用石蜡切片检测端粒酶RNA基因诊断与鉴别子宫颈上皮内瘤变1级与2级的意义 何春年 徐明堂 荀文娟【摘要】 目的 探讨在石蜡切片上用FISH技术检测TERC基因对诊断鉴别诊断CIN1级与CIN2级的实用意义。方法 选取手术切除及活检的子宫颈组织,有效样本137例,其中正常宫颈鳞状上皮20例, CIN1级组织46例,CIN2级组织49例,HE染色难以确定CIN1/CIN2级组织22例。采用FISH技术在石蜡包埋组织上检测TERC基因拷贝数增加的情况。 结果 正常宫颈鳞状上皮中无TERC基因拷贝数的增加,CIN1级组中TERC基因扩增率15.2%(7/46),CIN2级组中TERC基因扩增率47%(23/49),并且出现大量的三倍体、四倍体及非整倍体扩增,两组之间差异具有统计学意义(p<0.05)。CIN1/CIN2级组中TERC基因扩增率27.8%(5/22)。组间两两比较:正常宫颈鳞状上皮组与CIN1级组组间比较差异无统计学意义(p>0.05);正常宫颈鳞状上皮组与CIN2级组组间比较差异有统计学意义(p<0.05);CIN1级组与CIN2级组组间比较差异有统计学意义(p<0.05)。TERC 基因扩增在鉴别CIN 1级与CIN 2级中的敏感度为46.9%,特异度为84.7%,准确度为65.0%,阳性预测值为 76.6%,阴性预测值为60%。结论 当组织学上鉴别CIN1级与CIN2级有困难时,在石蜡包埋组织切片上应用FISH技术检测TERC基因,发现拷贝数增加可有助于CIN2级的确诊,也预测其有恶性进展的风险;反而无TERC基因异常,可确认为CIN1级,无恶性进展风险。TERC基因检测具有实用价值及应用前景。【关键词】 子宫颈上皮内瘤变;FISH检测;TERC基因;基因拷贝数Detection of TERC gene amplification in differential diagnosis between CIN1 and CIN2 onno Paraffin-Embedded Tissues HE Chun-nian *,XU Ming-tang, XUN Wen-juan. Department of Pathology, Hebei General Hospital Shijiazhuang 050051, ChinaCorresponding author: HE Chun-nian(E-mail:hechn2@163.com)[ABSTRACT] Object To study practical significance of the detection of TERC gene amplification by FISH in the CIN1 and CIN2 tissue microarray. Method Select the 137 cases of cervical tissue samples, which 20 cases of normal cervical squamous epithelium, 46 cases of CIN11Ⅰ, 49 cases of CIN2Ⅱ and 22 cases of CIN1/CIN2. With FISH method detected TERC gene amplification. Result TERC gene have no amplification in the normal cervical squamous epithelium. TERC gene amplification increased by 15.2% (7/46) in the CIN1, by 47% (23/ 49) in the CIN 2, by 27.8% (5/22) in CIN1/CIN2. There were significant differences between any two 作者单位:050051 石家庄,河北省人民医院病理科(何春年、徐明堂、荀文娟) 通讯作者:何春年(E-mail:hechn2@163.com Tel:0311-85988639).基金项目:河北省自然科学基金项目:H2012307001.groups (p<0.05). normal cervical squamous group and CIN1 level group difference was not statistically significant (p>0.05); groups of normal cervical squamous epithelial groups with CIN2 level of group difference was not statistically significant (p<0.05); the CIN1 level group CIN2-level group group difference was statistically significant (p <0.05).TERC gene amplification in the identification of CIN 1 lesions with CIN 2 lesions were sensitivity 46.9%and specificity 84.7%and accuracy of 65.0%and a positive predictive value of 76.6% and negative predictive value of 60%. Sensitivity of the TERC gene amplification was 62.26%, the specificity was 92%, the accuracy was 71.79%,the positive predictive value and negative predictive values were 94.29% and 53.49% . Conclusions The method is feasible and reliable results, in application of FISH detection TERC gene amplification on CIN1-2 paraffin section. It is a expansion to detected TERC gene amplification on histologic paraffin section. The having theoretical significance and practical value in TERC gene amplification could be as a differential diagnosis between CINⅠand CINⅡ, as well as estimating the development of CIN to a cervical cancer. 【Key words】 CIN; FISH; TERC-gene; Gene amplification; 由于HPV的传播及诊断技术的提高,子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)的发病率有上升趋势。CIN发展为宫颈癌是一个长期的过程,早期诊断和恰当的治疗完全可能阻止其发展为宫颈癌,并彻底治愈。就妇科临床治疗而言,CIN1级可随访观察,而CIN2级则需要锥切等手术治疗,故正确诊断CINⅠ级与CINⅡ级对临床治疗的指导意义是显而易见的。然而病理学诊断是形态学的方法,有时因人为因素的影响及病变不典型等因素很难将CINⅠ级与CINⅡ级准确地鉴别出来,一些病例导致治疗过度或治疗不足。因此迫切需要一种敏感、准确、稳定及可靠的方法或指标来辅助病理学诊断。有研究表明3号染色体长臂拷贝数增加尤其是TERC基因的拷贝数增加在细胞学上鉴别宫颈高度癌前病变与低度癌前病变的敏感性及特异性均在90%以上[1],推断检测TERC基因的拷贝数增加有助于CIN1级与CIN2级的正确诊断。我们前期在组织切片上对子宫颈癌和CIN的TERC基因检测的研究有相近的结论[2,3]。本研究在宫颈组织石蜡切片上,采用FISH技术检测TERC基因,探讨其在CIN1级与CIN2级组织中的拷贝数变化情况,对其诊断分级、鉴别诊断的作用,预测恶性进展风险及其临床病理的实用价值。 材料与方法1. 一般资料: 选取河北省人民医院2011年8月~2012年8月间手术切除或活检子宫颈标本150例,组织用中性缓冲福尔马林液固定,石蜡包埋;得到137例有效样本,进行FISH检测。其中正常对照宫颈鳞状上皮20例,取自因子宫平滑肌瘤或子宫腺肌症而切除的标本,经光镜下证实鳞状上皮无异常者,年龄25岁~54岁,平均年龄42岁; CIN1级46例,年龄23岁~60岁,平均年龄41.5岁;CIN2级49例,年龄24岁~58岁,平均年龄41岁;CIN1/CIN2级22例,年龄25岁~56岁,平均年龄40岁。全部标本首先由高年资病理医师分析筛选,分类。最后利用十人共览显微镜对所有标本进行联合复诊,将分类最终统一的标本纳入研究样本。这样复核的意义在于避免因主观因素的影响而导致的分级不准确。2.CIN1级与CIN2级病理学诊断标准CIN1级:鳞状上皮棘细胞层下1/3区域细胞核异型,罕见核分裂象,上2/3区域轻度异型,有成熟现象。CIN2级:鳞状上皮棘细胞层的上层、下层细胞异型均明显,核分裂象一般限于上皮下2/3区域以下,上皮上1/2有成熟现象[4]。?3. 探针及FISH检测方法:3.1探针:hTERC/CSP3 DNA双色荧光探针由北京金菩嘉医疗科技公司提供。hTERC DNA 探针杂交到 3 号染色体长臂(q26.3),荧光信号为橘红色 (Rhodamine);CSP3 DNA探针杂交到3号染色体着丝粒 (3p11.1~q11.1),荧光信号为亮绿色 (FITC)。3.2石蜡切片预处理:切取4μm厚的切片,置于65℃烤箱烤蜡(过夜);新鲜二甲苯脱蜡10min×2,随后100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、85%乙醇、70%乙醇中各2 min,复水后浸入去离子水中3 min;90℃的蒸馏水处理30分钟;室温下蒸馏水洗片5min×2;置于0.4%胃蛋白酶溶液中,37℃孵育20分钟;室温下2XSSC液洗片5min×2;置于室温的10%中性缓冲福尔马林液中固定5min,于室温下2XSSC液洗片5min×2,依次置于70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各2分钟脱水,室温自然干燥。 3.3 FISH操作步骤(避光环境):探针液 (7μl杂交缓冲液、1μl去离子水和 2μl探针)在(78±1)℃的水浴中变性5min;探针液置于45℃的水浴锅中;组织切片在(78±1)℃在70%甲酰胺液中变性5min后,依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各2分钟,梯度脱水后室温自然干燥;于 56℃烤片机上预热切片片刻后将10μl探针液滴于杂交区域,加盖盖玻片,密封置42℃湿盒中杂交过夜。次日玻片依次置于预热46℃的50%甲酰胺洗液10min×3、2×SSC溶液10min、0.1%NP-40混合溶液中5min洗涤;室温70%乙醇漂洗3min,避光自然干燥后加15μl DAPI复染液复染,立即盖上盖玻片,10~20分钟后荧光显微镜下观察。4.FISH检测判读方法与标准依据FISH技术检测宫颈细胞学TERC基因的方法[1,4,5],参考FISH方法乳腺癌HER2检测指南[5]等文献及探针试剂盒说明,在暗室中用OLYMPUS B×51荧光显微镜,DAPI/FIFC/TexasRed三色滤光镜激发,100x物镜下观察间期细胞,判断FISH信号;用VideoTest公司提供的FISH分析软件分析图像,评估整个切片的CSP3和TERC基因双色探针杂交情况。红色、绿色信号互为对照,淋巴细胞、基质细胞、内皮细胞的杂交互为对照。组织细胞中≥75%的细胞核显示出双色信号,视为杂交成功(图1);否则为杂交失败[6]。细胞拷贝数的确定:选择细胞核大小一致,胞核边界完整、DAPI染色均一,细胞核无重叠、红绿色信号清晰区,确定细胞内FISH信号数的最大值,超过10%-20%的细胞所出现的信号数作为细胞拷贝的指标,用这种方法,病变可分类为二倍体、四倍体和非整倍体(异倍体),再于病变的其他区域计数100-200个细胞的TERC基因的拷贝数,以验证拷贝数(倍体数)的判断。5. 统计学处理:统计学分析采用SPSS16.0统计分析系统,以α=0.05为检验水准,当P<0.05时差异有统计学意义。样本率之间的比较采用卡方检验;多样本率之间两两比较采用卡方分割法。敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值计算公式:敏感度=a/(a+c)×100%,特异度= d/(b+d)×100%,准确度= a+d/(a+b+c+d)×100%,阳性预测值为= a/(a+b)×100%,阴性预测值= d/(c+d)×100%。(a:CIN1级中拷贝数增加的例数,b:CIN2级中拷贝数增加的例数,c:CIN1级中拷贝数不增加的例数,d:CIN2级中拷贝数不增加的例数。(见表2)结 果1.FISH实验结果:荧光显微镜镜下观察:可见组织轮廓清晰,细胞核被DAPI复染呈蓝色,可见细胞核的面积差异较大;荧光信号随机分布于核染色区内,细胞核边界清楚,TERC基因探针杂交为橘红色荧光信号;CSP3(3号染色体着丝粒)探针杂交为亮绿色荧光信号,荧光信号均清晰。正常子宫颈鳞状上皮为二倍体细胞,未见TERC有异常杂交信号(出现信号数大于2) (图1);CIN1级中少部分病例出现TERC基因的异常杂交信号,主要位于中-底层(图2);而CIN2级中3倍体、4倍体、非整倍体及TERC基因的异常杂交信号明显增多,出现在中-表层(图3-4)。部分病例亦可见明显的多体信号成片融合现象(图5)。2. TERC基因检测在CIN1-2级组织中拷贝数增加的情况:正常宫颈鳞状上皮组中TERC基因无扩增,0(0/20),CIN1级组中TERC基因扩增的情况为15.2%(7/46),CIN2级组中TERC基因扩增的情况为47%(23/49),并且出现大量的三倍体、四倍体及非整倍体扩增,两组之间差异具有统计学意义(p<0.05)。CIN1/CIN2级组TERC基因扩增的情况为27.8%(5/22)。在光镜下将其初步分级为CIN1级的病例8例,其中TERC基因扩增者1例,无扩增者7例;CIN2级的病例14例,其中扩增者4例,无扩增者10例。组间两两比较:正常宫颈鳞状上皮组与CIN1级组组间比较差异无统计学意义(p>0.05);正常宫颈鳞状上皮组与CIN2级组组间比较差异有统计学意义(p<0.05);CIN1级组与CIN2级组组间比较差异有统计学意义(p<0.05)。(表1-2)。表1 TERC基因在CIN1与CIN2病变中拷贝数增加的比率组别nTERC基因拷贝数Χ2P增加不增加正常200(0%)20(100%)20.927<0.05CIN1467(15.2%)39(84.8%)CIN24923(47.0%)26(53.0%)表2 TERC 基因扩增在CIN1 与 CIN2 级组间两两比较组别nTERC基因拷贝数Χ2P增加不增加正常200(0%)20(100%)0.092>0.05CIN1467(15.2%)39(84.8%)CIN1467(15.2%)39(84.8%)11.05<0.05CIN24923(47.0%)26(53.0%)正常200(0%)20(100%)14.08<0.05CIN24923(47.0%)26(53.0%)3. 经公式计算其TERC 基因扩增在鉴别CIN 1级病变与CIN 2级病变中敏感度为46.9%,特异度为84.7%,准确度为65.0%,阳性预测值为 76.6%,阴性预测值为60%。(表3)。表3 TERC 基因扩增在 CIN1 and CIN2 级的特异性宫颈病变CIN2CIN1合计TERC基因拷贝数增加23 (a)7(b)30(a+b)不增加26(c)39(d)65(c+d)合计49(a+c)46(b+d)95(a+b+c+d) 讨 论CIN是子宫颈癌的一组癌前病变,其发生发展是一个连续的过程。目前病理组织学诊断CIN尤其是CIN1级或CIN2级,有时难以做出明确诊断。但绝大多数的CIN1级会转归正常,只有15%的病灶会继续进展,最后甚至演变成浸润癌[5,6]。而CIN2级进展为浸润癌的比率则大大增加,因此,如能早期发现CIN2级和正确鉴别CIN1级与CIN2级,是早期防治子宫颈癌前病变的关键。现代遗传学及分子生物学研究表明,人类大多数肿瘤细胞表现为染色体不稳定性;TERC基因的上调可以维持端粒的长度,使肿瘤细胞能够突破正常的增殖限度,逃避细胞凋亡,从而导致恶性肿瘤的发生[7-9]。 宫颈癌是由CIN发展而来,除了高危型HPV感染和整合因素外[10]可加文献(已经增加),基因的改变亦有重要作用。Kloth?(此文献有误)[11]发现CIN及宫颈癌中,常见3号染色体长臂的扩增,并且异常基因多位于3q26.1-3q28,并把3q的增加部位定位于3q26的TERC基因。2003年,Heselme yer[1]首次采用FISH技术检测子宫颈细胞中TERC基因,发现极少正常及CIN1级细胞中可检测到TERC基因拷贝数增加,阳性率为7.14%,而在CIN2级细胞中TERC基因拷贝数增加阳性率为62.5%,并且在CIN1级与CIN2级间比较,二者有统计学意义。我们前期工作及本次研究在石蜡包埋组织切片上用FISH方法检测TERC基因[2,3],同样发现TERC基因是参与宫颈癌发生、发展的重要基因,其拷贝数增加可能是宫颈癌变的早期分子事件。在正常子宫颈鳞状上皮中TERC基因无拷贝数增加,在CIN1级中仅有少量扩增(14.8%),而CIN2级中扩增明显增多(67%),并且出现三倍体、四倍体及多倍体,二者比较差异具有显著的统计学意义。在鉴别与诊断CIN1级与CIN2级时有明显的临床实用价值。其特异度、阳性预测值及准确度均较高,对于CIN恶性进展具有预测价值。对于CIN1与CIN2级鉴别困难的病例,发现TERC基因扩增的将其诊断为CIN2;而无TERC基因扩增的诊断为CIN1级,找到了基因水平的依据。妇科临床上对CIN2级及以上病变采取锥切等手术治疗,而对CIN1级病变采取定期随访或电烧灼等保守治疗。通过FISH 技术检测TERC基因,对有争议的CIN2级病例进行了更准确地诊断,以确保临床正确、适度地治疗,具有很大的实用意义。综上所述,TERC基因检测能有效的弥补形态学诊断CIN1级及CIN2级病变的不足,尤其是对CIN2级病变的确诊与鉴别,有临床实用意义及应用价值。目前TERC基因检测成本较高,尚达不到在CIN组织学切片上普遍应用的程度,对于明确诊断的病例,不需要做TERC基因的检测,仅一部分诊断有困难的病例,尤其是CIN1级与CIN2级鉴别困难时,为指导临床治疗或预测风险,可检测TERC基因辅助诊断与鉴别。随着FISH检测TERC基因成本的降低,该技术将被广泛普及。参考文献:[1] Heselmeyer-Haddad K, Janz V, Castle PE, et al. Detection of genomic amplification of the human telomerase gene(TERC) in cytologic specimens as a genetic test for the Diagnosis of cervical dysplasia. Am J Pathol,2003,163(4):1405-1416. [2] 袁艳龙,何春年,徐明堂,等.应用荧光原位杂交技术在组织标本中检测宫颈上皮病变的端粒酶RNA基因扩增.中华病理学杂志,2011,40(3):182-186.[3] He C, Xu C, Xu M,etal. Genomic amplification of hTERC in paraffin-embedded tissues of cervical intraepithelial neoplasia and invasive cancer. Int J Gynecol Pathol. 2012 ,31(3):280-5.[4] 中华医学会,临床诊疗指南病理学分册,人民卫生出版社,2009,1[5] AHN Hopman, W Theelen, PPH Hommelberg, et al.Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 are strongly associated events in the progression of uterine cervical dysp lasia to invasive cancer J Pathol, 2006, 210 (4) : 412[6] Shingleton HM, Patrick RL, JohnstonWW, et al.The current status of the Papanicolaou smear 〔J〕CA Cancer J Clin 1995, 45: 305[7] Ju Z,Rudolph KL.Telomeres and telomerase in stem cells duringaging anddisease[J].GenomeOyn,2006(1):84-103.[8] Nowak T,Januszkiewicz D,Zawada M,et al.Amplification of hTERT and hTERC genes in leukemic cells with high expressionand activity of telomerase[J].Oncol Rep.2006,16(2):301-305.[9] Royle NJ,Mrndez-Berm6dez A,Gravani A,et a1.The role of recom—bination in telomere length mainten ce[J].Biochem Soc Trans,2009,37(pt 3):589-595.[10] 徐明堂,何春年,许长田等.宫颈鳞状上皮病变中乳头状瘤病毒16/18存在状态的研究[J].中华病理学杂志,2013,42(6):400-401.[110] He H, Xia HH,Wang JD,et al. nhibition of human telomerase reverse transcriptase by nonsteroidal anti-inflammatory drugs in colon arcinoma.Cancer,2006,106(6):1243-1249.图1 正常子宫颈鳞状上皮:信号清晰,细胞核 DAPI染蓝色, TERC 基因为橘红色信号;CSP3为亮绿色信号. ×2000图2 在CIN1级 TERC 无扩增;仅一个细胞为三倍体. ×2000图3 在 CIN2 级TERC基因扩增明显:可见三倍体,四倍体及多倍体. ×2000图4 在 CIN2 级TERC 扩增的多倍体.×2000图5 在 CIN1/CIN2 级TERC扩增阳性病例的三倍体,三倍体和多倍体.×2000
应用FISH技术在组织标本中检测宫颈上皮病变的TERC基因扩增 袁艳龙 何春年徐明堂 徐翠清 孙玉宁 赵焕芬 陈琛 【摘要】 目的 用FISH技术检测TERC基因在CIN和宫颈鳞癌(SCC)组织中的扩增,探讨其可行性及实际意义。方法 选取手术切除及活检的子宫颈组织标本,有效样本150例,其中正常宫颈鳞状上皮24例,CIN78例(CINⅠ级25例,CINⅡ级21例,CINⅢ级32例),SCC 48例。采用FISH技术在石蜡包埋组织芯片上大样本检测TERC基因的扩增情况。 结果 正常宫颈鳞状上皮中TERC基因无扩增,从CINⅠ到SCC组织中,TERC基因的扩增,依次为8%(2/25)、47.6%(10/21)、71.9%(23/32)、87.5%(42/48),差异有统计学意义 (p<0.05)。组间两两比较:正常宫颈鳞状上皮与CINⅡ级、CINⅢ级及SCC比较,差异有统计学意义(p<0.05);CINⅠ级与CINⅡ级、CINⅢ级及SCC比较,差异有统计学意义(p<0.05) ;CINⅡ级与SCC比较差异有统计学意义(p<0.05)。正常宫颈鳞状上皮与CINⅠ级、CINⅡ级与CINⅢ级、CINⅢ级与SCC两两比较,差异无统计学意义(p>0.05)。在鉴别高度癌前病变(CINⅡ~Ⅲ级)与低度癌前病变(CINⅠ级)中TERC基因扩增的敏感度为62.26%、特异度为92%、准确度为71.79%、阳性预测值为94.29%、阴性预测值为53.49%。结论 在石蜡包埋CIN及SCC组织切片上应用FISH技术进行TERC基因检测,方法可行、结果可靠;作为宫颈细胞学TERC基因检测的替代或延伸,当组织学上鉴别CINⅠ级与CINⅡ级有困难时,检测到TERC基因扩增可辅助CINⅡ级的诊断;而且TERC基因扩增能预测CIN发展为癌的风险增大,具有理论意义及实用价值。【关键词】 子宫颈上皮内瘤变;子宫颈鳞状细胞癌;荧光原位杂交;TERC基因;分子病理;基因扩增;组织芯片Detection of TERC gene amplification by FISH in Cervical Lesions tissue specimenYUAN Yan-long, HE Chun-nian, XU Ming-tang, XU Cui-qing, SUN Yu-ning, ZHAO Huan-fen, CHEN ChenDepartment of Pathology, Hebei General Hospital Shijiazhuang 050051,ChinaCorresponding author: HE Chun-nian(E-mail:hechn2@163.com) 基金项目:河北省科技支撑计划项目(08276101D-101) 作者单位:050051 石家庄,河北省人民医院病理科(袁艳龙、何春年、徐明堂、孙玉宁、赵焕芬、陈琛)妇产科(徐翠清) 通讯作者:何春年(E-mail:hechn2@163.com)(在读硕士生:袁艳龙、孙玉宁)【Abstract】 Object The feasibility and practical significance of the detection of TERC gene amplification by fluorescence in situ hybridization(FISH)On the CIN and cervical squamous cell carcinoma (SCC) tissue microarray. Method Select the 196 cases of cervical tissue samples, by maded tissue microarray samples were obtained effective sample of 150 cases, which 24 cases of normal cervical squamous epithelium, 78 cases of CIN ( CINⅠ25, CINⅡ21, CINⅢ 32), SCC 48 cases. With FISH method detected TERC gene amplification. Result TERC gene have no amplification in the normal cervical squamous epithelium. TERC gene amplification increased by 8%(2/25)、47.6%(10/21)、71.9%(23/32) and 87.5%(42/48) from the CINⅠ-Ⅲ to SCC. There were significant differences among those groups (p<0.05). TERC gene amplification level gradually increased is increased from CIN to cervical cancer. the amplification of TERC gene in SCC, CIN Ⅲ and CINⅡ was significantly higher than normal cervical squamous epithelium and CINⅠ(p<0.05); There was no significant difference between SCC, CIN Ⅲ, and CIN Ⅱ(p>0.05). Sensitivity of the TERC gene amplification was 62.26%, the specificity was 92%, the accuracy was 71.79%,the positive predictive value and negative predictive values were 94.29% and 53.49% in identifying CINⅠand CINⅡ~Ⅲ. Conclusions The method is feasible and reliable results, in application of FISH detection TERC gene amplification on CIN and SCC paraffin section. As detection of TERC gene amplification in the cervix cytology, It is a expansion to detected TERC gene amplification on histologic paraffin section. The having theoretical significance and practical value in TERC gene amplification could be as a differential diagnosis between CINⅠand CINⅡ, as well as estimating the development of CIN a cervical cancer. 【Key words】 CIN; Cervical Squamous Cell Carcinoma; FISH; TERC-gene; Molecular pathology; Gene amplification; Tissue chip子宫颈鳞状细胞癌(cervical squamous cell carcinoma, SCC)多由子宫颈上皮内瘤变( cervical intraepithelial neoplasia, CIN)缓慢发展而来,往往需要10~15年的时间,因此正确的诊断CIN有利于早期发现、早治疗;准确的预测CIN发生癌变的风险,可有效地预防宫颈癌的发生。目前对CIN病变的组织学诊断分级也存在着因人为因素的影响或因病变的不典型而产生的分级不准,尤其CINⅠ级可随访观察,而CINⅡ级以上,需要锥切等手术治疗;分级不准可造成漏诊、漏治,误诊或过治等问题。所以需要寻找更准确、更敏感的方法或指标来辅助组织学诊断和分级。近来有研究表明,3号染色体长臂扩增尤其是TERC基因的扩增在细胞学上鉴别宫颈高度癌前病变与低度癌前病变的敏感性及特异性均在90%以上[1],推断检测TERC基因的扩增有助于SCC的筛查及CIN的诊断。本研究延伸到宫颈组织芯片上,大样本采用FISH技术检测TERC基因扩增,探讨其在CIN和SCC组织中的扩增情况,对诊断分级作用及其临床病理的实用价值。材料与方法1. 一般资料: 选取河北省人民医院病理科2008年8月~2009年7月间手术切除或活检的子宫颈标本196例,中性缓冲福尔马林液固定,石蜡包埋组织;制成组织芯片共得到150例有效样本,进行FISH检测。其中正常对照宫颈鳞状上皮24例,取自因子宫平滑肌瘤或子宫腺肌症而切除的标本,经光镜下证实鳞状上皮无异常者,年龄25岁~54岁,平均年龄42岁;CIN78例(CINⅠ级25例,CINⅡ级21例,CINⅢ级32例),年龄23岁~66岁,平均年龄41岁;SCC 48例,年龄31岁~76岁,平均年龄48.5岁。全部病例均由两位有经验的病理医师对切片进行复核,诊断一致的病例纳入研究样本。2. 组织芯片制备方法:根据课题设计及实验方法要求将196例标本设计制成7×7点阵组织芯片4张。采用18号肾穿针改造制成组织取样器,在供体蜡块上钻取标记的病变组织,然后推出针芯内组织(直径1.8mm),用镊子将组织芯按阵列方式放入受体蜡模中,如此反复地将所有的组织芯有序地排列移入受体蜡模中(做好记录)。然后将受体蜡模置于包埋机加热台上,使组织芯和周围蜡模一起融化、融合,制成组织芯片蜡块。芯片制作过程中,在第一个实验标本外侧加做一个定位组织标本(正常宫壁组织等),在最后一排空缺1个标本,使制成的芯片阵列具有明显的外形,在切片和裱片时确保各实验标本的定位准确[2,3]。 3. 探针及FISH检测方法:3.1探针:hTERC/CSP3 DNA双色荧光探针由北京金菩嘉医疗科技公司提供。hTERC DNA 探针杂交到 3 号染色体长臂(q26.3),荧光信号为橘红色 (Rhodamine);CSP3 DNA杂交到3号染色体着丝粒 (3p11.1~q11.1),荧光信号为亮绿色 (FITC)。3.2石蜡切片预处理:切取4μm厚的切片,置于65℃烤箱烤蜡(过夜);新鲜二甲苯脱蜡10min×2,随后100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、85%乙醇、70%乙醇中各2 min,复水后浸入去离子水中3 min;90℃的蒸馏水处理30分钟;室温下蒸馏水洗片5min×2;置于0.4%胃蛋白酶溶液中,37℃孵育20分钟;室温下2XSSC液洗片5min×2;置于室温的10%中性缓冲福尔马林液中固定5min,于室温下2XSSC液洗片5min×2,依次置于70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各2分钟脱水,室温自然干燥。 3.3 FISH操作步骤(避光环境):探针液 (7μl杂交缓冲液、1μl去离子水和 2μl探针)在(78±1)℃的水浴中变性5min;探针液置于45℃的水浴锅中;组织切片在(78±1)℃在70%甲酰胺液中变性5min后,依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各2分钟,梯度脱水后室温自然干燥;于 56℃烤片机上预热切片片刻后将10μl探针液滴于杂交区域,加盖盖玻片,置42℃湿盒中杂交过夜。次日玻片依次置于预热46℃的50%甲酰胺洗液10min×3、2×SSC溶液10min、0.1%NP-40混合溶液中5min洗涤;室温70%乙醇漂洗3min,避光自然干燥后加15μl DAPI复染液复染,立即盖上盖玻片,10~20分钟后荧光显微镜下观察。4. FISH检测判读方法与标准: 以据FISH技术检测宫颈细胞学TERC基因的方法[1,4,5],参考FISH方法乳腺癌HER2检测指南[5]等文献及探针试剂盒说明,经过多次在组织学标本上FISH预实验,获得成功:在暗室中用OLYMPUS B×51荧光显微镜,DAPI/FIFC/TexasRed三色滤光镜激发,100x物镜下观察间期细胞,判断FISH信号;用VideoTest公司提供的FISH分析软件分析图像,评估整个切片的CSP3和TERC基因双色探针杂交情况。红色、绿色信号互为对照,癌与正常组织互为对照。组织细胞中≥75%的细胞核显示出双色信号,视为杂交成功(图1);否则为杂交失败[6]。杂交成功后进行信号计数。选择细胞核大小一致,胞核边界完整、DAPI染色均一,细胞核无重叠、红绿色信号清晰区,随机计数100个细胞核中的双色信号[5]。按观察到的信号数记录为:正常细胞为二倍体,细胞核中红色或绿色信号各≤2个(图1)。异常扩增细胞或多体为细胞核中红色信号>2个或绿色信号>2个(图2-4),定为TERC基因发生扩增;若众多信号连接成片融合时可不计算个数,直接视为TERC基因扩增(图5);然后计算扩增率。5. 统计学处理:统计学分析采用SPSS16.0统计分析系统,以α=0.05为检验水准,当P<0.05时差异有统计学意义。样本率之间的比较采用卡方检验;多样本率之间两两比较采用卡方分割法。敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值计算公式:敏感度=a/(a+c)×100%,特异度= d/(b+d)×100%,准确度= a+d/(a+b+c+d)×100%,阳性预测值为= a/(a+b)×100%,阴性预测值= d/(c+d)×100%。(a:子宫颈高度癌前病变的扩增数,b:子宫颈低度癌前病变的扩增数,c:子宫颈高度癌前病变的不扩增数,d:子宫颈低度癌前病变的不扩增数。见表2)结 果1.组织芯片制作及实验结果:组织芯片蜡块常规切片,HE染色核实诊断及FISH检测观察样本有效性,因脱片或FISH检测镜下无有意义的组织共46例被剔除,共得到有意义的研究样本150例,其中正常宫颈鳞状上皮24例,CIN78例(CINⅠ级25例,CINⅡ级21例,CINⅢ级32例),SCC48例。直径1.8mm芯片组织完全能满足研究需要。2.FISH检测结果:2.1. 荧光显微镜镜下观察:可见组织轮廓清晰,细胞核被DAPI复染呈蓝色,可见细胞核的面积差异较大;荧光信号随机分布于核染色区内,细胞核边界清楚,TERC基因探针杂交为橘红色荧光信号;CSP3(3号染色体着丝粒)探针杂交为亮绿色荧光信号,荧光信号均清晰。正常子宫颈鳞状上皮为二倍体细胞红、绿均≤2个,未见有异常杂交信号(图1);异常扩增细胞为多红或多绿(>2),多种不同的异常杂交表现(图2-4)。SCC组红色或绿色杂交信号可多达10个以上,部分病例可见明显的多体信号成片融合现象(图5),CIN组杂交信号表现:CINⅠ级组织中很少扩增或多体细胞出现,主要位于中~底层(图6)。CINⅡ级组织中扩增及多体细胞明显增多,出现在中~表层(图7)。CINⅢ级组织中全层均可见扩增及多体细胞,该异常细胞比例显著再加(图8)。即随CIN级别升高,异常杂交信号数量明显增加。2.2. FISH检测TERC基因在子宫颈病变组织中异常扩增率:正常宫颈鳞状上皮组中TERC基因无扩增0.00%(0/24),从CINⅠ级组到SCC组TERC基因的扩增率依次为8%(2/25)、47.6%(10/21)、75%(24/32)、87.5%(42/48),差异有统计学意义(p<0.05)(见表1)。组间两两比较:正常宫颈鳞状上皮组与CINⅡ、CINⅢ级、SCC组,组间比较差异均有统计学意义(p<0.05);CINⅠ级组与CINⅡ级、CINⅢ级、SCC组,组间比较差异均有统计学意义(p<0.05);CINⅡ组与SCC组,组间差异有统计学意义(p<0.05)。正常宫颈鳞状上皮组与CINⅠ级组、CINⅡ级组与CINⅢ级组、CINⅢ级组与SCC组,组间差异均无统计学意义(p>0.05)(表1)。表1 TERC基因在不同程度的子宫颈病变组织中的扩增比率组别nTERC基因扩增Χ2P不扩增扩增正常宫颈2424(100%)0(0%)74.759<0.05CINⅠ2523(92%)2(8%)CINⅡ2111(52.4%)10(47.6%)CINⅢ329(28.1%)23(71.9%)SCC486(12.5%)42(87.5%)3. TERC基因扩增在鉴别高度癌前病变(CINⅡ~Ⅲ级)与低度癌前病变(CINⅠ级)中的敏感度、特异度等:经公式计算其敏感度为62.26%、特异度为92%、准确度为71.79%、阳性预测值为94.29%、阴性预测值为53.49%(表2)。表2 TERC基因扩增在鉴别CINⅠ与CINⅡ~Ⅲ病变中的作用宫颈病变CINⅡ~ⅢCINⅠ合计TERC基因扩增33 (a)2 (b)35 (a+b)不扩增20(c)23(d)43(c+d)合计53 (a+c)25 (b+d)78(a+b+c+d)讨 论近年来用FISH技术检测TERC基因在子宫颈癌普查中的研究和使用情况逐年增加;主要从细胞学上鉴别宫颈高度癌前病变与低度癌前病变非常有帮助[1,4,8]。但在子宫颈病变组织,石蜡包埋切片标本上进行FISH 技术检测TERC基因的异常扩增极少报道[9],未见大样本研究。在FISH技术检测TERC基因结果判读标准上,无论宫颈细胞学,还是组织学方面无公认的标准[10]。FISH检测乳腺癌组织中HER2基因技术已经比较成熟,判读标准国内外统一[6,11]。本研究主要参考子宫颈癌细胞学上FISH技术检测TERC基因文献报道的较成熟技术和判读方法,参考FISH检测乳腺癌HER2基因的判读标准[6];经多次实验操作成功,判读方法可靠。染色体不稳定性(chromosomal instability)是指个体全身细胞染色体易发生自发或诱发断裂的一种遗传现象。人类大多数肿瘤细胞都存在染色体的不稳定性,染色体不稳定性主要与染色体分离、DNA损伤、反应、端粒功能及细胞周期的调控等有关[12]。常表现为基因的缺失、扩增、融合等。宫颈鳞状细胞由CIN向宫颈SCC转变的过程中常见3、6、11、17、18、20号染色体的遗传不稳定性,多为染色体2、3、4、6p、11q缺失,1、3q扩增,其中位于3q26的TERC(端粒酶mRNA)基因是扩增频率最高的区域[13,14]。Olaharski[15]用FISH技术研究 ASCUS、LSIL和 HSIL患者的宫颈涂片,显示3号染色体四倍体和非整倍体(多体)发生频率增加,且随病变进展,非整倍体发生频率增加明显,出现三倍体以上的特殊类型。李静然等[4]观察了27例正常涂片及95例异常涂片细胞(ASCUS 43例,LSIL 21例,HSIL 13例,SCC18例) TERC基因的检测结果。正常组中TERC基因无扩增,在相当 CINⅠ组、CINⅡ~Ⅲ组和 SCC组中TERC基因扩增率分别是16.13%、48.57%和 90%,组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。此外TERC基因的表达水平与CIN的程度关系密切,随组织学病变程度增加,TERC基因的拷贝数增加,其中CIN组患者平均拷贝数为2.8,SCC组平均拷贝数为3.2。与上述研究相似,Andersson等[16]报道,TERC基因在宫颈腺癌的扩增比例范围为 2.3~5.2,平均为3.3,认为检测TERC基因也可作为宫颈腺癌的遗传学诊断手段。Kloth等[14]研究发现,在 CINⅡ~Ⅲ级病变的患者中存在3q及TERC基因的异常扩增。由此可见,常染色体增加或缺失等染色体不稳定现象,特别是3q拷贝数的增加及TERC基因的扩增与SCC的发生、发展有密切的关系。推测位于此区域的TERC基因可能是一种宫颈SCC发生的主要致病基因[17]。本研究在宫颈组织中进行TERC基因扩增检测,结果与上述文献细胞学上基本一致,TERC基因在正常宫颈上皮中无扩增,在各级别CIN与SCC组织中均检出TERC基因扩增,且随着CIN级别升高,其扩增率亦相应增加,差异有统计学意义(p<0.05);尤其在CINⅠ级与Ⅱ级组间差异有统计学意义(p<0.05) ,可辅助CINⅠ级与Ⅱ级的诊断与分级。在组织学上进一步证明3号染色体的异常拷贝及TERC基因的扩增等染色体的不稳定性现象与 CIN的严重程度有关,可能是SCC形成的早期事件。由此可见,TERC基因异常及3号染色体拷贝数异常等染色体不稳定性与SCC的发生关系密切,扩增率高,癌变风险大;在宫颈病变组织中应用TERC和CSP3 DNA双色探针,检测3q染色体的不稳定,可作为CIN癌变风险的有效检测方法。高危型HPV感染是已公认的宫颈SCC发病的首要因素,近年来高危HPV DNA检测敏感度增高,95%以上的CIN都有HPV感染;但HPV阳性患者大部分可自然转阴,仅有一小部分持续感染病例由于病毒DNA整合入细胞DNA组引起宫颈上皮细胞增殖增加才会发展为CIN及宫颈SCC[6,8]。目前,高危HPV DNA检测大多检测的是游离和整合的总的HPV DNA,因此HPV DNA检测对宫颈高度癌前病变的阳性预测值和特异度始终很低,而TERC基因的检测可弥补其不足[5]。在细胞学标本上检测TERC基因扩增受到不少妇科医生和患者的欢迎。Hopman等[9]应用FISH技术检测CINⅡ、Ⅲ级、微浸润癌和浸润性宫颈SCC中的HPV感染状态和TERC基因,发现在HPV整合状态感染的双倍体病变中,80%可见TERC基因的扩增,在CINⅡ、Ⅲ级中,非整倍体和四体型增加,TERC基因随病变加重,拷贝数增加,在TERC基因增加的病例中,HPV整合状态突出,表明HPV整合状态与TERC扩增存在明显正相关性。张艾芃等[18]的研究表明,在CIN中HPV阳性患者TERC基因扩增比例较HPV阴性患者高,进一步证实了HPV整合状态与TERC基因扩增有关。此外本研究结果显示,TERC基因扩增在鉴别CINⅠ级与CINⅡ~Ⅲ级时,有较高的敏感度、特异度、准确度和阳性预测值,与Heselmeyer Haddad等[1,19]的细胞学研究结果一致。作为一种辅助性检测指标,TERC基因的检测成本较高,目前尚达不到在普查中普遍应用的程度,另外有相当一部分ASCUS及LSIL病例,经组织学活检即可明确诊断,不需要做TERC基因的检测。仅有一小部分病例在组织学诊断分级,尤其CINⅠ级与CINⅡ级鉴别困难时,为正确分级、指导治疗或预测风险可进行TERC基因检测辅助诊断。结果证实在石蜡标本上对宫颈病变做TERC基因检测鉴别CINⅠ级与CINⅡ级、预测癌变风险有重要临床及现实意义。除此之外,石蜡标本还有易取得、易保存、易运输,便于异地、异时检测,可重复性高,有利于判读标准的制定与统一等优点,值得推广。综上所述,TERC基因的扩增可作为预测CIN发展到SCC风险的生物遗传学检测指标。在石蜡切片上应用FISH方法对CIN和SCC进行TERC基因的检测,方法可行、结果可靠。其在鉴别组织学上不典型病变或因人为的因素影响CIN级别判断,尤其CINⅠ级和CINⅡ级分级有异议时,可协助分级诊断。因此有效地减少漏诊或误诊,避免临床治疗不足或治疗过度的实际意义,能很好地指导临床早期发现及适当治疗CIN,降低SCC的发生率,具有重要实用价值。本研究在组织芯片上用FISH技术检测TERC基因扩增成功,该芯片直径1.8mm,信息含量足够大,并且通过平行分析,结果更具标准化,减少了实验误差,增强了可比性,使得研究结果更加可信。也大大节约了组织原材料和检测探针成本,极大的节约了研究经费。参 考 文 献[1] Heselmeyer-Haddad K, Janz V, Castle PE, et al. Detection of genomic amplification of the human telomerase gene(TERC) in cytologic specimens as a genetic test for the Diagnosis of cervical dysplasia. Am J Pathol,2003,163(4):1405-1416. [2] Rosen DG, Huang X, Deavers MT, et al. Validation of tissue microarray technology in ovarian carcinoma. Mod Pathol, 2004,17(7): 790-797.[3] 陈士超, 何春年, 张秀智, 等. 自制组织芯片穿刺工具及芯片制作技巧. 中国组织化学与细胞化学杂志,2008,17(1):114-116. [4] 李静然, 魏丽惠, 刘 宁, 等. FISH检测宫颈脱落细胞 hTERC基因的表达及其临床意义. 现代妇产科 进展. 2008, 17(10):725-729.[5] 余 兰, 王树玉, 贾婵维, 等. hTERC基因异常扩增在宫颈病变的临床意义. 中国优生与遗传杂志, 2009,17(4): 28-29. [6] 《 乳腺癌HER2检测指南(2009版)》编写组. 乳腺癌HER2检测指南(2009版). 中华病理学杂志, 2009,38(12):836-840.[7] 赵东晖,卢义生,何建芳,等. FISH与IHC技术检测乳腺癌Her2状态的对比研究. 中华全科医学,2010, 8(1):8-10.[8] 向 阳, 张晓莉, 罗阳, 等. FISH检测宫颈上皮脱落细胞hTERC基因与HPV感染检测对宫颈上皮内瘤 变的预测意义. 中华医院感染学杂志, 2009,19(14): 1838-1841.[9] Hopman AH, Theelen W, Hommelberg PP, et al. Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 are strongly associated events in the progression of uterine cervical dysplasia to invasive cancer. J Pathol ,2006,210(4):412-419.[10] 王淳良, 梅金红, 王珊珊,等. TER2状态与脑膜瘤分级及复发的相关性. 中华病理学杂志,2010,39(3): 156-160.[11] 白燕峰, 任国平, 王波,等. 双探针显色和荧光原位杂交法检测乳腺癌HER2基因状态和17号染色体的 分析. 中华病理学杂志,2010,39(3):161-165.[12] 徐铭. 染色体不稳定性与肿瘤. 医学分子生物学杂志, 2006, 3(6): 430-433.[13] Umayahara K, Numa F, Suehiro Y, et al. Comparative genomic hybridization detects genetic alterations during early stages of cervical cancer progression. Genes Chromosomes Cancer,2002,33(1):98-102.[14] Kloth JN, Oosting J, van Wezel T, et al. Combined arraycomparative genomic hybridization and single-nucleotide polymorphism-loss of heterozygosity analysis reveals complex genetic alterations in cervical cancer. BMC Genomics,2007,8:53. [15] Olaharskil AJ, Sotelo R, Solorza-Luna G, et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis, 2006, 27(2):337-343.[16] Andersson S, Wallin KL, Hellstrm AC, et al. Frequent gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 in cervical adenocarcinomas. Br J Cancer. ,2006,95(3):331–338. [17] Kersemaekers AM, van de Vijver MJ, Kenter GG, et al.Genetic alterations during the progression of squamous cell carcinomas of the uterine cervix. Genes Chromosomes Cancer,1999,26(4):346-354.[18] 张艾芃, 李亚里, 张咏梅, 等. 人乳头瘤病毒感染的宫颈上皮内瘤变中的hTERC基因分析.中国妇产科 临床杂志, 2009,10(2):98-101.[19] Heselmeyer-Haddad K, Sommerfeld K, White NM, et al. Genomic amplification of the human telomerase gene(TERC) in pap smears predicts the development of cervical cancer. Am J Pathol. 2005, 166(4): 1229-1238.附图及注释:图1:正常子宫颈鳞状上皮组织: 结构清晰,胞核被DAPI复染呈蓝色, TERC为橘红色荧光信号;CSP3为亮绿色荧光信号,信号清晰,均分布于核内。红、绿色信号均≤2。×2000倍图2:子宫颈鳞状细胞癌组织:多数细胞核杂交信号>2,信号清晰;以扩增为主。×2000倍图3:子宫颈鳞状细胞癌组织:核中杂交信号表现复杂,红色、绿色信号可多达10余个个;以多体为主。×2000倍图4:子宫颈鳞状细胞癌组织:基底层可见;异常扩增细胞比例在80%以上,以多体为主。×1000倍图5 子宫颈鳞状细胞癌组织:异常扩增,红色信号成片有融合。×2000倍图6:CINⅠ级组织:极少扩增或多体细胞,主要位于中~底层。×2000倍图7 CINⅡ级组织:扩增及多体细胞明显增多。×2000倍图8:CINⅢ组织:全层均可见到扩增及多体细胞,该异常细胞比例显著再加。×2000倍
Genomic Amplification of hTERC in Paraffin-embeddedTissues of Cervical Intraepithelial Neoplasia andInvasive Cancer
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