垂体肿瘤转化基因1和基质金属蛋白酶13调控前列腺癌细胞侵袭力的研究

摘要：

目的：了解垂体肿瘤转化基因1(Pttg1)和基质金属蛋白酶13(MMP13)与前列腺癌的关系，以及二者在前列腺癌转移中所起的作用。

方法：通过RT-qPCR法，了解前列腺癌组织中Pttg1和MMP13表达水平及二者相关性。分别使用过表达Pttg1的质粒或携带shRNA的质粒(shPttg1)转染人前列腺癌细胞系PC3，来上调或下调Pttg1水平，测定相应的MMP13表达水平的变化（用RT-qPCR、ELISA法来测定）；反之测定MMP13表达水平的变化对Pttg1的影响。用划痕愈合实验或Transwell 细胞迁移实验测定肿瘤细胞侵袭的变化。用特异性通路抑制剂抑制ERK/MAPK、JNK、PI3K信号通路，并用Western Blot法测定在 Pttg1过表达的PC3细胞中这些通路抑制剂对MMP13水平的影响效果。

结果：本研究发现在病理组织中，前列腺癌组织中Pttg1和MMP13的表达水平显著高于邻近正常前列腺组织，并且Pttg1和MMP13的表达水平具有相关性。体外实验中，Pttg1 激活MMP13，而后者决定前列腺癌细胞的侵袭力。但Pttg1表达水平不受MMP13的显著影响。另外，前列腺癌细胞中Pttg1 激活的MMP13可被PI3k/Akt信号通路显著抑制，而不是ERK/MAPK或JNK信号通路。

结论：本研究显示前列腺癌组织中Pttg1和MMP13的表达水平显著增高，二者有相关性；Pttg1可通过MMP13增加前列腺癌细胞侵袭能力，提示Pttg1/MMP13轴有望成为前列腺癌治疗的靶点。

关键词：前列腺癌；垂体肿瘤转化基因1(pttg1)；基质金属蛋白酶13(MMP13)；转移

Pituitary tumor-transforming gene 1 and matrix metalloproteinase13 regulates invasion of prostate cancer cells.

LIN Yun-Hua，JIANG Yong-guang，WANG Jun-Sheng，LUO Yong，ZHAO Jia-Hui, WANG Yong-Xing

（Department of Urology, Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University of China, No.2 Anzhen Road, Beijing 100029, China. Corresponding author：JIANG Yong-guang，Email: scalpel@163.com）

Abstract

Objectives To investigate the relationship of pituitary tumor-transforming gene1 (Pttg1) and matrix metalloproteinase13 (MMP13) in prostate cancer (PC) as well as their roles in the metastases of PC.

Method Pttg1 and MMP13 levels and the correlation are detected in PC specimens by RT-qPCR. We used either a Pttg1-overexpressing plasmid or a plasmid carrying short hairpin small interfering RNA (shRNA) for Pttg1 (shPttg1) to transfect a human PC cell line, PC3, to increase or decrease Pttg1 levels, respectively. And corresponding MMP13 levels are detected (RT-qPCR、ELISA). In reverse, the effects of MMP13 modification to Pttg1 are detected. Cell invasiveness is tested in either a scratch wound healing assay or a Transwell cell migration assay. We used specific inhibitors to inhibit ERK/MAPK, JNK and PI3K signaling pathway and checked the effects of application of these specific pathway inhibitors on the MMP13 levels in Pttg1 overexpressed PC3 cells by Western Blot.

Result We found significantly higher levels of Pttg1 and MMP13 in the resected PC specimens, compared to the adjacent normal prostate tissue from the same patient. Pttg1 and MMP13 levels strongly correlated with each other. In vitro, Pttg1 activated MMP13, which determined PC cell invasiveness. However, Pttg1 levels were not significantly affected by MMP13. Furthermore, the Pttg1-activated MMP13 in PC cells was significantly suppressed by inhibition of PI3k/Akt, but not ERK/ MAPK or JNK pathways.

Conclusion Our data suggest that Pttg1 and MMP13 levels are significantly increased and correlated with each other in PC specimens. Pttg1 may increase PC cell metastasis by MMP13, and highlight Pttg1/MMP13 axis as a promising therapeutic target for PC treatment.

Key Words prostate cancer; pituitary tumor-transforming gene 1 (pttg1); matrix metalloproteinase 13 (MMP13); metastases

前列腺癌是老年男性常见肿瘤，多数进展缓慢，但其中一部分侵袭能力较强，前列腺癌细胞容易转移至淋巴结和远处器官[1-4]。现有的治疗方法尚不能提供满意的疗效，因而迫切需要进一步研究前列腺癌转移和侵袭的分子机制[1-10]。

基质金属蛋白酶(MMP)家族的蛋白在肿瘤进展中具有分解细胞外基质的作用[11-13]。MMP13是MMP家族一员，也被称作胶原酶3（collagenase 3）。MMP13以非活化的蛋白质前体形式分泌出来，被酶介导的结构前域裂隙所激活[11-13]。MMP13在一些人类恶性肿瘤中高表达，如多发性骨髓瘤[11]，胃癌[12]，Kaposi肉瘤[13]。而MMP13在前列腺癌中是否高表达，及其在前列腺癌发生发展中所起的作用尚未被阐明。

垂体肿瘤转化基因1(Pttg1，也被称作分离酶抑制蛋白)能够促使细胞进入活跃的细胞周期[14–17]。近期的研究显示，Pttg1能够促使多种肿瘤细胞的生长和转移，并且可以调控肿瘤细胞内的MMP[18–21]。但Pttg1下游信号传导的分子机制及其对肿瘤细胞内MMP13活化的作用目前尚不清楚。

本文研究了前列腺癌组织中Pttg1和MMP13的表达水平及其相关性，在体外实验中通过改变Pttg1和MMP13表达水平来影响前列腺癌细胞的侵袭力，并显示在前列腺癌细胞中Pttg1可通过PI3k/Akt信号通路对MMP13进行调控。以期探索前列腺癌治疗的新靶点。

1.材料和方法

1.1患者组织样本

组织样本来自2010至2014年本院泌尿外科30例前列腺癌患者手术后的标本，由有经验的病理科医师确诊。切片后的样本（包括前列腺癌组织和邻近的正常前列腺组织）用作Pttg1和MMP13转录分析。

1.2细胞系培养和转染

人前列腺癌细胞系PC3购自ATCC(ATCC,Rockville, MD, USA)。细胞保存在ATCC制备的伊格尔氏最小量必需培养基(ATCC, Catalog No.30–2003)，补充10%胎牛血清(FBS； Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)，置入湿化温室（37°C ,5% CO₂）。包含转基因或shRNA的质粒全部购自北京Origene。用于转染的2μg质粒按照说明(Invitrogen, St.Louis, MO, USA)使用Lipofectamine 2000。

1.3信号通路抑制剂

LY294002(20μmol/l)、PD98059(10μmol/l)和SP600125(10μmol/l)均购自Sigma-Aldrich，溶于二甲基亚砜(DMSO, Sigma-Aldrich)，分别用来抑制培养细胞的Akt、ERK/MAPK和JNK信号通路的磷酸化。

1.4划痕愈合实验

划痕愈合实验按照文献描述进行[22]。细胞以10⁴个/孔的密度种植于24孔板的DMEM培养基中培养和聚集。开始实验前使DMEM中的单层细胞血清饥饿一夜。以黄色移液管尖在聚集的单层细胞上制造划痕，缓冲液冲洗细胞碎片两次，37°C孵育24h。12h后每个样本随机选取5个视野采集延时图像，划痕区域采用NIH的Image J软件进行计算。

1.5 Transwell细胞迁移实验

将细胞（10⁴个）置入BioCoat^TM侵袭小室(Becton-Dickinson Biosciences, Bedford, MA, USA)上层中被覆Matrigel的聚碳酸酯Transwell过滤膜上面，37°C孵育22h。然后移除上层小室中的细胞，固定膜下方迁移侵袭的细胞并以苏木精染色，100倍显微镜下每孔随机计数10个视野，所有计数以每个视野的平均细胞数表示。共进行5次独立实验，数据以均数±标准差（SD）表示。

1.6 RNA提取，逆转录和定量RT-PCR

MiRNA及总RNA分别用miRNeasy试剂盒或RNeasy试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)提取自组织标本或培养细胞，用于cDNA合成。用Omniscript逆转录试剂盒(Qiagen)以2μg总RNA随机引导cDNA。随后使用QuantiTectSYBR Green PCR系统(Qiagen)在Rotor-Gene 6000聚合酶链反应器上以1:4稀释的cDNA进行三次的实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)。RT-qPCR用QuantiTect SYBR GreenPCR试剂盒(Qiagen)重复进行。所有引物购自Qiagen公司。数据由Rotor-Gene聚合酶链反应器配套的Rotor-Gene软件采集，使用2-△△Ct法对mRNA相对表达水平定量。基因的数据先对β-actin标准化，再与实验对照比较。

1.7 Western Blot

蛋白提取自培养细胞，放入RIPA裂解液(1% NP40, 0.1% SDS, 100μg/ml苯甲基磺酰氟

，0.5%脱氧胆酸钠, PBS缓冲溶液)。4°C 下12,000×离心20分钟，取上清液。用BCA蛋白检测试剂盒(Bio-rad, 中国)测定蛋白浓度，把裂解产物以1：3比率混合4×SDS上样缓冲液(125 mmol/l Tris-HCl,4% SDS, 20%甘油, 100 mmol/l DTT, 0.2%溴酚兰)。蛋白样本100°C加热5分钟，与SDS-聚丙烯酰胺分离，转移至PVDF膜，先与一抗结合，再与二抗孵育，通过增强化学发光系统使蛋白抗原放射自显影，X片成像。Western Blot所用的一抗为抗-MMP13和β-actin(均购自Abcam, Cambridge, MA, USA)。β-actin作为蛋白上样内参。二抗是辣根过氧化物酶螯合的抗体(Jackson Labs, Bar Harbor, ME, USA)。图示为五个典型代表。 Western blots的光密度定量测定使用NIH的Image J软件。蛋白表达水平先用β-actin标准化，再与实验对照比较。

1.8 ELISA

细胞内和分泌的MMP13用MMP13 ELISA试剂盒(Calbiochem/Oncogene, Cambridge, MA, USA)测定。ELISA按照厂家说明进行。收集状态培养液加入覆盖有MMP13多克隆抗体的孔内，以生物素化的抗人MMP13单克隆抗体在室温下免疫吸附2h，以2.5 mol/l硫酸终止辣根过氧化物酶催化的显色反应，450nm测量吸光度。蛋白浓度通过与标准比较相对吸光度来测定。

1.9统计分析

统计分析使用SPSS 19.0软件。所有数据运用单因素方差分析，Bonferroni校正，组间比较采用Fisher精确检验。所有数据用均值±标准差描述，p<0.05认为有统计学意义。

2.结果

2.1 Pttg1和MMP13在前列腺癌组织中高表达

近期多项研究发现Pttg1和MMP13在肿瘤发生中起重要作用，因而本课题着眼于探索其在前列腺癌中的作用。本组通过RT-qPCR方法检测了30例前列腺癌组织标本（配对的前列腺癌和邻近正常前列腺组织）中Pttg1和MMP13的水平。我们发现与邻近正常前列腺组织相比，前列腺癌组织中Pttg1和MMP13的表达显著升高（图1A, p<0.05；图1B, p<0.05)。

2.2前列腺癌组织中Pttg1和MMP13表达水平显著相关

为了解Pttg1和MMP13是否有相关性，本课题检测了每位患者的Pttg1和MMP13表达水平，结果发现前列腺癌组织中MMP13和Pttg1表达水平具有显著相关性(R=0.58, p<0.0001, 图1C)。本组数据提示MMP13和Pttg1在前列腺癌发展过程中存在关联。

2.3 Pttg1通过MMP13提高前列腺癌侵袭力

随后我们检测了改变前列腺癌细胞内的Pttg1水平是否能够改变肿瘤细胞转移能力以及MMP13水平。我们分别使用过表达Pttg1的质粒或携带针对Pttg1的短发夹RNA(shRNA)的质粒(shPttg1)转染人前列腺癌细胞系PC3，来上调或下调Pttg1水平。PC3细胞系也用携带干扰序列(scr)的质粒转染作为对照。PC3细胞系中Pttg1水平变化用RT-qPCR来测定(图2A)。我们发现升高PC3细胞系中Pttg1水平 (PC3-Pttg1)能够显著上调MMP13水平，而降低Pttg1水平 (PC3-shPttg1)能够显著下调MMP13水平，以上是通过RT-qPCR(图2B)、ELISA测定细胞内蛋白(图2C)或条件培养基中的分泌蛋白(图2D)，提示Pttg1诱导MMP13的表达。PC3细胞系中Pttg1的过表达(PC3-Pttg1)在划痕愈合实验(图2E)或Transwell 细胞迁移实验(图2F)中均显著增加了肿瘤细胞侵袭能力；另一方面，降低PC3细胞系中的Pttg1(PC3-shPttg1)在划痕愈合实验(图2E)或Transwell 细胞迁移实验(图2F)中均显著降低了细胞侵袭力。这些数据提示Pttg1可诱导MMP13表达，增强前列腺癌细胞侵袭力和转移力。

2.4 MMP13在前列腺癌细胞中不能调控Pttg1

下一步我们又检测了改变前列腺癌细胞内的MMP13水平是否能够改变Pttg1水平。我们分别用表达MMP13的质粒或携带针对MMP13的shRNA的质粒 (shMMP13)转染PC3细胞系。 PC3细胞系也用携带干扰序列(scr)的质粒转染作为对照。 PC3细胞系中MMP13水平变化用RT-qPCR来测定(图3A)。结果发现虽然MMP13水平变化可在划痕愈合实验(图3C)或Transwell 细胞迁移实验(图3D)中均显著改变了肿瘤细胞侵袭力，但没有改变PC3细胞系中的Pttg1水平(图3B)。这些数据提示Pttg1不受MMP13调控，Pttg1不能够直接调控肿瘤细胞侵袭力。综上所述，研究数据显示Pttg1可能是通过MMP13来增强前列腺癌侵袭力的。

2.5 Pttg1通过PI3k/Akt 信号通路调控MMP13

根据细胞类型不同，MMP13的调控涉及到不同的信号通路，例如ERK/MAPK, JNK,以及 PI3k/Akt。我们用特异性ERK1/2抑制剂PD98059（浓度为10 μmol/l）来抑制ERK/MAPK信号通路；用特异性JNK抑制剂SP600125（浓度为10 μmol/l）来抑制JNK信号通路；用特异性Akt抑制剂LY294002（浓度为20 μmol/l）来抑制PI3K信号通路。随后，在 Pttg1过表达的PC3-Pttg1细胞中检测这些特异性通路抑制剂对MMP13水平的影响效果，以PC3-scr细胞为对照。结果显示只有LY294002显著抑制了PC3-Pttg1细胞中的MMP13水平(图4)，提示Pttg1是通过PI3k/Akt 信号通路调控MMP13的。这个模型被图解概括为图5。

3.讨论

多项研究报道在一些肿瘤中Pttg1水平呈显著升高，而Pttg1在前列腺癌发生发展中的角色尚不清楚[14–17]。近期的一项研究通过对肾细胞癌组织中的Pttg1的扩增，报道了Pttg1在肾癌的发生发展中所起的作用，及其与高级别肿瘤和不良预后之间的关系[23]。这项研究在几个肿瘤细胞系中检测到了Pttg1依赖性RhoGEF原癌基因ECT2的表达，且ECT2的表达与Pttg1水平及不良预后有相关性[23]。国内一项研究通过免疫组化方法显示Pttg高表达是无远处转移前列腺癌患者接受内分泌治疗后肿瘤无进展生存期较短的独立预测因素[24]。

尽管取得了很多研究进展，但Pttg1调控肿瘤生长和转移的分子机制仍未充分阐明[14–17]。现已证实Pttg1可固定并阻止姊妹染色单体分离，直至被后期促进复合物(APC)泛素化，从而被蛋白酶分解[14–17]。Pttg1可调节一些细胞进程，例如DNA修复、细胞凋亡和基因调控[14–17]。多能基因c-myc就被证实是Pttg1的靶基因，c-myc的磷酸化和激活可驱动反式激活介导的信号转导[14–17]。Pttg1也可以促进碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）反式激活，从而促使肿瘤相关的血管新生[14–17]。此外，Pttg1还能够通过直接结合p53 DNA结合域来抑制p53诱导的细胞凋亡[14–17]。目前为止，还没有针对Pttg1与MMP13之间关系的研究报道。以上的研究现状启发了本组去探索Pttg1和MMP13在前列腺癌中所起的作用，以及二者间的相互作用。

本研究首次报道在相同患者中，与邻近正常前列腺组织比较，前列腺癌组织中Pttg1和MMP13的表达水平显著增高，并且Pttg1和MMP13的表达水平具有很强的相关性。体外实验首次发现Pttg1可诱导MMP13表达水平增高，从而影响前列腺癌细胞的侵袭力；但Pttg1表达水平不受MMP13的显著影响。因此，Pttg1是MMP13的上游基因。在一系列的功能失活实验中，只有阻滞PI3k/Akt信号通路才能降低前列腺癌细胞中Pttg1诱导的MMP13表达,表明Pttg1是通过PI3k/Akt信号通路来调控MMP13。我们也测试了另外几个细胞系，例如DU-145,CA-HPV-10和MDA-PCa2b，得到了类似的结果，因而排除了结论是基于细胞系依赖的可能性。这些发现对我们的假设是一个有力支持，并且也为今后进一步的分子机制研究奠定了基础。而具体的分子机制、体内实验等有待在今后的研究中进一步探索。

总之，本组数据提示，前列腺癌组织中Pttg1和MMP13的表达水平显著增高，二者有相关性；Pttg1可通过PI3k/Akt信号通路诱导MMP13的表达，从而增加前列腺癌细胞转移能力。本研究在前列腺癌转移的分子机制方面阐述了新的可能，提示Pttg1与MMP13的作用有望成为前列腺癌治疗的靶点。

（图略）

图1 前列腺癌组织中Pttg1和MMP13表达水平的关系。通过RT-qPCR方法检测30例前列腺癌切片标本（配对的前列腺癌(PC)和邻近正常前列腺组织(NPT)）。A、B：与邻近正常前列腺组织相比，前列腺癌组织中Pttg1和MMP13的表达显著升高（图1A, p<0.05；图1B , p<0.05)。C 前列腺癌组织中MMP13和Pttg1表达水平具有显著相关性(R=0.58, p<0.0001)。

*p<0.05; n=30。统计分析：单因素方差分析，Bonferroni校正。双变量相关性分析：Spearman秩相关系数。

图2. Pttg1通过MMP13提高前列腺癌侵袭力。我们分别使用过表达Pttg1的质粒或携带针对Pttg1的短发夹RNA(shRNA)的质粒(shPttg1)转染人前列腺癌细胞系PC3，来上调或下调Pttg1水平。PC3细胞系也用携带干扰序列(scr)的质粒转染作为对照。 A PC3细胞系中Pttg1水平变化用RT-qPCR来测定。 B–D 改变Pttg1表达的PC3细胞系中MMP13水平检测是通过RT-qPCR(B)、ELISA测定细胞内蛋白(C)或条件培养基中的分泌蛋白(D)。E 划痕愈合实验。F Transwell 细胞迁移实验。

*p<0.05; n=5。统计分析：单因素方差分析，Bonferroni校正。

图3 MMP13不能调控Pttg1。我们分别用表达MMP13的质粒或携带针对MMP13的shRNA的质粒 (shMMP13)转染PC3细胞系。 PC3细胞系也用携带干扰序列(scr)的质粒转染作为对照。A PC3细胞系中MMP13水平变化用RT-qPCR来测定。 B Pttg1改变的PC3细胞系中MMP13水平用RT-qPCR来测定。 C 划痕愈合实验。 F Transwell 细胞迁移实验。

*p<0.05; n=5。NS：无显著差异。统计分析：单因素方差分析，Bonferroni校正。

图4. Pttg1通过PI3k/Akt 信号通路调控MMP13。我们用特异性ERK1/2抑制剂PD98059（浓度为10 μmol/l）来抑制ERK/MAPK信号通路；用特异性JNK抑制剂SP600125（浓度为10 μmol/l）来抑制JNK信号通路；用特异性Akt抑制剂LY294002（浓度为20 μmol/l）来抑制PI3K信号通路。随后在 Pttg1过表达的PC3-Pttg1细胞中检测这些特异性通路抑制剂对MMP13水平的影响效果，以PC3-scr细胞为对照。Western blot照片显示只有LY294002显著抑制了PC3-Pttg1细胞中的MMP13水平。

图5. 模型概括图。Pttg1可能依赖PI3k/Akt信号通路来诱导MMP13表达，从而增加前列腺癌细胞的侵袭力。