VIP调节LPS激活的树突状细胞免疫功能

发表者：李明松人已读

VIP调节LPS激活的树突状细胞免疫功能

陈学清^1*，张秋红^2*,刘思德³，肖冰³，张亚历³，姜泊³，李明松³

【摘要】目的：研究神经肽VIP能否调节LPS激活的树突状细胞（DC）的免疫功能。方法：联合应用rm GM-CSF 和 rmIL-4自C57BL/10.A小鼠骨髓细胞制备DC；以LPS和/或VIP刺激DC；收集DC及其上清夜行ELISA分析；自DC提取总RNA 行 RNAse分析。结果：VIP明显抑制LPS激活的DC分泌细胞因子IL-2、IL-12 和 TNF-α, 但对IL-6的抑制作用则不明显；VIP明显抑制LPS激活的DC表达化学因子MIP-2和-10,但对化学因子Rantes、MIP-1α和MIP-1β的抑制作用并不明显。结论：VIP对LPS激活的DC的免疫功能有负性调节作用。

【关键词】：VIP，树突状细胞，免疫

VIP modulate immune function of LPS-stimulatd dendritic cell

Chen Xue-qing¹, Zhang qiuhong², Liu Si-de³, Xiao Bing³，Zhang Ya-li³, Jiang Bo³, Li Ming-song³. ¹ Department of gastroenterology, First affiliated hospital of Guangzhou Medical College, Guangzhou 510120, ²Dept. of Gynaecology, The first hospital of Ningbo, Ningbo315010, ³Dept.of Gastroenterology, Southern Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China

[Abstract] Objective: to investigate if VIP modulates immune function of LPS-stimulated dendritic cell. Methods: prepared DC from bone marrow of C57BL/10.A with rm GM-CSF and rmIL-4; stimulated DC with different stimuli for indicated time; collected the stimulated DC and its supernatant for ELISA analysis; extracted total RNA from the stimulated DC for RNAse Protection Assay. Results: VIP significantly inhibited LPS-stimulated DC to produce IL-2、IL-12 and TNF-α(P<0.05),and MIP-2、IP-10(P<0.05), but the down-regulation of MIP-1α、MIP-1βand Rantes produced by LPS-stimulated DC was not significant (P>0.05). Conclusions: VIP negatively modulated the immunity of LPS-stimulated DC.

[Keywords]VIP, dendritic cell, immunity

基金项目：国家自然科学基金（30570839）、广东省自然科学基金（2006105111）和广东省科技攻关计划（2007B030704011）资助。

作者单位：¹广州医学院第一附属医院消化内科，广州市沿江西路151号,广州 510120；²宁波市第一医院妇科，宁波315010； ³南方医科大学南方医院消化科，广州市广州大道北1838号。

通讯作者：李明松，e-mail: lims661216@yahoo.com.cn。

*为共同第一作者。

研究发现，神经肽VIP（Vasoactive intestinal peptide）具有免疫调节功能^{【1，2,3,4】}，但迄今未见VIP调节LPS激活的树突状细胞（dendritic cell，DC）免疫功能的相关报道。本文将研究VIP对LPS激活的DC免疫功能的调节作用。

1材料和方法

1.1实验动物

雌性 C57BL/10.A 小鼠（8－12周）购自本校动物实验室，并饲养在SPF级动物实验室。

1.2试剂及单克隆抗体

rm GM-CSF,、rmIL-4、抗鼠单抗(IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-α) 、抗鼠

的荧光单抗 (PE-conjugated anti-CD11c、PE-conjugated anti-CD40、 FITC-conjugated CD80、FITC-conjugated CD86、FITC-conjugated I-E^k) 以及ELISA试剂盒均购自BD 公司。人工合成的VIP和 PACAP（Pituitary Adenylate Cyclase-Activating polypeptide，另一种神经肽）购自CALBIOCHEM公司。LPS (Lipopolysaccharide)购自 Sigma 公司。完全型RPMI 1640 培养液(含 2 mM L-glutamine, 25 mM HEPES, 0.05mM 2-ME, 100 u/ml 青霉素, 100 μg/ml 庆大霉素和10% 胎牛血清)及TRIzol试剂盒购自 Life Technologies公司。

1.3树突状细胞制备、纯化和激活

自C57BL/10.A 制备DC。主要方法如下：自小鼠分离完整的长骨，在70％的酒精中浸泡3分钟后，以PBS冲洗；在无菌条件下自长骨中分离出骨髓细胞并制备成单细胞悬液；于37º、5% CO₂条件下在Petri 培养皿中培养骨髓细胞（2X10⁶/10 ml 培养液/dish），完全型RPMI 1640 培养液中含rm GM-CSF (200 u/ml) 和 rm IL-4 (200 u/ml)；第3天，每培养皿中加入10ml新鲜的含rm GM-CSF (200 u/ml) 和 rm IL-4 (200 u/ml)的完全型RPMI 1640 培养液；第5天，收集培养的细胞，以免疫磁珠标记的抗CD11c单抗通过autoMACS 系统纯化DC。经FACS检测，DC纯度为96％±3％。以LPS(1μg/ml)、VIP(10^-7 M)、和LPS＋VIP激活DC(1X10⁶/ml)适当时间，收集被激活的DC及其上清夜供下一步分析。

1.4 ELISA检测

以ELISA方法检测被激活的DC上清夜中 IL-2, IL-6, IL-12 和 TNF-α含量。

1.5 RNAse Protection Assay

以TRIzol试剂盒自上述DC提取并纯化总RNA。³²P-核苷酸购自北京原子能研究所。以mCK-1 and mCK-5b 为模板的多探针 RNAse Protection Assay 试剂盒购自BD Pharmingen公司，并按操作指南分析多种趋化因子mRNA表达水平，主要步骤包括：探针合成；总RNA制备和RNA杂交；RNAse制备；电泳及显影。以相对光密度对各趋化因子表达进行统计学分析。

1.6统计学处理

数据以 ±s表示。配对样本采用t检验法。所有数据均由SPSS11.5统计软件处理。

2 结果

2.1 VIP抑制LPS激活的DC分泌细胞因子

经LPS激活后，DC分泌大量的细胞因子IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α。VIP明显抑制LPS激活的DC分泌细胞因子IL-2、IL-12和TNF-α，但对LPS激活的DC分泌细胞因子IL-6的抑制作用则不明显(P<0.05) (P>0.05)。作为对照，另一种神经肽PACAP对DC分泌细胞因子IL-2、IL-6、IL-12和TNF-α也有不同程度的抑制作用。

图1A. VIP明显抑制LPS诱导DC表达IL－2（P <0.01）。图1B.VIP对 LPS诱导DC表达IL－6的

抑制作用不明显（P >0.05）。

Figure 1A. VIP significantly inhibited LPS-stimulated DC Figure 1B.VIP lightly inhibited LPS-stimulated DC

to express IL-2 IL-6（P >0.05）

图1C. VIP明显抑制LPS诱导DC表达IL－12（P <0.01）。图1D.VIP明显抑制LPS诱导DC表达

TNF-α（P <0.01）。

Figure 1C. VIP significantly inhibited LPS-stimulated Figure 1D.VIP significantly inhibited LPS-stimulated DC to express IL-12（P <0.01） DC IL-6（P <0.01）

2.2 VIP 调节LPS激活的DC表达趋化因子

经LPS激活后，DC表达大量的趋化因子IP-10、MCP－1、MIP-2、Rantes、MIP-1α和MIP-1β。VIP明显抑制LPS激活的DC表达趋化因子IP-10和MIP-2，但对LPS激活的DC表达Rantes、MIP-1α和MIP-1β的抑制作用则不明显。作为对照，另一种神经肽PACAP对DC分泌趋化因子也有不同程度的抑制作用。见图2及表1。

图2，VIP不同程度地抑制LPS激活的DC表达趋化因子。

Figure 2,VIP inhibited LPS-stimulated DC to express chemotatic factors

表1A. VIP显著抑制LPS激活的DC表达趋化因子IP-10和 MIP－2表达。

Figure1A.VIP significantly inhibited LPS-stimulated DC to express chemotatic factor

IP-10 and MIP－2.

组别 medium LPS VIP LPS+VIP

IP-10 0.01±0.01 0.17±0.02 0.015±0.01 0.1±0.02^×

MIP-2 0.02±0.01 0.26±0.03 0.11±0.01 0.17±0.01^××

×：LPS+VIP VS LPS,P <0.01.××：LPS+VIP VS LPS,P <0.05。

表1B. VIP对 LPS激活的DC表达趋化因子MIP－1α和MIP－1β的抑制作用不明显

Figure1B.VIP lightly inhibited LPS-stimulated DC to express chemotatic factor

MIP－1αand MIP－1β

组别 medium LPS VIP LPS+VIP

MIP－1α 0.39±0.03 0.53±0.02 0.39±0.04 0.47±0.02^＃

MIP－1β 0.37±0.02 0.45±0.04 0.32±0.01 0.37±0.02^＃＃

＃：LPS+VIP VS LPS, P >0.05；＃＃：LPS+VIPVS LPS, P >0.05.

3 讨论

DC在调节机体免疫功能，维持免疫功能稳定中发挥关键作用。DC的免疫功能过激或免疫功能低下将导致机体的免疫功能失衡，易于发生自身免疫性疾病或感染性疾病。当致病性细菌感染机体后，通过释放其菌体的LPS诱导炎症反应，其中一个重要环节是LPS激活DC，并通过被LPS激活的DC释放出大量的炎症介质（包括细胞因子和趋化因子），产生炎症反应，同时DC本身的免疫活性也明显加强，进一步促进炎症反应的发生和发展，导致感染性疾病的进一步恶化。提示，若能抑制LPS激活的DC的免疫活性，将能有效抑制细菌感染所导致的炎症反应。

我们的研究结果显示，VIP通过下列方式调节LPS激活的DC的免疫功能。第一，VIP明显抑制LPS激活的DC分泌细胞因子IL-2、IL-12和TNF-α。这些细胞因子与炎症反应的发生和发展关系密切，在炎症性疾病的发生和发展中起重要作用。其次，VIP明显抑制LPS激活的DC表达趋化因子，如MIP-2和IP-10。这些化学因子同样在炎症的发生和发展中起重要作用。表明，VIP能够通过抑制LPS激活的DC分泌细胞因子和趋化因子抑制细菌感染所产生的炎症反应。

我们的研究还发现，VIP明显抑制LPS激活的DC产生某些细胞因子和趋化因子，但对另一些细胞因子和趋化因子的抑制作用则不明显，其确切的机制尚不清楚，可能和不同的细胞因子和趋化因子的信号通道不同有关联^【4】。

作为神经介质，VIP在调节神经系统功能中发挥重要作用。近期的研究发现，VIP在调节机体的免疫功能中发挥重要作用^{【1,2,3,4】}。而最新的研究进一步显示，VIP在实验性地治疗某些自身免疫性疾病（如炎症性肠病和神经系统炎症性疾病）中有明显的调节作用^{【5,6,7,8,9,10】}。而在这些疾病本身就存在不同程度的免疫功能过激。因此，VIP通过调节DC的免疫功能来治疗自身免疫性疾病，以及通过调节DC的免疫功能来抑制致病菌感染所致的炎症反应将是一种新的选择^【11】。

参考文献

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5. Gutiérrez-Cañas I, Juarranz Y, Santiago B, Martínez C, Gomariz RP, Pablos JL, Leceta J.Immunoregulatory properties of vasoactive intestinal peptide in human T cell subsets: implications for rheumatoid arthritis.Brain Behav Immun, 2008, 22(3):312-7.

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11. Gonzalez-Rey E, Anderson P, Delgado M.Emerging roles of vasoactive intestinal peptide: a new approach for autoimmune therapy.Ann Rheum Dis, 2007, 66 Suppl 3:iii70-6.