低分子肝素在不明原因复发性流产中的临床应用研究进展

复发性流产可累及1%～5%的育龄期女性，已知病因包括自身免疫异常、夫妻染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌功能异常、感染性疾病、血栓前状态，胚胎染色体或基因缺陷等因素，但目前仍有40%～50%的患者流产病因不明，被称为不明原因复发性流产（unexplained RSA，URSA）。研究表明URSA的发病机制和母胎免疫耐受失衡存在密切关联，因此，URSA 也可称为同种免疫型 RSA。目前，低分子肝素（low molecular weight heparin，LMWH）用于URSA的治疗取得了一定的进展。

1、LMWH的生物学特性

LMWH主要通过抗凝血酶灭活FⅩa和FⅡa而起到抗凝作用。LMWH具有抗凝效果好、出血风险小等优势［3］。LMWH血浆半衰期约3～7 h，约为UFH的8倍，一般在停药后约12～24 h凝血功能恢复正常。LMWH皮下注射生物利用度高，达90%以上。LMWH主要经肾脏排泄，不能穿过胎盘屏障，乳汁当中也无分泌，LMWH是妊娠期和哺乳期抗凝治疗的首选药物。研究表明LMWH除了抗凝作用以外，还具有抑制抗磷脂抗体（aPLs）免疫反应、保护血管内皮、调节母胎免疫反应以及抑制滋养细胞凋亡等生物学作用［4］。

2、LMWH对母胎免疫耐受机制的调控

母胎界面存在复杂而有序的免疫调控网络，子宫蜕膜中的免疫细胞以及胎儿滋养细胞等相互作用，实时调控母胎免疫以达到最佳的免疫耐受状态。免疫耐受的破坏会引起母体对胎儿产生类似组织器官移植的免疫排斥反应，严重者可引发自然流产。既往的治疗手段都是基于一定研究证据的探索性治疗，如淋巴细胞主动免疫治疗、静脉输注免疫球蛋白或脂肪乳剂、糖皮质激素、环孢素等方法，疗效不肯定，缺乏高级别的研究证据支持［6］。鉴于LMWH具有除抗凝以外的免疫调节等作用，LMWH在URSA治疗中的作用及机制也取得了一定的进展。

在妊娠早期，母胎界面处于促炎状态，介导细胞免疫和炎症反应的Th1细胞亚群占主导地位，通过组织重塑和血管生成来调节滋养细胞的侵袭，有助于胚胎的植入。促炎反应较弱及植入过程不充分可能是导致RSA的因素之一。体外实验显示，LMWH可激活蜕膜巨噬细胞和Th细胞的促炎作用［7］，调节趋化因子的分泌模式，使巨噬细胞分泌与Th2相关的趋化因子（c-c motif）配体22（CCL22）水平降低，分泌与Th17相关的趋化因子（c-c motif）配体20（CCL20）水平升高。在妊娠早期应用LMWH可能促进母胎界面达到有利于胚胎植入的理想炎症状态。

在植入阶段结束后，母胎界面Th1免疫优势逐渐转移成为Th2主导，促进母胎免疫耐受状态的进一步形成。有研究显示URSA的发生与Th1/Th2平衡失调有关，表现为Th1细胞因子表达上调，Th2细胞因子表达下降［5］。LMWH在很多实验和临床研究中发现具有抗炎作用。中性粒细胞捕获网（neutrophil extracellular traps，NET）在无菌条件下可破坏血管壁、促进血栓形成，在胎盘中大量累积的NET可能引起RSA等妊娠相关疾病。实验表明预防剂量的LMWH会抑制中性粒细胞与血小板之间的相互作用，降低中性粒细胞对炎症的反应性，减少NET的产生，这可能是LMWH抗炎的重要机制［8］。CD4+CD25+Foxp3+Tregs通过表达协同抑制分子（PD-1和CTLA-4）和分泌免疫抑制性细胞因子（TGF-β和IL-10），抑制母体免疫反应，维持正常妊娠。在URSA患者中，蜕膜Treg的水平下降常伴随着Th17细胞数量的增加，外周血的Th17/CD4+Treg细胞比例也明显升高［9］。在一项关于LMWH治疗易栓症患者的研究中发现，与对照组相比，LMWH治疗组患者在妊娠中、晚期的外周血Treg数量明显增加并接近正常妊娠水平。动物实验发现，与野生型小鼠相比， FV-Leiden纯合突变小鼠蜕膜和胎盘中的Tregs明显减少，用LMWH处理后，可使小鼠蜕膜中的Treg水平正常化，明显增加蜕膜 IL-10 mRNA的表达，降低所有基因型小鼠的Caspase-3 活性，表明LMWH可能通过抗凋亡作用以增加Treg的数量［10］。

3、LMWH促进蜕膜化进程

子宫内膜蜕膜化旨在为胎儿创造良好的内分泌和母胎界面免疫微环境，蜕膜化受损也可能与RSA的发生有关。研究发现LMWH可显著增加子宫内膜基质细胞（ESC）泌乳素和胰岛素样生长因子的表达水平，延缓胰岛素样生长因子结合蛋白的产生［11］。体外实验表明，经肝素处理的蜕膜化ESC通过在细胞核中积累调节因子FOXO1以增强超氧化物歧化酶SOD2表达，从而增强蜕膜化ESC的自由基清除潜力，防止氧化应激引起的细胞凋亡［12］。这些研究证据提示LMWH可能是促进ESC蜕膜化、改善胚胎植入环境的重要物质。

4、 LMWH与表观遗传

表观遗传机制同样参与了母胎免疫耐受机制的建立和维持。在人类的研究中发现，接受了LMWH治疗的URSA患者，大多数差异表达的 miRNA（miR 374a-5p、19a-3p等）能恢复到与对照组相当的水平［15］，表明LMWH参与了表观遗传的调控，LMWH 修饰的 miRNA 表达水平正常与否可能是治疗URSA的目标之一。

5、LMWH对滋养细胞的调控

充分而适当的滋养层细胞侵入可促进母体子宫螺旋动脉重塑和胎盘血供，提供有利的胚胎植入环境。研究显示，URSA患者滋养层中的胱硫醚β-合酶/硫化氢信号失调，导致血管生成减少，滋养细胞侵袭性降低，基质金属蛋白酶（MMP-2）和血管内皮生长因子（VEGF）表达异常，这可能是URSA的发病机制之一［16］。动物和体外实验显示，LMWH可以减少细胞黏附蛋白E-钙黏蛋白的表达，增加MMPs的浓度和活性，从而改善滋养层细胞的分化和侵袭［4］。一项体外实验表明，LMWH可增加蜕膜中肝素结合表皮生长因子的表达和分泌［17］，该信号通路激活可以刺激滋养细胞分化、侵袭并减少氧化应激期间的滋养细胞凋亡。

6、LMWH对血管内皮的调控

VEGF通过增加血管通透性、刺激内皮细胞趋化和有丝分裂以调节血管生成，在胚胎发育过程和母体血管发育适应妊娠中起到重要作用。研究表明，URSA患者存在VEGF基因的G634C和C936T等多态性变异，这些变异会影响基因的转录水平，降低VEGF和其他血管生成因子的水平，增加URSA的易感性［18］。在孕妇中进行的体内试验表明，LMWH可降低血压，改善内皮功能，改变血管生成蛋白的循环水平，对妊娠期母体血管系统的顺应性改变起重要作用［19］。体外实验发现，LMWH可与血小板/内皮细胞黏附分子1（PECAM1）结合并干扰其作用，从而降低血管内皮的炎症反应［20］，这可能是其保护血管内皮的重要机制之一。

7、 LMWH治疗URSA的临床研究进展

7.1 LMWH对活产率的影响 有5项共计纳入855例URSA参与者的临床研究表明，与对照组相比，LMWH干预组的URSA患者的活产率有显著提高。Monien等［21］对164例排除血栓形成倾向的早期和晚期流产妇女进行了前瞻性观察研究，在确认妊娠后每天皮下注射达肝素钠5000U直至孕37周，LMWH组的活产率为83.8%。另一项前瞻性观察研究纳入了150例URSA女性，实验组分为皮下注射4000 U/d的依诺肝素组（n=50）和3500 U/d的亭扎肝素组（n=50），对照组不采用LMWH（n=50），妊娠6周开始使用LMWH，持续至流产或分娩，LMWH 组和对照组的活产率差异有统计学意义（85% vs. 66%，P=0.007）。亚组分析发现依诺肝素组和亭扎肝素组的活产率无统计学差异［22］。

纵观目前的研究，虽然一些观察性研究提示LMWH能够改善URSA患者活产率，但并未得到RCT研究证实，需要设计更加严谨科学的大样本、随机、双盲、多中心的临床研究进一步加以验证。

7.2 LMWH对妊娠并发症的影响 URSA患者妊娠并发症包括早产、先兆子痫、胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）、低出生体重和宫内胎儿死亡，发生率较正常妊娠明显增加［4］。一些研究观察了LMWH对URSA患者妊娠并发症的影响。1篇系统性综述评估 LMWH或阿司匹林或两者联合对URSA患者活产率的影响以及对妊娠并发症的影响，发现LMWH并不增加或者降低早产、先兆子痫、FGR和先天性畸形等产科并发症的发生率［31］。Shaaban等［24］的RCT显示研究组和对照组的先兆子痫发生率无统计学差异。Li等［32］的Meta分析显示，与对照组相比，使用LMWH治疗的URSA孕妇的新生儿出生体重和FGR发生率无统计学差异。一项回顾性研究显示，晚期产科并发症的发生率，在使用和不使用LMWH的URSA患者之间差异无统计学意义［33］。

综上所述，就目前的研究证据而言，在URSA患者中使用LMWH并未增加或减少妊娠并发症的发生率。

7.3 LMWH在妊娠期使用的安全性 尽管LMWH 作为抗凝剂具有出色的安全性，使用该药物的患者可能出现的并发症仍应得到重视，例如出血、紫癜性皮疹、过敏、肝素诱导的血小板减少症（heparin induced thrombocytopenia，HIT）［34］、肝肾功能受损和骨质疏松症等。

HIT是在使用肝素类药物后出现了抗体介导的免疫反应的结果，表现为血小板减少、动静脉血栓形成，严重者可致残甚至死亡，使用UFH人群中常见，LMWH罕见。Yuksel等［22］、Lefkou等［35］研究均显示，接受LMWH的女性的HIT发生率无显著增加。上海交通大学医学院附属仁济医院观察了妊娠期使用LMWH（依诺肝素、达肝素、那曲肝素）对血小板计数的影响，未发生HIT事件［3］。

肝功能受损是LMWH常见的不良反应之一，但大多较轻且可逆。Bai等［3］观察了妊娠期使用LMWH肝功能受损的发生率，达肝素6.7%、依诺肝素8.0%、那曲肝素10.5%。注射肝素类抗凝剂导致肾功能受损罕见。Bai等［3］同时观察了妊娠期使用LMWH肾功能受损的发生率，结果未发现达肝素组有肾功能受损，依诺肝素0.88%、那曲肝素0.66%［3］。

由于LMWH属于动物来源的多组分混合物，过敏是LMWH常见不良反应，常表现为皮肤瘙痒、皮疹、荨麻疹、局部红肿，罕见的有急性喉头水肿、过敏性休克等。Bai等［3］研究了妊娠期使用LMWH瘙痒的发生率，达肝素6.6%、依诺肝素9.7%、那曲肝素30.9%；皮疹发生率，达肝素4.4%、依诺肝素0%、那曲肝素4.6%；局部红肿发生率，达肝素2.2%、依诺肝素1.8%、那曲肝素13.8%；硬结发生率，达肝素13.3%、依诺肝素20.3%、那曲肝素42.1%。

肝素诱导的骨质疏松的特征是低骨量和与骨脆性增加相关的微结构改变，以及随之而来的骨折风险增加。在高剂量下，达肝素钠会对骨钙素等骨形成标志物产生明显的抑制作用，可能导致肝素性骨质疏松症［35］。动物实验则表明LMWH可降低骨矿物质含量/骨量的比率，降低骨形成率，降低骨骼断裂负荷等骨骼机械性能［36］。妊娠期接受LMWH治疗的妊娠相关骨质疏松性椎体压缩性骨折病例也有散在报告［37］。然而目前的研究普遍表明，孕期长期使用LMWH治疗与生理妊娠相比，骨质减少的发生率无明显变化。

8、展望

研究表明，URSA的发病与母胎免疫耐受失衡有关，但其具体机制尚不完全清楚。LMWH作为妊娠期首选的抗凝药物，同时具有免疫调节、促进滋养细胞浸润、保护血管内皮等作用，因此被逐渐应用于URSA的治疗。虽然取得了一定的进展，但LMWH能否改善URSA患者的再次妊娠结局，目前尚缺乏足够的证据，未来需要进一步开展基础研究以阐明LMWH调控母胎免疫耐受的机制，同时开展多中心、大样本的随机对照研究以明确LMWH在URSA治疗中的确切效果。