长岛型掌跖角化病：一例纯合缺失的SERPINB7基因突变

长岛型掌跖角化病：一例纯合缺失的SERPINB7基因突变

孙郅劼¹, 郭韫懿¹, 张丹露¹ ,祝英¹郭碧蓉², 孙忠辉¹

[摘要]：目的 报道 1 例长岛型掌跖角化病，确定其致病基因突变。方法 在先证者家系调查的基础上，收集家系患者和正常人的血样，并采集正常对照血样100份，采取聚合酶链反应技术对长岛型掌跖角化病致病基因SERPINB7基因进行扩增，并对其产物进行测序。结果 先证者存在 SERPINB7 基因7号外显子的c.650-653delCTGT(p.S217Lfs*7)纯合突变。先证者父母为杂合缺失。结论 SERPINB7 基因的 c.650-653delCTGT(p.S217Lfs*7)纯合突变是引起患者长岛型掌跖角化病的原因，这是该疾病、该位点作为纯和突变首次报道。

[关键词]：长岛型掌跖角化病；基因；SERPINB7：突变

Nagashima-type Palmoplantar Keratoderma: a case of homozygous deletion of the SERPINB7 gene mutation

SUN Zhijie¹, GUO Yunyi¹, ZHANG Danlu¹, ZHU Ying¹, GUO Birong², SUN Zhonghui¹

（1.Department of Dermatology, Fengxian Institute of Dermatosis Prevention and Treatment, Shanghai 201408, China ；2.Department of Dermatology, The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University and The First People’s Hospital of Hefei, Anhui Hefei, 230061 China）

[Corresponding authors ]: SUN Zhonghui，E mail: szhgyy3344@163.com；GUO Birong，Email: guobr1983@163.com

[Abstract ]: Objective To report a case of Nagashima-type palmoplantar keratoderma （NPPK）, and to identify disease-cause mutations in the SERPINB7 gene. Methods Based on the investigation of the family of the proband, the blood samples of the family and normal people were collected, and 100 normal blood samples were collected. PCR was performed to amplify 8 exons and their flanking sequences of the SERPINB7 gene followed by DNA sequencing. Results The proband had a homozygous mutation in the SERPINB7 gene c.650-653delCTGT (p.S217Lfs*7). The proband‘s parents were heterozygous Conclusion The homozygous mutation of c.650-653delCTGT (p.S217Lfs*7) of SERPINB7 gene is the cause of NPPK in proband. This case is the first report as homozygous c.650-653delCTGT (p.S217Lfs*7). of SERPINB7gene mutation.

[Key words ]: Nagashima-type palmoplantar keratosis; Gene; SERPINB7; Mutation

[基金项目]：皮肤病学教育部重点实验室（安徽医科大学）开放课题基金资助项目 (AY2017-1-017) ；上海市奉贤区科委基金项目（20171003）

[作者单位]:1.上海市奉贤区皮肤病防治所皮肤科，上海 201408；2.安徽医科大学第三附属医院暨安徽省合肥市第一人民医院皮肤科皮肤科，安徽 合肥230061

[通讯作者]：孙忠辉，E-mail: szhgyy3344@163.com；郭碧蓉，E-mail: guobr1983@163.com

长岛型掌跖角化病（Nagashima -type palmoplantar keratosis, NPPK, OMIM 615598）是一种常染色体隐性遗传病，表现为掌趾部位红斑和角化斑块、脱屑，伴手足多汗；皮损会影响手背、足背、腕部、踝部、跟腱等部位。NPPK属于弥漫性掌跖角化病。掌跖角化病（palmoplantar keratoderma, PPK）是以掌跖皮肤过度角化为主要特点的一组复杂疾病。目前已鉴定的25种遗传性PPK病可分为五类^[1]：（1）弥漫性PPK；（2）弥漫性残毁性PPK；（3）局灶性PPK；（4）伴PPK的外胚层发育不良；（5）综合征性PPK。 Kubo 等^[2]于 2013 年将 NPPK 的致病基因确定为编码丝氨酸蛋白酶抑制因子 B 亚型 7 的 SERPINB7 基因。本研究报道一NPPK家系，检测结果显示先证者具有纯合突变c.650-653delCTGT(p.S217Lfs*7)。这在既往文献未见显示，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 先证者，女，29 岁，出生后半年掌跖部位即出现弥漫性红斑，累及手、足背部，腕部及足踝和跟腱，伴手足多汗。近十年手足出现轻度异味，遇水后发白。皮肤科检查： 先证者双手掌趾弥漫性角化增厚，表面呈淡黄色;手足背、指趾背侧面、手腕内侧、足踝区和跟腱区有红斑、脱屑；指、趾甲正常。见图 1。父母为近亲结婚，但手足未见皮损。否认家族有类似患者。

1.2、外周血DNA提取：获得知情同意书后，抽取患者及其家属外周血2 ml。应用QIAamp DNA blood mini kit(QIAGEN公司，德国)提取基因组DNA，标化质量浓度至10ng/µ。另外，以同样的方法提取100例无亲缘关系的健康对照个体基因组DNA作为对照。

1.3、PCR扩增和直接测序：通过NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查取SERPINB7基因序列，采用Primer 5．0软件设计设计特异性引物对NF1基因的编码外显子2-8进行PCR扩增。扩增产物纯化后直接在ABI PRISM® 3700测序仪上测序（Applied Biosystems），测序结果与人类基因组SERPINB7基因序列 (NG_034150) 比较。使用Chromas 2.2软件进行解读，并用Geneious11.0 软件进行比对分析。

2 结果

将所测得的序列与 SERPINB7基因序列(NG_034150)比较，得到如下结果：c.650-653delCTGT(p.S217Lfs*7)丢失4个碱基CTGT，出现移码突变。即第 7 外显子CDS第650处丢失4个碱基CTGT，导致移码突变。原来的编码的蛋白质第217处TCT丝氨酸变为TTA亮氨酸，至第7个密码子移码为终止密码子TGA,出现终止。父母均为杂合突变。所有突变均由反向测序得到验证。同时在100 例无亲缘关系的正常人中进行此基因直接测序，未发现上述突变，见图2。

3 讨论

NPPK是常染色体隐性遗传病。1977 年，日本学者Nagashima 等首次报道该病，由此而命名^[3]。NPPK最初被认为是 Mal de Meleda 掌跖角化病一种较轻的临床亚型。2013年，Kubo 等对 3 个家系的日本 NPPK 患者进行全外显子组测序，确定SERPINB7基因为NPPK的致病基因。SERPINB7 基因位于 18q21.3，共有8个外显子，第一个不编码。编码丝氨酸蛋白酶抑制因子 B 亚型 7，具有抑制丝氨酸蛋白酶的作用。SERPINB7 功能的缺失可能导致 NPPK 皮损处蛋白酶活性过强。SERPINB7主要表达于表皮颗粒层及角质层上部^[2]。

目前，SERPINB7 基因共发现了 12种突变,包括无义2，移码7，剪接点2和错义突变1^{[2, 4-10]}。SERPINB7 有两处活性位点^[11]。由螺旋C和螺旋D构成的CD-loop，分别位于46–62和74–89位，即基因位置的3号外显子编码处。目前有p. 41_42del^[4]和p.Q73Lfs*17^[2]可能影响该活性。另外一处活性位点RSL（Reactive site loop）位于第 331~352 位氨基酸环。剩余的10个已知突变所致蛋白截断位置都介于两活性位点之间，所以都影响后者活性。活性位点环不能表达, 将会造成患者表皮颗粒层和角质层 SERPINB7 蛋白酶活性抑制作用丧失，丝氨酸蛋白酶活性不能有效抑制，从而导致角质形成细胞蛋白降解，角质层屏障功能破坏。因而患者手足易多汗，皮肤容易遇水肿胀发白。

根据形态学，NPPK属于遗传性弥漫性掌跖角化病。通常表现为出生时至 3 岁以内出现掌跖部位弥漫性界清红斑，伴有轻度至中度角化；常累及手足背部，腕内侧、踝和跟腱也是好发部位，肘膝部也可受累。遇水后角化皮肤可出现发白改变。皮疹稳定, 不随年龄增长出现明显进展或加重。患者常伴有手掌和足底多汗,易伴发皮肤浅表真菌感染。组织病理无特异性，患者一般情况良好，无毛发、甲、牙齿等其他外胚层受累表现，也无其他器官系统受累表现。弥漫性掌跖角化病中，症状具有多汗、遇水易肿胀发白的主要有NPPK、 Mal de Meleda 掌跖角化病、 Bothnia 型掌跖角化病^[12]、进行性掌跖角化病（Greither 病）等鉴别。见表 1。

迄今为止，文献显示SERPINB7 基因突变存在建立者突变c.796C＞T(p.R266*)（rs142859678），该突变的杂合在日本和中国的正常人群中携带频率分别为 2/89 和 6/197^[13]。目前国内文献报道的患者突变位点也是与这有关^[13-15]。另外，已经报道的NPPK病例，都是为日本、中国和韩国学者^[16]发现。因而可以推测目前该病主要存在于东亚人群。

本文所发现的突变首先由北京大学杨勇教授等报道^[8]。但报道的患者为复合杂合突变，另一突变位点为日本、中国最常见的建立者突变c.796C＞T(p.R266*)。该文献中先证者父母已亡故，无法验证。本研究所报道的父母是携带同一杂合突变，而且是存在近亲关系，为一典型常染色体隐性遗传模式家系。本文所发现的纯合突变丰富了SERPINB7 基因突变数据库。虽然是首次报道，但在先证者临床表型与其他已报道患者没有大的区别。推测双c.650-653delCTGT也是影响了活性位点RSL的功能。

目前NPPK 逐渐被国内外学者认识，国际公认的诊断标准还没建立。由于存在建立者突变，因此在国内应该还有许多患者没有被诊断明确。同时，掌跖角化病致病基因众多，这会更迫使我们在诊治此类患者时需要结合患者病史，临床表现和实验室检查并通过基因检测最终来明确NPPK诊断。

参考文献

[1] Perez C, Khachemoune A. Mal de Meleda: A Focused Review[J]. Am J Clin Dermatol. 2016,17(1):63-70.

[2] Kubo A, Shiohama A, Sasaki T, et al. Mutations in SERPINB7, encoding a member of the serine protease inhibitor superfamily, cause Nagashima-type palmoplantar keratosis[J]. Am J Hum Genet. 2013,93(5):945-956.

[3] NAGASHIMA M． Palmoplantar keratoses［M］// MIURA，OCHIAI K． Handbook of Human Genetics． Tokyo:Igaku Shoin，1977:23-27．.

[4] Zhang J, Zhang G, Ni C, et al. Nagashima-type palmoplantar keratosis in a Chinese Han population[J]. Mol Med Rep. 2016,14(5):4049-4054.

[5] Nakajima K, Ishiguro M, Shiohama A, et al. Novel frame-shift mutation in SERPINB7 in a Japanese patient with Nagashima-type palmoplantar keratosis[J]. J Dermatol. 2017,44(7):841-843.

[6] Katsuno M, Shiohama A, Aoki S, et al. Novel nonsense mutation in SERPINB7 and the treatment of foot odor in a patient with Nagashima-type palmoplantar keratosis[J]. J Dermatol. 2017 Jul;44(7):e146-e147.

[7] Mizuno O, Nomura T, Suzuki S, et al. Highly prevalent SERPINB7 founder mutation causes pseudodominant inheritance pattern in Nagashima-type palmoplantar keratosis[J]. Br J Dermatol.2014,171(4):847-853.

[8] Yin J, Xu G, Wang H, et al. New and recurrent SERPINB7 mutations in seven Chinese patients with Nagashima-type palmoplantar keratosis[J]. J Invest Dermatol. 2014,134(8):2269-2272.

[9] Shiohama A, Sasaki T, Sato S, et al. Identification and Characterization of a Recessive Missense Mutation p.P277L in SERPINB7 in Nagashima-Type Palmoplantar Keratosis[J]. J Invest Dermatol. 2016 ,136(1):325-328.

[10] Hua S, Miao X, Mao W, et al. A novel frameshift SERPINB7 mutation in a Chinese case with Nagashima-type palmoplantar keratosis: case report and review of the literature[J]. Clin Exp Dermatol. 2018 Jun 11. doi: 10.1111/ced.13682. [Epub ahead of print]

[11] Suzuki S, Nomura T, Mizuno O, et al. Identification of previously unknown SERPINB7 splice variants in patients with Nagashima-type palmoplantar keratosis reveals the importance of the CD-loop of SERPINB7[J]. Br J Dermatol.2015,173(5):1288-1290.

[12] Cao X, Yin J, Wang H, et al. Mutation in AQP5, encoding aquaporin 5, causes palmoplantar keratoderma Bothnia type ［J］. J Invest Dermatol, 2014, 134（1）: 284-287.

[13] 戴珊, 南栩, 赵红珊, 等. 长岛型掌跖角化病:SERPINB7基因突变位点研究[J].中国中西医结合皮肤性病学杂志,2017,(02):108-112.

[14] 刘成, 李常兴. 长岛型掌跖角化病一家系丝氨酸蛋白酶抑制剂B7基因的突变分析[J].皮肤性病诊疗学杂志,2018,(01):8-11.

[15] 多丽娜, 汪慧君, 林志淼, 等. 长岛型掌跖角化病二例 SERPINB7基因突变研究[J].中华皮肤科杂志,2016,(3):180-182.

[16] On HR, Lee SE, Nomura T, et al. Identification of SERPINB7 mutations in Korean patients with Nagashima-type palmoplantar keratosis[J]. J Dermatol. 2017,44(7):840-841.

附图：

图1.先证者手足皮损

先证者双手掌趾弥漫性角化增厚，角质层呈淡黄色。手足背、指趾背侧面、手腕内侧、足踝和跟腱有红斑、脱屑。指甲及趾甲正常。

图2先证者及其父母SERPINB7 基因直接测序结果

参考序列：NG_034150。先证者：纯合c.650-653delCTGT(p.S217Lfs*7)，父母均为杂合突变。

附表：

表 1 四型掌跖角化伴多汗的鉴别^[2]

Greither

Bothnian

Mal de Meleda

Nagashima

OMIM

144200

600231

248300

615598

遗传模式

常染色体显性遗传

常染色体显性遗传

常染色体隐性遗传

常染色体隐性遗传

致病基因

KRT1

AQP5

SLURP1

SERPINB7

患病率

罕见

罕见

1/100,000

日本：1.2/10,000中国：3.1/10,000

发病年龄

8- 10月

童年

幼年

出生一年内

病理

非表皮松解

非表皮松解

非表皮松解

非表皮松解

角化过度

厚

轻至厚

严重

轻

手、足背皮损

+

+

+

+

多汗

+

+

+

+

遇水变白

−

+

−

+

皮损影响它处

肘部、膝盖、弯曲区域和跟腱

−

膝盖和肘部，腔口周和眶周红斑

肘部、膝盖和跟腱

自发性截肢

+

−

偶尔

−

屈曲挛缩

−

−

+

−