泌尿感染疾病反反复复，痛苦万分，细菌生物膜或是元凶？

随着人们生活观念的变化和生活水平的提高，泌尿感染疾病（UTI）目前已经成为威胁人们健康的主要病种，可以说是继妇科疾病之后，女性最常见的疾病之一。

泌尿系统感染是泌尿道任何地方（包括膀胱和肾脏）的感染，是常见的感染类型，可能是由于卫生条件差，免疫功能受损，抗生素过度使用，杀精剂使用和性生活不当引起的。最常见的原因（占所有病例的90％）是大肠埃希氏菌从肠道转移到泌尿道。

不幸的是，大量临床资料显示，不少患者都是久治不愈的老病号，致使不少人走不出泌尿感染疾病的“怪圈”，饱受折磨，苦不堪言。于是，很多关于泌尿感染疾病的担忧和困惑在广大人群中流传。

大鼠膀胱灌注大肠埃希菌后制作成尿路感染动物模型。取膀胱黏膜标本通过扫描电镜及光学显做镜观查发现,大肠埃希菌感染后 2h可见细菌正在穿入膀胱黏膜光滑的表层，6h后在光滑的膀胱上皮表面出现大量包裹在类生物膜结构内的细菌聚集体形成的结节状细菌包涵体结构。免疫组化染色发现，这些结节状细菌包涵体具有典型大肠埃希菌生物膜形成的重要剌激物一1型菌毛和抗原 43 的表达以及生物膜基础成分(多糖-蛋白复合物）的表达,证实了这是一个细胞内的生物膜结构。这是人类第一次在上皮细胞内发现生物膜结构，此生物膜结构存在的意义在于急性感染时使得细菌存在于一个稳定的环境中，以应对机体自身免疫机制，避免被吞噬细胞吞噬，开且对抗菌约物治行产生抵制。有学者将此定义为细胞内细菌群落(IBCs)。 IBCs 只产生于表层膀胱上皮细胞，在感染 12h 后，宿主表层细胞脱落时,IBCs 通过激发未知信号通路在形成后数小时内自行消散，内部的细菌变成纤细的丝状溢出,并设法避免被快速清除而侵人邻近细胞或底层细胞，引发感染并启动新的IBCs 形成周期，建立更稳固的 IBCs。

己有学者对急性非复杂性膀胱炎患者的清洁中段尿标本进行检测，结果 14 例(18%)检测到 IBCs,33例(41%)检测到丝状细菌,对比于未检测到 IBCs 和丝状细菌的患者,这些患者的尿培养细菌计数更多,症状更重。IBCs的理论很好地解释了如此少量细菌进入膀胱就会引起严重感染症状的原因。临床研究也证买，68%的反复发作尿路感染是由于第一次发作同源细菌感染所致，而且对于反复发作尿路感染患者，虽然尿培养已经证实了尿液无菌，但仍有 24% 愚者的膀胱活检组织细菌培养阳性，这些存在于膀胱组织中的细菌有可能成为膀胱炎反复发作的细菌来源。但由于此方面的临床研究较少，所以尚不能定论，但 IBCs 的存在为反复发作膀胱炎的病因研究以及预防和治疗指导提供了很好的思路。

研究发现，在持续流动的、有细菌存在的人工尿液环境下,铜绿假单胞菌在特氟龙导尿管表面仅需要6h 就形成厂做菌落,24h就形成了结构完整的生物膜，基本上2d就可以。

研究显示,对比普通输尿管支架，留置3个月时，PC 支架可以明显减少细菌生物膜形成(普通支架70%，PC支架为 30%)。另外一坝研究，PC 支架对比普通支架,梗阻发生率为 6.6%：34%，支架移位发生率为4.4%：8%,疼痛发生率为 13.3%：19%,UTI发生率为13.1%：31%。这个结果令人振奋，但样本量小，尚需要大规模临床研究进一步证实其有效性。近年来，有一种低能表面声波 (low-energy surface acousticwaves, SAW)被用于导管相关细菌生物膜的治疗，其原理是 SAW直接传导至导管表面，可以抑制游离细菌黏附，达到干扰细菌生物膜形成的目的。己有研究显示,对于短期导尿和长达8周的导尿患者，低能

SAW 均能有效减少细菌生物膜的形成和菌尿的发生。

总体来说,泌尿外科生物材料使用增加说明大家已经认识到生物膜感染的重要性，但目前尿路导管的细菌生物膜感染仍然难以诊断、难以治疗，也缺乏理想的预防措施。未来目标在于发现新的方法诊断和量化生物膜感染、寻找有效的预防机制，以及寻找能有效清除生物膜内细菌的抗微生物制剂和理想的能抑制细菌黏附的表面调节剂。

一．细菌生物膜是什么？

生物膜（biofilm）是微生物存在的自然状态，J. William Costerton在19世纪70年代首先提出了生物膜概念及理论，作为描述表面上各种各样微生物聚集体的一个简单表达；是依附于某载体表面的由胞外多聚物(EPS)和基质网(matrix)包被的高度组织化、系统化的微生物被膜性聚合物。

细菌生物膜是聚集的微生物和它们的细胞外产物在固体表面形成的集落样结构，是细菌为适应恶劣环境而采取的一种生长方式。人体植入物表面生物膜的形成是一种自然现象，是细菌为了适应环境维持生存而发生的形态以及生理功能的改变，以微菌落为基本单位，包裹于多聚糖、蛋白等物质构成的基质中，形如膜状不可逆地附着于物体表面。细菌生物膜形成对于暂时或永久性人体植入物感染(如阴茎假体及人工括约肌)问题有重要的影响。

二．细菌生物膜形成

它的形成可以用下图所示的事件顺序进行简要描述：可逆附着到表面、不可逆附着、定植、成熟和扩散。区别于浮游细菌状态，由于缺乏氧气和其他营养物质，生物被膜内细菌的生长速度明显低于浮游细菌。

生物被膜形成示意图。（i） 浮游细菌在表面可逆附着；（ii）表面不可逆附着；（iii）外部基质网形成；（iv）形成三维结构；（v）脱落扩散。

1．调节膜形成 这一步的形成来自机体对外来异物的宿主反应。以尿路为例：异物进人尿路与尿液接触,尿液中的 Tamm-Horsfall 糖蛋白、各种离子、多糖及其他成分数分钟内聚集到异物表面,体液中的大分子成分如血清白蛋白、纤维蛋白原、 胶原与纤维连接蛋白在细菌微生物到达之前快速在异物表面形成调节膜。调节膜的形成改变了异物的表面特性，使得病原微生物容易在异物表面聚集。

2.病原微生物的聚集和黏附 这是生物膜形成的第二步。病原微生物黏附于异物表面的能力受到静电力和疏水性的相互作用、离子强度、渗透压和尿pH等的影响。其确切的生物学机制仍在研究中。

浮游细菌感受到环境的生存压力，通过释放细胞释放质子和信号分子感知异物平面的存在向异物表面聚集，通过疏水性和静电力的作用黏附于异物表面开始生长繁殖。

3. 表层生物膜结构的形成 此时微生物已经创造了一个躲避抗菌药物和宿主免疫反应的微环境。

依菌种不同，微菌落可能由 10%~25%细菌和75%~90% 胞外多糖 (exopolysaccharide,EPS)基质组成。

这些微菌落构成了生物膜的基本单元,并进一步发展形成具有异质性粗糙表面的结构。生物膜通过“水通道”运输必要的营养和氧气，同时内部也通过基因表达分泌化学信号调控细菌密度。生物膜调节细菌群体感应 (quorum sensing, QS) 即细菌细胞之间通过感受自诱导物来调控细菌群体行为的现象，是细菌调控生物膜形成的重要机制之一。通过信号分子调控基因表达,这种交流可使细菌表达不同的生理行为,包括病原微生物的毒性、对抗菌药物耐药的形成、生物膜的形成与生长等。生物膜的形成与微生物代谢、毒力因子表达等密切相关。群体感应现象与生物膜的形成相互依赖，生物膜提供菌体聚集场所，避免群体感应信号分子的扩散,聚集菌体的群体感应现象为生物膜的形成提供基础。群体感应糸统不仅可直接介导细菌生物膜的形成,还可调节胞内第二信使分子水平。

细菌在biofilm内生长环境变得极度拥挤，且代谢速率降低，细菌此时会表现出对抗生素明显的耐药性，并逐渐形成蘑菇样或塔状结构的成熟生物膜（mature biofilm）。

4.脱落扩散 细菌对biofilm内环境生长不适应，细菌可分泌胞外水解酶水解EPS，细菌脱离biofilm，成为游离状态细菌（plankton cell）。

这些从biofilm内释放出的游离菌可继续黏附、生长、定植、分化，附着于其他载体表面，形成新的biofilm。细菌就是以形成游离细菌—细菌生物膜—游离细菌—细菌生物膜这样的生存方式循环往复，不断地释放浮游细菌并引发持续性感染。

细菌形成生物膜过程图

三．生物膜细菌的抗菌药物耐药机制

biofilm耐药机制复杂，是多种因素综合作用的结果，主要包括以下几方面：

1.渗透限制学说认为，biofilm内细菌分泌的胞外多聚物EPS结构相对致密形成生理性屏障，使许多水溶性的抗菌药物难以渗入发挥作用，导致biofilm内的细菌对抗菌药物的敏感性降低。此外，由于biofilm中呈负电荷的EPS可与大量抗菌药物结合，使到达细菌部位的药物浓度显著降低；同时EPS中含有许多抗菌药物水解酶，如β-内酰胺酶，可使进入biofilm内的抗菌药物失活。由于以上原因，生物膜内细菌通常可以在抗菌药物浓度比杀死生物膜外同种游离细菌时高1000~1 500 倍的环境中存活。

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2.营养限制学说认为，营养物质和氧气等难以到达biofilm深部的细菌，由于受到营养供给的限制，处于缓慢生长或饥饿状态，生长代谢速率明显下降。这种状态的细菌对抗菌药物不敏感，或者使部分以细菌增殖过程为靶点的抗菌药物的疗效急剧下降,这是由于生物膜内细菌启动基因转变改变了细菌外膜、分子靶点(研究显示会出现 65~80个蛋白的改变)，而表型的改变对细菌耐药起重要作用。

3.适应性耐药机制：指细菌生物被膜在存在抗菌药物的情况下对耐药机制的暂时诱导，可以是特异性或非特异性的。特异性耐药机制包括β-内酰胺抗菌药物存在时诱导β-内酰胺酶，或者在黏菌素存在时G^-细菌外膜上的脂多糖变化。非特异性耐药机制包括外排泵的上调、野生敏感型细菌转化为耐药突变群或对药物诱导的氧化应激的保护等。乍一看，这些不同的机制涉及到生物被膜对抗菌药物的耐药性似乎是独立的，然而在铜绿假单胞菌生物被膜中有证据表明，调节因子(如转录调节因子brlR) 共同参与了对氧化应激的耐药性和外排泵表达的调节。

4.表型推断学说认为，biofilm内的细菌和游离状态的细菌在基因表达、生理结构上有显著差异，研究证实biofilm内部的细菌会表达一些专一性的保护因子，例如多药外排泵（multidrug efflux pumps）和压力响应性调节因子。此外，细菌生物膜还是质粒的重要储备库，可促进细菌耐药基因的获得和传播。

四．如何治疗生物膜感染

目的是抑制生物膜中的细菌生长，以减少炎症反应。我们重点阐述抗菌药物的合理应用。

大多数抗菌药物的药代动力学（PK）和药效动力学（PD）研究都是在浮游细菌上进行的，不宜将其结果外推至生物膜细菌。最小生物被膜抑制浓度（MBIC）和最小生物被膜清除浓度（MBEC）是在生物膜感染治疗中应该参考的界值，可想而知的是杀灭生物被膜细菌所需的抗菌药物浓度比浮游细菌高得多，事实上抗菌药物的MBEC在体内也往往难以达到。因此，仅通过全身使用常规剂量的抗菌药物似乎是不可行的，而通过高剂量，局部治疗以及联合治疗可在生物膜感染部位提供较高药物浓度，是提高抗生物被膜感染疗效的可能手段。

PK–PD与生物膜的抗菌效果相关。参数包括最小生物被膜抑制浓度（MBIC）、最小生物被膜清除浓度（MBEC）、亚最小生物被膜抑制浓度（Sub-MBIC）、抗生素后效应（PAE）、峰浓度（C_max）和抗生素时间-浓度曲线下的总面积（AUC）。PK–PD指数为C_max/MBIC、AUC/MBIC，以及抗生素浓度保持在MBIC以上的时间（T＞MBIC）。当MBEC超过C_max时，生物被膜很难在体内清除。

具体而言，生物被膜的治疗需要有效且渗透性良好的抗生素，以确保在生物被膜感染部位有足够浓度的有效抗生素。一般来说，大环内酯类、林可酰胺类、四环素类、利福霉素、喹诺酮类、夫西地酸、硝基咪唑、磺胺类和恶唑烷酮类比β-内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类和多黏菌素更好地渗透到组织和细胞中，抗菌药物组合例如美罗培南、黏菌素和阿奇霉素等抗菌剂是组合策略的良好候选者，能在生物被膜较深层氧张力降低和代谢活性低的条件下保持其活性。另外，一些广泛使用的抗生素如阿奇霉素、头孢他啶和环丙沙星，除了具有常规抗生素活性外，还具有群体感应抑制 (QSI) 活性。