突变的频率，以及其已知的不成比例的不良预后影响。

MSI状态可能影响CRLM患者全身治疗的选择。例如，虽然II期和III期MSI-H结直肠癌往往对传统的5-氟尿嘧啶(5-FU)为基础的回顾性研究具有化学反应性，但5-FU对MSI-H状态的CRLM仍有疗效。此外，针对程序性死亡-1（PD-1）受体或其配体（PD-L1）的免疫疗法已在MSI-H转移性结直肠癌患者中显示出极好的前景。Le等人在2015年进行的具有里程碑意义的II期研究显示，抗pd1抗体pembrolizumab在之前进行过全身化疗的MSI-H转移性结直肠癌患者中具有90%的疾病控制率。许多正在进行的研究正在调查免疫检查点抑制剂在CRLM和MSI患者中的作用。

九、循环肿瘤细胞

可检测的循环肿瘤细胞(CTC)存在于CRLM患者的外周血中，可能有望成为一种新的预后生物标志物。Koch等人的研究，率先证明在R0肝切除术中发现CTCs与中位DFS显著降低(13个月vs.25个月;p=0.03)。随后在2013年的一项meta分析(包括12项对转移性结肠直肠癌患者的研究，包括可切除的CRLM患者)中，同样证明CTC的存在与明显恶化的PFS相关(HR2.07;p=0.0001)和OS (HR2.47;与未检测到CTC的患者相比，差异有统计学意义(p=0.01)。CRLM患者在特定时间点的CTC水平的分析也可以作为全身治疗反应的可测量指标，并作为使用实体肿瘤反应评估标准(RECIST)的传统放射反应测量的补充工具。CTC作为CRLM患者潜在生物标志物的应用仍在积极的临床研究中。

十、结论

CRLM患者的预后生物标志物传统上包括临床病理变量，如肿瘤大小和病灶，原发性结肠癌淋巴结状态，无病间隔和血清CEA水平。这些变量中很多进而将其纳入预后列线图或风险评分中，以更好地对接受CRLM切除术的患者的复发和生存进行分层。对大肠癌发生和转移的分子途径的深入研究，使人们越来越认识到KRAS、BRAF和MMR等基因突变的重要性。除了它们的预后重要性之外，特定的突变，如KRAS状态，可能会影响系统疗法的选择、治疗的顺序或CRLM的计划切除/消融边缘的制定。随着我们对转移性结直肠癌预后的分子和遗传决定因素的理解不断扩大，这些分子生物标志物在CRLM个体化治疗中的重要性将不断增加。

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