PACAP调节LPS激活的树突状细胞免疫功能

PACAP调节LPS激活的树突状细胞免疫功能

陈学清¹，肖冰²，刘思德²，张亚历²，姜泊²，李明松^2＃

1广州医学院第一附属医院消化内科，广州 510120

2南方医科大学南方医院消化内科，广州510515

[收稿日期]2009-6-23 ［接受日期］

[基金项目]国家自然科学基金（30570839）,广东省自然科学基金（2006105111）.Supported by National Natural Science Foundation of China(30570839) and the Natural Science Foundation of Guangdong Province(2006105111).

[作者简介]陈学清，博士，副教授.E-mail:chenxq@vip.163.com

^*通讯作者（Corresponding author）.Tel：020-61641537，E-mail:lims661216@yahoo.com.cn

[摘要] 目的：研究神经肽PACAP能否调节小鼠骨髓起源的LPS激活的树突状细胞（DC）的免疫功能。方法：联合应用rm GM-CSF and rmIL-4自C57BL/10.A小鼠骨髓细胞制备DC；以LPS和/或PACAP刺激DC；收集DC及其上清夜行ELISA 和 FACS分析；自DC提取总RNA 行RT-PCR 和 RNAse分析。结果：PACAP明显抑制LPS激活的DC分泌细胞因子IL-2、IL-12 和 TNF-α,以及趋化因子MIP-2,但抑制LPS激活的DC分泌趋化因子MIP-1α和MIP-1β的作用并不明显。结论：PACAP对LPS激活的DC的免疫功能有负性调节作用。

[关键词] PACAP；树突状细胞；免疫

PACAP modulate immune function of LPS-stimulatd dendritic cell

CHEN Xue-qing¹, XIAO Bing²，LIU Si-de², ZHANG Ya-li², JIANG Bo², LI Ming-song^2*

1．Department of gastroenterology,First affiliated hospital of Guangzhou Medical College,Guangzhou 510120, China

2．Department of Gastroenterology,Southern Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510515

[Abstract] Objective: to investigate if PACAP modulates immune function of LPS-stimulated dendritic cell. Methods: prepared DC from bone marrow of C57BL/10.A with rm GM-CSF and rmIL-4; stimulated DC with different stimuli for indicated time; collected stimulated DC and its supernatant for ELISA and FACS analysis; extracted total RNA from the stimulated DC for RT-PCR and RNase Protection Assay. Results: PACAP significantly inhibited LPS-stimulated DC to produce IL-2、IL-12 and TNF-α,and MIP-2, but the down-regulation of MIP-1α、MIP-1βproduced by LPS-stimulated DC was not significant.Conclusions: PACAP negatively modulated the immunity of LPS-stimulated DC.

[Keywords] PACAP,dendritic cell,immunity

研究^[1-2]发现，垂体腺苷酸环化酶激活多肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP）不仅对神经系统有强大的免疫性活性，对免疫系统同样具有明显的调节作用。但迄今未见PACAP调节脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活的树突状细胞（dendritic cell，DC）免疫功能的研究报道。LPS通过激活DC诱导的一系列的炎症反应参与了多种疾病的发生和发展，如感染性疾病和风湿病等^[3-4]。因此，调节LPS激活的DC的免疫功能将改变这些疾病的发生和发展，从而起到治疗作用。本文旨在研究PACAP对LPS激活的DC免疫功能的调节作用。

1材料和方法

1.1实验动物 雌性 C57BL/6 小鼠（8－12周）购自本校动物实验室，并饲养在SPF级动物实验室。

1.2试剂及单克隆抗体 rmGM-CSF、rmIL-4、 抗鼠单抗(抗IL-2单抗、抗IL-6单抗, 抗IL-10单抗, 抗IL-12

单抗和抗TNF-α单抗) 、PE标记的抗鼠CD11c抗体ELISA试剂盒和以mCK-1 和 mCK-5b 为模板的多探针核糖核酸酶保护测定（RNase protection assay, RPA）试剂盒均购自BD 公司。人工合成的药品级PACAP和血管活性肠肽（Vasoactive intestinal peptide，VIP，与PACAP相似的另一种神经肽，能调节DC免疫功能，作为阳性对照组）购自CALBIOCHEM公司，脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)购自 Sigma 公司。RPMI 1640 完全培养液(含 2 mmol/L L-glutamine, 25 mmol/L HEPES, 0.05 mmol/L 2-ME, 100 u/ml 青霉素, 100 μg/ml 庆大霉素 和10% 胎牛血清)、TRIzol试剂盒购自 Life Technologies公司。³²P-核苷酸购自北京原子能研究所。

1.3 DC的制备、纯化和激活 自C57BL/6小鼠分离完整长骨，在70％乙醇中浸泡3 min后，用PBS冲洗；在无菌条件下从长骨中分离出骨髓细胞并制备成单细胞悬液；加入含rm GM-CSF 和rm IL-4各200 u/ml的RPMI 1640 完全培养液于37℃、5% CO₂条件下在Petri 培养皿中培养骨髓细胞，调整每只培养皿中的骨髓细胞浓度为2X10⁶ /10 ml；培养第3天，在每培养皿中加入10ml新鲜RPMI 1640 完全培养液（含rm GM-CSF 和rm IL-4各200 u/ml）；第5天，收集培养的细胞，以免疫磁珠标记的抗CD11c单抗通过全自动磁性细胞分选仪(autoMACS)纯化DC。经FACS检测，DC纯度为90％以上。分别以LPS(1μg/ml)、PACAP(10^-7 mol/L) 、VIP(10^-7 mol/L) 、LPS(1μg/ml)＋PACAP(10^-7 mol/L) 、LPS(1μg/ml)＋VIP(10^-7 mol/L)激活DC(1×10⁶/ml)，收集被激活的DC及其上清液供下一步分析。

1.4 ELISA检测 按指南以ELISA方法检测被激活的DC上清夜中 IL-2、IL-6、IL-12 和 TNF-α表达水平。

1.5 RPA 以RPA方法检测趋化因子MIP-2、MIP-1α和MIP-1βmRNA表达水平，主要步骤如下：按Trizol方法自DC提取总RNA；按RPA试剂盒指南合成探针，提取、纯化并测定其放射活性；取每样本RNA 5ug、空白对照RNA及阳性对照标准RNA各2ul，真空干燥后加入合成缓冲液溶解，各样本再加入稀释后的mCK-1 和 mCK-5b探针2ul， 56℃孵育后再分别加入核糖核酸酶混合液及蛋白酶K混合液，经过酶消化后多余的探针和未被结合的单链RNA被分解，不被分解的探针RNA复合物按Trizol方法再提取、纯化，注入5％聚丙烯酰胺胶后室温下50 W电泳2h，并用真空干燥器将胶转至滤纸，－70℃下将感光片曝光；放射自显影图像由Fuji-BAS 2000分析；RNA条带密度用GAPDH密度进行标准化后再相互比较。

1.6统计学处理 采用SPSS11.5软件进行数据处理，数据以 ±s表示，配对样本采用t检验。

2 结 果

2.1 PACAP抑制LPS激活的DC分泌细胞因子 经LPS激活后，DC迅速分泌大量的细胞因子IL-2、IL-6、IL-12 和TNF-α。PACAP明显抑制LPS激活的DC分泌细胞因子IL-2、IL-12和TNF-α，但对IL-6的抑制作用则不明显。

2.2 PACAP 调节LPS激活的DC表达趋化因子RPA检测结果显示，PACAP显著抑制LPS激活的DC表达趋化因子MIP-2表达，但对趋化因子MIP-1α及MIP-1的抑制作用则不明显。见图2及表1。

Figure 2 PACAP inhibited LPS-stimulated DC to express chemotatic factors

表1 PACAP对LPS激活的DC表达趋化因子的抑制作用

Table 1 PACAP inhibited LPS-stimulated DC to express chemotatic factors

^*P＜0.01，^**P＞0.05，LPS＋PACAP group vs LPS group，n＝3

3 讨论

DC在调节机体免疫功能，维持免疫功能稳定中发挥关键作用。DC的免疫功能过激或免疫功能低下将直接导致机体的免疫功能失衡。当致病性细菌感染机体后，通过其菌体的LPS诱导炎症反应，LPS激活DC其中一个重要环节是LPS激活DC，并通过被LPS激活的DC释放出大量的炎症介质（包括细胞因子和趋化因子），产生炎症反应；同时DC自身的免疫活性也明显加强，进一步促进炎症反应的发生和发展，导致感染性疾病的进一步发展，并参与了某些与感染相关的风湿病的病理过程^【3－4】 ，提示，若能抑制LPS激活的DC的免疫活性，将能有效抑制细菌感染所导致的炎症反应以及风湿病的进程。我们的研究结果显示，PACAP通过下列方式抑制LPS激活的DC的免疫功能：一是，PACAP抑制LPS激活的DC分泌细胞因子IL-2、IL-12和TNF-α；其次，PACAP明显抑制LPS激活的DC表达趋化因子，如MIP-2。这些细胞因子和趋化因子与炎症反应地发生和发展关系密切，在炎症性疾病的的发生和发展中起重要作用。

近期的研究发现，PACAP在调节机体的免疫功能中发挥重要作用^【1－4】。而最新的研究进一步显示，PACAP在实验性地治疗某些自身免疫性疾病（如炎症性肠病和神经系统炎症性疾病）中有明显的疗效^【5－8】，但确切的机制尚不清楚。而在这些疾病本身就存在不同程度的免疫功能过激，包括DC的功能过于强大。提示，PACAP负性调节DC的免疫功能可能是PACAP在自身免疫性疾病中发挥治疗作用的一个重要方面。我们的研究亦显示PACAP明显抑制LPS激活的DC产生某些细胞因子和趋化因子，但对另一些细胞因子和趋化因子的抑制作用则不明显，其确切的机制尚不清楚，可能和不同的细胞因子和趋化因子的信号通道不同有关联^【3－4】 。

PACAP通过调节LPS激活的DC分泌细胞因子和趋化因子而调节DC的免疫功能，并可能通过该机制在治疗某些自身免疫性疾病（如炎症性肠病和神经系统炎症性疾病）中发挥作用。

[参 考 文 献]

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