文献第37期——肺癌进化中新抗原介导的免疫逃逸

癌症动态进化以适应免疫压力、转移和逃避治疗。追踪这些变化可以帮助我们改善诊断，更好地定制治疗，并预防复发，但这需要超出当前临床实践的密切监测。

TRACERx项目成立于2014年，旨在整合新技术来研究多达840名肺癌患者的癌症进化。

从分析肿瘤DNA的纵向变化，到研究如何在血液中检测到这些变化，并扩展到肿瘤免疫和组织微环境的表征，几个团队合作破译进化的模式和机制，旨在将其应用于改善肺癌的治疗。

Nature专栏里面都包含了哪些研究结果（注：包含Nature以及Nature子刊），属于Research的有14篇，该专栏针对Lung TRACERx，Nature期刊中也有TRACERx Renal等文献。

2019年3月（1篇）

· 肺癌进化中新抗原介导的免疫逃逸

2019年10月（3篇）

· T细胞受体库的空间异质性反映了肺癌的突变情况

· 克隆表达生物标志物与肺癌死亡率相关

· 肿瘤切除前肺静脉循环肿瘤细胞播散与疾病复发

2020年3月（3篇）

· 全基因组加倍与肿瘤进化中有害变异积累之间的相互作用

· 地理空间免疫变异阐明了肺腺癌的差异进化

· 肺癌中T细胞分化与肿瘤突变相关

2023年4月（7篇）

· TRACERx研究中肺癌的进化以及亚克隆选择的影响

· TRACERx研究中非小细胞肺癌转移的演变

· 肺癌及其转移阶段基因转录组进化

· 利用ctDNA追踪TRACERx研究中早期肺癌的转移

· 针对内源性逆转录病毒抗体加强肺癌免疫治疗

· TRACERx研究中肺腺癌的进化特征

· TRACERx研究中身体结构和肺癌恶病质的相关性

系列第一篇——

《Neoantigen-directed immune escape in lung cancer evolution》

《新抗原导向的免疫逃逸在肺癌演变中的作用》

正文

抗肿瘤免疫反应需要肿瘤抗原的功能性呈现及有效免疫效应的微环境。

然而，在未经治疗的早期肿瘤中，活跃的免疫系统在多大程度上塑造了肿瘤基因组的演变还没有得到很好的论证。

尽管免疫渗透和肿瘤克隆多样性之间的联系在以前的一些情况下已经被观察到了，但免疫系统是否在早期未经治疗的癌症中起主导的选择作用尚不清楚。遗传和转录异质性都可能混淆从单个肿瘤样本采样得出的结论，导致对免疫逃避机制的不准确解释。

为了确定未经治疗的非小细胞肺癌(NSCLC)中的免疫渗透，评估这种渗透在肿瘤之间和肿瘤内的差异，以及表征免疫逃避机制及其与临床结果的关系，我们整合了来自64个肿瘤的164个RNA-SEQ样本和来自83个肿瘤的234个肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)组织病理学评估，以产生一个组合队列，其中258个肿瘤区域来自(TRACERx)100队列中的88个预期获得的肿瘤。

我们探索了来自不同肿瘤微环境的选择压力如何影响新抗原的呈递，以及导致免疫逃逸的肿瘤内在机制及其对临床结果的各自影响。

免疫渗透的异质性

我们对基于电子免疫去卷积工具(方法)中的基准进行了评估，以估计多区域NSCLC TRACERx RNA-seq队列中的免疫渗透。

与其他转录学方法相比，Danaher等人免疫特征最佳地估计了非小细胞肺癌中的免疫渗透(Extended data Fig 1)。

[Extended data Fig.1

【确定了稳健的免疫渗透方法。a-d，每个免疫特征定义中使用的基因的表达与肿瘤纯度(a，b)和肿瘤拷贝数(c，d)相关。绘制了随机基因(n=1,000)或TIMER8(n=575)、EPIC7(n=98)、Danaher等11(n=60)、Rooney等16(n=100)和Davoli等6(n=75)免疫特征定义中的基因。构成每个特征定义的免疫基因的相关性的Spearman‘sρ值被绘制，用关联的P值着色。肺腺癌和肺鳞癌分别进行比较。免疫签名集的中位数ρ值由红线表示。图中显示了表达值与纯度或肿瘤拷贝数显著相关的基因的比例，并与一组随机基因进行了比较。对于我们考虑的每一个免疫特征，都有大量表达与肿瘤纯度负相关的基因(与随机选择的基因相比)和显著丰富的表达与肿瘤拷贝数正相关的基因(与随机选择的基因相比)。】

【E. 散点图显示病理TIL估计与Danaher等人的方法测量的CD8+T细胞之间的Spearman相关性(n=140)，流式CD8+T细胞估计与Danaher等人的11 CD8+T细胞之间的Spearman相关性(n=36)，T细胞受体测序丰度与Danaher等人的11 CD8+T细胞之间的Spearman相关性(n=72)，归一化的肝流CD8+T细胞估计与Danaher等人的11 CD8+T细胞(n=39)以及归一化的活体CD8+T细胞与Treg的比率和Danaher等人的CD8+细胞与Treg的比率(n=38)。蓝点表示肺腺癌肿瘤的区域；红点表示肺鳞癌肿瘤的区域。给出了所有肿瘤区(黑色)、肺腺癌肿瘤区(蓝色)和肺鳞癌肿瘤区(红色)的Spearmanρ值和P值。】

【F. 散点图显示了每种免疫渗透方法的病理TIL估计值和CD8+估计值之间的相关性(n=140个肿瘤区域)。肺腺癌肿瘤区域显示为蓝色；肺鳞癌肿瘤区域显示为红色。下面，每种方法显示了病理TIL估计和免疫细胞亚群之间的前六个相关性。蓝框表示正相关，红框表示负相关。根据假发现率对P值进行校正。】

【G. 例如，具有代表性的TRACERx TIL样本中CD8 T细胞定量的例子。如前所述，TIL是从手术切除的肿瘤区域中分离出来的，并进行了冷冻保存。解冻后的样品用定制的20标记抗体板染色，通过流式细胞仪检测T细胞的激活、功能和分化。】

在组织间和组织内观察到免疫渗透的范围很广（Extended data Fig 3），以及同一肿瘤的不同区域之间的相互作用。非监督的层次聚类法显示，每个组织学有两个不同的免疫簇，这对应于高水平和低水平的免疫渗透。

【Extended data Fig 3

组织学上免疫浸润的差异。

Danaher等人估计的CD8+T细胞在肺腺癌和肺鳞癌中的分布(n=145个肿瘤区域)。最小值和最大值由盒子图的极值点表示；中位数由一条粗水平线表示；第一和第三个四分位数由盒子边表示。采用双侧Wilcoxon秩和检验。】

个别肿瘤区域被分层为具有高水平或低水平的免疫渗透（Fig 1）。

【图1：非小细胞肺癌免疫浸润的异质性。图中显示了肺腺癌(A)和肺鳞癌(B)的A、b、TRACERx区域，按估计的免疫浸润物水平聚集在一起。每一行代表一个免疫细胞群，由Danaher等人11使用的方法估计。免疫亚群包括CD_4~+T细胞、B细胞、调节性T细胞、耗竭CD_8~+T细胞、CD_8~+T细胞、辅助性T细胞、自然杀伤细胞、CD_(56)−细胞、总TIL评分、总T细胞、CD_(45)+细胞、细胞毒细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞和巨噬细胞。每一列代表一个肿瘤区域。被分类为免疫渗透低水平(低免疫)的区域以蓝色显示；被分类为免疫渗透高水平(高免疫)的区域以红色显示。

如果患者肿瘤的所有区域都被归类为低水平的免疫渗透，则该患者以蓝色表示。如果患者肿瘤的所有区域都被归类为具有高水平的免疫渗透，则该患者以红色表示。具有包含不同水平免疫渗透的肿瘤的患者以橙色表示。在每个热图下方显示来自异种肿瘤的示例性病理图像，以显示来自同一肿瘤的具有高水平免疫渗透的区域和具有低水平免疫渗透的区域。】

与我们的聚类方法一致，与免疫渗透水平低的区域相比，免疫渗透水平高的肿瘤区域包含更高的病理TIL估计值(P=3×10−5)(扩展数据图4A)。

【通过使用病理TIL估计来合并缺乏RNA-SEQ数据的肿瘤区域。A，病理TIL估计的差异由来自RNA-seq的免疫簇(n=139)显示。】

由于我们观察到rna-seq衍生的免疫估计和病理TIL估计之间的强烈相关性(扩展数据图1e)，我们也使用病理TIL估计来对无法获得rna-seq数据的肿瘤区域进行分组(扩展数据图4b，c，方法)。

【B，绘制了每个肿瘤样本(肺腺癌121例；肺鳞癌90例)的所有区域病理TIL估计值。如果一个区域也有rna-seq信息可用，则该区域所属的免疫簇也显示为免疫高(红色)或免疫低(蓝色)。没有RNA-SEQ数据的肿瘤区域的免疫簇被注释为灰色。为患者提供的免疫等级也有高(红色)、低(蓝色)、异质(橙色)或未知(灰色)。对于所有的箱形图，最小值和最大值由该图的极值点表示；中位数由一条粗水平线表示；第一和第三个四分位数由框边缘表示。比较采用双侧Wilcoxon秩和检验。

C，根据单独使用RNA-SEQ数据或结合病理TIL估计得出的每种免疫分类中的患者数量。】

预测的髓系抑制细胞和肿瘤相关M2巨噬细胞的丰度与免疫激活细胞亚群呈负相关(扩展数据图4d，e)，这表明免疫抑制细胞可能影响免疫微环境。

11%的肿瘤区域--主要是肺腺癌--的病理TIL估计没有反映在它们被RNA-SEQ分配到的免疫簇中，这可能反映了由于用于TIL评分和提取RNA的镜像组织样本的空间差异而导致的采样的异质性。

【d，本文给出了Danaher等11的免疫细胞估计值与Jiang等12的免疫抑制细胞亚群的相关性矩阵(Spearman检验)。正相关用蓝色表示，负相关用红色表示。除非用黑色X. e标记，否则相关性显著。Jiang等12给出了肿瘤相关巨噬细胞M2 (TAM M2)和髓源性抑制细胞(MDSC)的免疫浸润估计，MDSC按免疫簇分裂(n = 163)。】

总体而言，63名患者的肿瘤具有统一的低水平(38个肿瘤(43%))或高水平(25个肿瘤(28%))的免疫渗透，25名患者的肿瘤在肿瘤区域之间的免疫渗透水平不同(28%)(扩展数据图4C)。

我们还发现，肿瘤内的异质性混淆了用于预测免疫检查点阻断反应的基因组和转录生物标记物。例如，TIDE分类在42个肿瘤中有17个是异质的(扩展数据图5A)，而异质浸润性肿瘤往往表现出不同的潮汐特征(P=0.05)(扩展数据图5A)。

同样，预测对PD-1免疫检查点阻断(IPRES)的先天抵抗力的转录特征和干扰素信号评分也是不同的(扩展数据图5B-D)。

【A.预测检查点封锁反应的生物标志物的异质性。对于有多个可用区域的患者(n=39)，每个肿瘤区域的TEDE基因签名得分显示在每个患者身上。使用虚线表示的阈值，将患者分为高潮(浅蓝色)、低潮(深蓝色)或异质性潮汐(橙色)得分。】

【B，对于有多个可用区域的患者(n=39)，每个肿瘤区域的IPRES基因签名分数显示在每个患者身上。使用先前定义的阈值13(虚线所示)，患者被分类为具有低IPRES分数(浅蓝色)、高IPRES分数(深蓝色)或异质性IPRES分数(橙色)。对于每个患者的每个肿瘤区域，对于具有一个以上可用区域的患者(n=38)，显示了扩展的Ayers等AL14干扰素签名。对于a-c，还给出了患者的免疫分类。

D，根据肿瘤是否具有不同程度的免疫浸润(n=38)，绘制了同一肿瘤肿瘤区域之间扩展的Ayers等AL14干扰素签名的最大差异。采用双侧Wilcoxon秩和检验进行比较。

E，每个肿瘤区域的肿瘤突变负荷显示在每个患者(n=93)。使用每兆数据库10个突变的阈值(虚线)，患者被归类为具有低(浅蓝色)、高(深蓝色)或异质性肿瘤突变负荷(橙色)的患者。

对于所有的箱形图，最小值和最大值由该图的极值点表示；中位数由一条粗水平线表示；第一和第三个四分位数由框的边缘表示。】

在最近的一项前瞻性研究中，高突变负担(每兆碱基＞10个突变)被发现与免疫治疗反应的改善有关。57例(21%)具有高突变负担的非小细胞肺癌中有12例至少有一个肿瘤区域包含低突变负担(扩展数据图5e)。异质性浸润的肿瘤也更有可能表现出异质性肿瘤突变负担(P = 7 × 10−4)(扩展数据图5f)。

【f，每个肿瘤的肿瘤组织学、免疫分类、肿瘤突变负担状态、TIDE分类和IPRES分类的总结(n = 93)。异质性免疫浸润性肿瘤具有异质性肿瘤突变负担状态和异质性TIDE评分(Fisher精确检验)。多重比较未作修正。】

在异质性肿瘤突变负担的肿瘤中，突变负担低的区域的肿瘤纯度明显低于突变负担高的区域，这表明将肿瘤基质含量作为突变负担评估的混杂因素是重要的(配对t检验，P = 0.04)(扩展数据图4f)。

免疫浸润与肿瘤演化

我们计算了来自同一肿瘤的肿瘤区域的所有两两组合在基因组和免疫空间中的距离度量，以探索肿瘤基因组特征与免疫微环境之间的关系(方法)。

我们观察到两个两两距离测量之间存在显著相关性(图2a，肺腺癌，P = 3.5 × 10−4;肺鳞状细胞癌，P = 2 × 10−3)。

【DNA水平上的免疫编辑。a，比较来自同一肿瘤的每两个肿瘤区域之间的两两基因组和免疫距离(肺腺癌，P = 3.5 × 10−4,n = 217;肺鳞癌，P = 0.002, n = 186)。】

在比较免疫和拷贝数改变距离时，我们观察到类似的关系，在肺腺癌队列中具有统计学意义(扩展数据图6a)。

【免疫浸润与肿瘤区域多样性的关系。a，比较同一患者肺腺癌(n = 91)和肺鳞状细胞癌(n = 60)的每两个肿瘤区域之间的配对拷贝数(cn)和免疫距离。】

这些结果支持免疫和癌症基因组景观之间的相互作用，以及基因组空间中不同的肿瘤区域具有不同的免疫微环境。

为了进一步探索这种相互作用，我们考虑了每个肿瘤区域的克隆结构与其免疫浸润之间的关系。我们比较了从RNA-seq数据估计的CD8+ T细胞浸润与区域内亚克隆多样性。肺腺癌呈显著负相关，鳞状细胞癌无显著负相关;CD8+ T细胞浸润高的区域亚克隆多样性较低（肺腺癌，P = 0.035， ρ= - 0.22;肺鳞状细胞癌，P = 0.91，ρ =−0.02)(扩展数据图6b, c)。

【b, c，对于每个肿瘤区域，将CD8+ T细胞评分与Shannon多样性评分进行对比。肺腺癌(n = 89) (b)和肺鳞状细胞癌(n = 50) (c)。】

与免疫浸润水平较高或异质性较高的肿瘤区域相比，来自免疫浸润水平均较低的肿瘤的肺腺癌区域表现出更大的亚克隆多样性(图2b, c;肺腺癌，P = 0.01)。

【b, c，显示每个肿瘤区域的Shannon多样性指数，按免疫分类分组。肺腺癌(n = 159) (b)和肺鳞状细胞癌(n = 103) (c)。最小值和最大值由箱形图的极值点表示;中间用粗水平线表示;第一和第三个四分位数用框边表示。采用双侧Wilcoxon秩和检验。】

与先前的发现一致，当使用病理学TIL估计(与肿瘤纯度无关，扩展数据图6d)对患者进行分层时，我们再次观察到存在高水平或异质性TIL的肿瘤区域的肿瘤多样性减少(扩展数据图6e, P = 0.02)。

【d，肺腺癌(n = 120)(蓝色)和肺鳞状细胞癌(n = 90)(红色)区域的病理TIL估计值与肿瘤纯度之间存在相关性。两种组织学均无相关性。斯皮尔曼检验是用来确定这种关系的。

e，每个肺腺癌肿瘤区域(n = 137)的Shannon多样性评分通过免疫分类绘制，仅由病理TIL估计确定。采用双侧Wilcoxon秩和检验进行比较。】

免疫编辑与免疫微环境

如果T细胞介导的对新抗原的免疫监视影响了癌症基因组的进化，人们就可以预测肿瘤中新抗原的耗竭和/或抗原呈递机制的破坏是免疫逃逸的机制。

可以想象，新抗原耗损可能发生在DNA水平(通过诸如拷贝数丢失等事件)、RNA水平(通过抑制含有新抗原的转录本)、表观遗传水平(通过沉默编码新抗原的基因组片段)或通过翻译后机制。或者，表达新抗原的肿瘤亚克隆可以通过纯化选择去除含有新抗原的亚克隆而被免疫系统优先消除。

我们预测新抗原及其克隆状态以研究新抗原耗竭。新抗原定义为预测结合亲和力＜ 500 nM或等级百分比评分＜ 2%的肽;强新抗原定义为预测结合亲和力＜ 50 nM或rank百分比评分＜ 0.5%。我们使用一种已发表的方法来量化每个肿瘤样本中DNA免疫编辑的程度。该方法比较肿瘤中观察到的和预期的新抗原数量，如得分＜1表明发生了DNA免疫编辑。我们发现肺腺癌和肺鳞状细胞癌中新抗原的观察值与预期值之间没有显著差异(扩展数据图6f)。

【f，肺腺癌和肺鳞状细胞癌(n = 92)观察到的预期免疫编辑评分比较。采用双侧Wilcoxon秩和检验进行比较。】

但我们注意到，这个分数取决于患者种系中杂合人白细胞抗原(HLA)等位基因的数量(P = 2.1 × 10−5，ρ = 0.43)(扩展数据图6g):如果存在更少的独特HLA类型，则观察到的新抗原将更少。

【g，观察到的:预期的免疫编辑评分通过肿瘤中存在的独特HLA的数量来表示(HLA- a、HLA- b和HLA- c杂合的患者将具有6个独特的HLA等位基因)(n = 90)。对于所有箱形图，最小值和最大值由图的极值点表示;中间用一条粗水平线表示;第一和第三个四分位数用框边表示。】

为了减轻这种偏差，我们研究了这种测量是否在肿瘤进化过程中发生变化，从每个肿瘤内的克隆事件到亚克隆事件。在浸润水平较低的肿瘤中，从克隆中观察到DNA免疫编辑及亚克隆突变(P = 8.8 × 10−3，配对t检验)(图2d)减少(即观察到的新抗原与预期的新抗原的比例增加)，这可能反映了祖先免疫活性微环境随后变冷。

【观察到的变化:预期免疫编辑评分从克隆(C)到亚克隆(S)显示了每个免疫分类(高，n = 24;异质性，n = 25;低，n = 33)。

采用双侧配对t检验。e，亚克隆拷贝数(CN)事件导致历史克隆新抗原(neo)丢失的例子。样本CRUK0071:R3中存在的新抗原在一个面板(黑色)中显示。这些新抗原在CRUK0071:R6(红色)中缺失。】

新抗原损耗也可能通过拷贝数损失发生在DNA水平上(图2e)。在这个队列中，88个肿瘤中有43个显示出至少一个历史克隆性新抗原由于亚克隆复制数事件而亚克隆丢失的证据(图2f，范围0-42%的克隆性新抗原)。

【e，亚克隆拷贝数(CN)事件导致历史克隆新抗原(neo)丢失的例子。样本CRUK0071:R3中存在的新抗原在一个面板(黑色)中显示。这些新抗原在CRUK0071:R6(红色)中缺失。f，顶部显示每个肿瘤复制数丢失区域上的历史克隆性新抗原(neo)的数量。下图为通过拷贝数事件亚克隆性丢失的克隆性新抗原的比例。】

为了确定历史上克隆性的新抗原通过拷贝数丢失是否比预期的偶然性更频繁地消除，我们将新抗原与非新抗原、非同义突变进行了比较。在免疫浸润水平较低的肿瘤区域，与非新抗原对应物相比，预测为新抗原的非同义突变更有可能发生在亚克隆拷贝数丢失的基因组片段上(P = 1.2 × 10−4)(图2g)。在低浸润水平的肿瘤中，在没有新抗原拷贝数丢失证据的肿瘤中更频繁地观察到亚克隆免疫编辑减少，这支持拷贝数丢失作为亚克隆免疫编辑机制的作用(P = 0.88 vs P = 2.2 × 10−4)(图2h)。

新抗原转录的抑制

接下来，我们确定每个新抗原是否在转录水平上被识别，以研究替代的新抗原耗尽机制。总体而言，在给定肿瘤的每个肿瘤区域中，只有33%的克隆性新抗原表达;我们观察到，在免疫浸润水平高(中位数，29%)或异质性(中位数，35%)的肿瘤中，与免疫浸润水平低(中位数，41%)的肿瘤相比，克隆性新抗原的普遍表达比例显著降低(图3a, b) (P = 0.01)。为了进一步研究新抗原转录本的下调是否反映了可能的免疫选择压力，我们考虑了与非新抗原相比，新抗原是否优先受到表达减少的影响，这种方法不受肿瘤纯度的影响。

【a，顶部显示了患者水平克隆和亚克隆表达(exp)新抗原(neo)的数量。底部是普遍表达的克隆性新抗原的比例。免疫等级分为高(红色)、低(蓝色)或异质性(橙色)。b，通过肿瘤的免疫分类绘制出在每个区域普遍表达的克隆性新抗原的比例(n = 63)。最小值和最大值由箱形图的极值点表示;中间用粗水平线表示;第一和第三个四分位数用框边表示。采用双侧Wilcoxon秩和检验】

在队列水平上，与非新抗原、非同义突变相比，具有完整HLA等位基因的肿瘤表现出新抗原表达的显著减少(图3c, P = 0.01)。

【c，转录新抗原耗损的比值比和95%置信区间由Fisher精确检验计算得出。值＜1表明，与非推定新抗原的非同义突变相比，推定新抗原的表达可能性较小。肿瘤通过HLA - LOH状态和免疫分类来绘制。】

此外，当肿瘤按免疫分类时，只有具有完整HLA等位基因和高水平或异质免疫浸润的肿瘤显示表达的新抗原的消耗，这表明免疫浸润肿瘤中的亚克隆可能通过HLA杂合性缺失(LOH)或通过抑制新抗原表达允许免疫逃避而被选择(图3c)。在没有HLA LOH和高水平免疫浸润的肿瘤中，当我们使用更严格的强结合新抗原定义时，新抗原表达的减少更为明显(扩展数据图6h)。

【h，通过Fisher精确检验计算，显示了强结合新抗原的转录新抗原损耗的比值比和95%置信区间。值＜1表明，与非推定新抗原的非同义突变相比，推定新抗原的表达可能性较小。肿瘤是通过HLA - LOH状态及其免疫分类来分解的。】

接下来，我们研究了是否有证据表明含有表达的新抗原的克隆存在负选择。我们观察到，与非同义的非新抗原(P = 5.5 × 10−10，优势比= 1.3)相比，肿瘤样本中低水平表达的基因中新抗原的富集(≤1转录本/百万)(扩展数据图6i)。当我们只考虑强新抗原时，这种富集更为明显(P = 6.8 × 10−13，优势比= 1.4)(扩展数据图6i)。

【i，显示了新抗原和强结合新抗原在非表达基因中的富集(与非同义的非新抗原相比)，这是用Fisher的精确测试计算出来的。多重比较未作修正。】

与非同义预测的非新抗原相比，在TRACERx中鉴定的新抗原也不太可能出现在来自癌症基因组图谱(TCGA)的1,019个NSCLC样本中一致表达的基因中(图3d)。在TCGA样本中一致表达的基因中，TRACERx队列中新抗原突变的产生在高水平免疫浸润的肿瘤中减少最多(P = 2.1 × 10−4，优势比= 0.77);然而，我们也观察到低(P = 1.8 × 10−3，优势比= 0.82)或异质性(P = 0.04，优势比= 0.88)浸润水平的肿瘤中这种减少。这与低水平免疫浸润的肿瘤曾经受到主动免疫微环境的选择压力是一致的(图3d)。

【d，显示了在TCGA NSCLC肿瘤中一致表达的基因中出现新抗原的比值比和95%置信区间，计算方法为Fisher精确检验。】

为了研究新抗原的甲基化状态作为新抗原抑制的机制，我们在TRACERx RNA-seq队列中对164个肿瘤样本中的79个(64名患者中的28名)以及邻近的正常组织(图3e，补充表2)进行了多区域减少代表性亚硫酸氢盐测序(RRBS)(方法)。在携带新抗原突变的基因中，与表达基因相比，未表达基因的启动子超甲基化增加了11.4倍(χ2检验，P = 1.6 × 10−4)(图3f)。为了确定观察到的下调是否是新抗原特异性的，我们比较了所有新抗原和不含新抗原的相同基因在纯度和倍性匹配的样品中的启动子超甲基化。总体而言，与没有新抗原的相同基因相比，未表达的新抗原更容易表现出启动子高甲基化(χ2检验，P = 0.045，优势比= 2.3)(图3，补充表3)。在表达的新抗原中，与纯度和倍性匹配的未突变样本相比，我们观察到启动子高甲基化状态没有差异(χ2检验，P = 0.67，优势比= 0.48)(图3h;这些发现表明，在进化的亚克隆中，免疫压力可能选择启动子超甲基化和新抗原沉默。

【f -h，表达的新抗原与未表达的新抗原(非)高甲基化基因启动子的数量(f)，未表达的新抗原与纯度和倍性匹配的对照组中相同基因的数量(g)，表达的新抗原与纯度和倍性匹配的对照组中相同基因的数量(h)。每次比较均显示优势比(OR)和P值(χ2检验)。多重比较未作修正。】

普遍破坏抗原呈递

抗原呈递中的缺陷会中断肿瘤抗原识别，这可能提供了另一种免疫逃避机制。为了了解这些免疫逃逸途径在治疗初始环境中的重要性，我们按区域绘制了它们的发生区域(图4a, b，扩展数据图7a，方法)。

【a, b，对于每个肿瘤区域，列出了克隆和亚克隆新抗原负担、免疫分类、HLA LOH和抗原呈递(pres)缺陷。患者预后和DNA免疫编辑(IE)在患者水平上进行描述。病人根据他们的免疫逃避能力被划分。DFS，无病生存。NA，不适用。】

【a，图4中探索的每一种潜在的免疫逃避机制都显示出来，分为它们的组成基因。根据患者的免疫逃避能力进行分类。拷贝数损失用蓝色表示，突变用绿色表示。】

抗原呈递的破坏——通过HLA LOH或通过影响主要组织相容性复合体(MHC)、HLA增强体和肽生成的突变——在两种肺组织学中都经常观察到(56%的肺腺癌和78%的肺鳞状细胞癌)。HLA LOH和影响抗原呈递机制其他组成部分的改变(方法)，包括B2M突变，倾向于相互排斥(肺腺癌，P = 9.3 × 10−4;肺鳞状细胞癌，P = 0.015)，这支持了抗原呈递功能障碍可以作为一种有效的免疫逃逸机制的观点。此外，与先前的研究结果一致，肺腺癌肿瘤的高度浸润区域容易发生HLA LOH (P = 3 × 10−3，优势比= 2.4)。

特别是HLA-C的丢失可能导致杀伤细胞免疫球蛋白样受体信号的丢失，该信号通过自然杀伤细胞的活性抑制消除。有两组HLA-C等位基因(HLA-C1和HLA-C2)，每一组对杀伤细胞免疫球蛋白样受体有不同的特异性。因此，来自杂合子患者(HLA-C1和HLA-C2)的肿瘤细胞在HLA-C等位基因丢失后，有望成为自然杀伤细胞介导消除的目标(扩展数据图7b)。

相反，来自纯合子HLA-C等位基因患者的肿瘤细胞可能会避免自然杀伤细胞介导的消除。与此一致的是，在HLA-C LOH后，在HLA-C1和HLA-C2杂合的肿瘤区域，自然杀伤细胞的浸润增加(P = 6.2 × 10−7)(扩展数据图7c)。在未经历HLA-C LOH的肿瘤中未观察到自然杀伤细胞浸润增加(P = 0.12)，这表明肿瘤微环境的这种变化是由于HLA-C抑制“自我”信号的丧失。

【b，图中显示了HLA-C1和HLA-C2杂合肿瘤中HLA-C位点的LOH如何导致自然杀伤细胞介导的破坏。c，根据HLA-C1和HLC-C2杂合状态，显示了存在(n = 45)和不存在(n = 90) HLA-C LOH的肿瘤区域的自然杀伤细胞浸润水平除以总TIL估计值(使用Danaher等人的方法11)。采用双侧Wilcoxon秩和检验进行比较】

免疫逃避能力是非小细胞肺癌的预后指标

最后，我们研究了在患者层面结合免疫浸润和免疫逃逸机制的预后能力。肿瘤被分类为表现出低免疫逃避能力(一致的高水平免疫浸润或无免疫逃避证据(DNA免疫编辑评分＞ 1，没有破坏抗原呈递))或高免疫逃避能力(至少有一个区域具有低水平免疫浸润，以及有缺陷的抗原呈递或DNA免疫编辑评分＜ 1)。肿瘤具有低免疫逃避能力的患者的无病生存期明显更长(P = 9.0 × 10−4)(图4c)。

【c、免疫逃避能力是由免疫浸润水平和免疫逃避机制的存在决定的。肿瘤免疫逃避能力低的患者可以延长无病生存期。HR，风险比。】

为了在与克隆性新抗原重要性相关的先前研究结果的背景下探索这些结果，我们还将患者分为两组(克隆性新抗原负担高与低)，定义为队列的上四分位数与下四分位数，如前所述。

与先前的结果一致，高克隆新抗原负担与肺腺癌(P = 0.022)和肺鳞状细胞癌(P = 0.025)的无病生存率增加相关(扩展数据图8a)。我们观察到克隆性新抗原与无病生存之间的关联不依赖于所使用的特定阈值(扩展数据图8b)，克隆性新抗原负担在包括分期、组织学、年龄、性别、包年和辅助治疗的多变量模型中仍然显著(P = 0.02)。相反，亚克隆新抗原负担或总新抗原负担与无病生存期之间没有显著关系(扩展数据图8c-e)。

【a, c, e，肺腺癌和肺鳞状细胞癌的Kaplan-Meier曲线。

根据克隆性新抗原负担的上四分位数(a)、亚克隆性新抗原负担的上四分位数(c)和总新抗原负担的上四分位数(e)对曲线进行分割。对于所有生存曲线，每个时间点的每组患者人数在时间点下方表示，并使用log-rank检验来确定显著性。b, d，显示了克隆性新抗原(b)和亚克隆性新抗原(d)负荷的每个阈值的风险比，这表明高克隆性新抗原负荷在广泛的阈值范围内仍然具有显著的预后影响。显著关联用红色表示;非显著关联用黑色表示。】

然而，当我们关注低克隆新抗原负荷的肿瘤时，肿瘤的免疫逃避能力仍然具有预后性(P = 5.3 × 10−3)，这表明在没有免疫逃避的情况下，即使低克隆新抗原负荷也可能足以引发有效的免疫应答(图4d)。

【d，低克隆新抗原负荷(最低三个四分位数)的肿瘤显示Kaplan-Meier曲线，按其免疫逃避能力划分】

此外，我们观察到具有高克隆新抗原负荷或低免疫逃避能力的肿瘤表现出显著增加的无病生存(P = 4.9 × 10−6)(图4e)。

在包括分期、组织学、年龄、性别、pack years和辅助治疗在内的多变量模型中，这种关联仍然显著(P ＜ 0.001)(扩展数据图8f)。这些数据表明，在预测临床结果时，考虑肿瘤和免疫微环境之间相互作用的许多方面是很重要的。

【e, Kaplan-Meier曲线结合克隆新抗原载量(上四分位数)和免疫逃避能力。对于所有生存曲线，每个时间点的每组患者数在时间点下方表示，并使用双侧log-rank检验确定显著性。】

【f，克隆新抗原负荷和免疫浸润分类被纳入多变量分析:这一组合作为预后的预测指标比单独的任何一个指标都更重要。其他肿瘤和临床特征也在多变量分析中得到控制。每个变量的风险比以95%置信区间显示在横轴上。采用Cox比例风险模型计算显著性。所有统计检验均为双侧检验。】

讨论

为了捕捉肺癌中癌症基因组进化和抗肿瘤免疫之间复杂的相互作用，我们整合了基因组学、转录组学、表观基因组学和病理学数据，以确定免疫微环境如何塑造肿瘤，并研究免疫逃逸影响肿瘤进化的机制，以及活跃的肿瘤免疫相互作用与临床结果的关系。我们的研究结果表明，患者之间和患者体内的免疫微环境是高度可变的，并且在同一肿瘤的不同区域之间可能存在显著差异——我们研究的肿瘤中，近三分之一的肿瘤表现出不同水平的免疫浸润。

我们的研究结果提供了证据，表明肿瘤进化是通过免疫编辑机制形成的，该机制在DNA和RNA水平上影响抗原呈递或新抗原突变本身。

与抗原呈递机制的中断受到强阳性选择的影响一致，我们发现，人类白细胞抗原杂合性缺失倾向于与其他形式的抗原呈递中断相互排斥，例如影响MHC稳定性、人类白细胞抗原增强体或多肽生成的突变。在DNA水平上，稀疏浸润性肿瘤被浓缩以消除克隆性新抗原，这表明染色体不稳定在驱动新抗原丢失中的重要性。

总体而言，肿瘤在表达的基因中显示的新抗原比预期的要少，这可能反映了历史上对新抗原的净化选择。具有高水平免疫渗透和完整的HLA等位基因的肿瘤也表现出转录水平的新抗原缺失，这表明这些肿瘤可能通过HLALOH或通过抑制新抗原的表达来逃避免疫消除-但很少两者兼而有之。我们发现启动子高甲基化是导致新抗原转录耗竭的潜在机制，这种机制会导致含有新抗原突变的基因的优先抑制。在我们研究的新抗原中，启动子高甲基化影响了约23%的新抗原的表达，这表明新抗原转录抑制的其他机制有待阐明。

通过结合免疫微环境和肿瘤免疫逃逸因子，我们定义了每个肿瘤的免疫逃逸能力的估计；高的免疫逃逸能力与较差的临床结果相关。由于TRACERx是对早期未经治疗的非小细胞肺癌的前瞻性研究，随着研究的成熟，在扩大的纵向队列中验证这些发现将是重要的。

即使在未经治疗的早期疾病中，克隆性新抗原也可能受到拷贝数丢失和转录抑制的影响，这一观察结果可能对预测免疫检查点阻断的反应和抵抗具有重要意义。以前已经证明，在检查点阻断治疗后，克隆性新抗原已经从复发样本中消除，这重塑了这些样本的T细胞受体谱系。出现在肺癌细胞适合性所必需的表达基因中的克隆性新抗原可能成为疫苗或过继细胞治疗的理想靶点。

新抗原转录物耗竭在多大程度上是对治疗和肿瘤扩散的动态反应，以及这种现象是否可以用来改善对免疫治疗的反应，目前尚不清楚。表观遗传免疫逃避支持表观遗传调节剂与免疫治疗联合使用，恢复或改善肿瘤免疫原性的潜力。一种可能性是，肺癌表达基因中新抗原的表观遗传抑制可能导致适应性成本。这可能揭示了最近在对检查点抑制剂治疗产生获得性耐药的肿瘤中观察到的现象，这些肿瘤在再次使用同一药物时再次产生反应。

我们的结果表明，早期未经治疗的非小细胞肺癌通常具有个体肿瘤内多种独立的免疫逃逸机制的特征，这强调了免疫系统对肿瘤进化施加的强大选择压力。我们的结果表明，在免疫治疗干预中，应该考虑和利用成功的免疫监测的有益作用和免疫逃避机制的多样性。