助孕汤对育龄期妇女子宫内膜容受性的影响丁彩飞 郑若姮 张永华 杨欣 孙中明 杜静浙江省中西医结合医院 杭州( 310003)摘要 目的 研究助孕汤对育龄期妇女子宫内膜容受性的影响。 方法 育龄期妇女90例 (24-36岁),随机分为自然周期组、西药组(克罗米芬+绒毛膜促性腺激素)、中西药结合(西药组+中药组)和中药组(助孕汤)。随访三个月,统计妊娠率、超声观察子宫内膜厚度和类型、逆转录PCR和免疫组化分别检测子宫内膜雌孕激素受体(ER、PR)、整合素β3 mRNA和蛋白水平。结果 与自然周期组相比,妊娠率在中西药结合、中药组有所上升而在西药组有所下降,但无显著性差异。与自然周期组和中西药结合组相比,子宫内膜厚度、ER、PR mRNA和蛋白水平在西药组显著下降而在中药组则显著上升。结论 助孕汤通过调节子宫内膜厚度、增加子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA和蛋白水平来改善妊娠率,并能拮抗克罗米芬降低子宫内膜容受性的副作用。关键词 助孕汤;子宫容受性;雌、孕激素受体;整合素β3Effect of Zhu Yun Tang on the endometrial receptivity of women in periovulatory periodAbstract Objective To investigate the effect of Zhu Yun Tang on the endometrial receptivity of women in periovulatory period. Methods Ninety women (age ranging from 24 to 36 years) in periovulatory period were enrolled during the year 2004-2007 and randomly divided into four groups: normal period group (control), pure western drug group ( clomiphene + human chorionic gonadotrophin), pure traditional Chinese medicine group ( Zhu Yun Tang), combined western and traditional Chinese medicine group. After 3-month follow up, the pregnancy ratio was recorded, the thickness and type of endometrium was measured by ultrasound and the messenger RNA and protein levels of estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR) and integrin beta 3 were determined by reverse PCR and immunohistochemistry methods, respectively. Results Compared with normal period group, the pregnancy rate of patients was increased from combined western and traditional Chinese medicine group and pure traditional Chinese medicine group but decreased from pure western drug group without significant difference. Besides, compared with normal period group and combined western and traditional Chinese medicine group, patients from pure western drug group had significantly decreased thickness of endometrium and messenger RNA and protein levels of ER, PR. However, patients from traditional Chinese medicine group had significantly increased messenger RNA and protein levels of ER, PR and integrin beta 3. Conclusion Zhu Yun Tang could ameliorate women pregnancy rate by increasing the thickness of endometrium and the messenger RNA and protein levels of ER, PR and integrin beta 3 as well as antagonize the impairment of endometrium by clomiphene. Keywords Zhu Yun Tang, endometrial receptivity, estrogen receptor, progesterone receptor, integrin beta 3不孕症的发病率逐年上升,最新统计已占育龄妇女的15%, 成为仅次于心血管疾病和肿瘤的第三大疾病(1)。随着人工助孕技术(IVF-ET)的发展,临床上已经能应用促排卵药物取得较多的卵泡发育和较高的排卵率,但促排卵后的妊娠率较低(20%~30%)仍是未能解决的问题。一方面,这与促排卵后卵细胞的质量密切相关;另一方面,胚泡着床障碍起到主导作用,而子宫内膜容受性差又是后者的主要原因之一(2)。因此,改善子宫内膜容受性,提高着床率是提高人工助孕技术成功率的关键。助孕汤系我院国家级名老中医鲍严钟所创制的有效复方,由当归、黄芪、鹿角片、淫羊藿、巴戟天、葫芦巴、补骨脂、菟丝子、丹参等组成。我们在10年的临床应用中观察发现,助孕汤单独应用或配合克罗米芬可以显著改善卵泡发育,诱导排卵,提高着床率,但机理不明,我们推测可能与促进子宫内膜容受性有关。为探讨助孕汤促进胚泡着床的作用机制,本研究拟通过观察并比较对照组和实验组的子宫内膜厚度、大体形态、雌孕激素受体(ER、PR)和整合素β3表达的变化,进一步研究助孕汤对育龄期妇女子宫内膜容受性的影响,以期为中药的临床疗效寻找分子作用机制。临床资料选择2004年12月~2007年6月因男性不育欲行人工授精而就诊于本院生殖中心的妇女90例,年龄24~36岁,不育年龄1.5~6年,其中原发不育63例,继发不育27例。纳入标准如下:①女性,40岁以下,育龄妇女婚后有正常性生活,未避孕同居一年未能受孕,或曾有妊娠史而又1年未能再孕,经检查诊断为男方不育而行人工授精者;②月经周期正常,基础体温双相;③基础内分泌正常;④近三个月未服用激素治疗;⑤B超检查子宫、卵巢无器质性病变;⑥经输卵管造影证实双侧输卵管通畅;⑦排除免疫性不孕。入选病例随机分为四组:自然周期组30例,西药组20例,中西药结合组20例,中药组20例。组间年龄、身高、体重无显著差异。方法1,治疗方法自然周期组不给任何药物。西药组给予克罗米芬+绒毛膜促性腺激素:月经周期第5天起口服CC100mg,共5天,当优势卵泡直径≥1.8cm时,肌肉注射HCG10000U。中西药结合组给予克罗米芬+绒毛膜促性腺激素+助孕汤:月经周期第5天起西药同上组,加服助孕汤 (由浙江中医学院提供道地药材,最终制成含2g/ ml助孕汤提取液),1次50ml,1天2次口服,至排卵后10天。中药组给予助孕汤:月经周期第5天起,服助孕汤,1次50ml,1天2次口服至排卵后10天。因本实验中取子宫内膜是有创性检查,所以各组均为为一个疗程(即一个月经周期)。2检查方法及观察指标2.1观察子宫内膜厚度、形态自排卵日算起第七天,采用东芝SAL-77A型阴道超声(TVS),探头频率为5.0MHz,距宫底2.0cm测量冠状面子宫内膜厚度(前后壁内膜与子宫肌层交界处强回声内膜厚度)。子宫内膜形态按Gonen标准分为A型:典型三线型或多层子宫内膜,外层和中央为强回声线,外层和宫腔中线之间为低回声区或暗区;B型:均一的中等回声型,宫腔强回声中线断续不清;C型:均质型回声,无宫腔中线回声。2.2逆转录PCR检测子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA水平 自排卵日算起第七天,采用Trizol法提取子宫内膜总mRNA,在核酸分析仪上检测RNA的含量并常规行琼脂糖电泳检测RNA是否降解。按照逆转录试剂盒提供的实验步骤反转录mRNA成cDNA。Trizol RNA抽提试剂、逆转录试剂盒、Taq DNA聚合酶及缓冲液、MLV逆转录酶及缓冲液、dNTPs、OligodT18、RNase抑制剂等均购自大连宝生物工程有限公司。PCR引物使用prier premier 5.0 软件设计后由上海英骏生物技术有限公司合成序列如下(a) ER: 上游:5’- ATGGAGTCTGGTCCTGTGAGG -3’; 下游:5’- GCTGTTCTTCTTAGAGCGT TTGA-3’ (326 bp); (b) PR: 上游: 5’- TTCCAAATGAAAGCCAAGCC-3’; 下游: 5’-AAGTTGATAGAAACGCTGTGA GC-3’ (635 bp); (c); 整合素β3:上游: 5’- GCAAGATCACGGGCAAGTAC-3’; 下游: 5’- AGGACCACCAGGATGTCAGG- 3’ (550 bp)。PCR反应物的量如下:1ul cDNA, 2ul 10 x buffer, 2ul 2 mol/L dNTP, 2ul 10umol/L 正向和反向引物, 1ul 10mmol/L Mgcl2, 0.5ul Taq 酶,补水至总体积20ul,分别进入PCR循环。由于通过软件设计的引物退火温度均在58℃左右,故ER、PR、整合素β3的PCR循环条件均设为:98℃变性10s,58℃退火30s,72℃延伸1min。共进行30个循环,循环结束后72℃以5min终止反应。取PCR产物10ul,加入1ul 10x loading buffer后用1%琼脂糖行DNA电泳,电泳条带结果用VDS图像分析系统分析。以ER、PR、整合素β3的吸光度与β-actin(看家基因,PCR常规引物扩增)吸光度的比值,表示相应物质mRNA的表达水平2.3免疫组化法测子宫内膜ER、PR、整合素β3蛋白水平在排卵后7~8天用Piptte管吸取子宫内膜组织,常规石蜡包埋切片后采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法进行检测。单克隆鼠抗人ER、PR和整合素β3抗体均购自美国Santa Cruz公司。根据试剂附带说明书ER、PR定位于细胞核而整合素β3定位于细胞浆,将SP染色切片置于CHK型号Olympus显微镜400×下观察,选择5个视野,每个视野记数100个细胞,分别读出其中阴性(-)即细胞核内无棕色颗粒;弱阳性(+)即细胞核内有较浅的棕色颗粒;阳性(++)即细胞核内有棕色颗粒清晰;强阳性(+++)即细胞核内有明显棕色颗粒的细胞数。再用组织学积分H-score方法进行半定量分析(三个对标本分类未知的临床医生进行)。计算公式:H-score=∑pi(i+1)。其中Pi代表同一染色强度的阳性细胞数占待测细胞总数的百分比,即Pi=阳性细胞数/待测细胞总数×100%。Ⅰ为染色强度,用1、2、3分别代表(+)、(++)、(+++)。1为纠正系数。3 统计学方法采用SPSS11.0进行统计分析,其中计量资料用“ ±s”表示,多组间比较用方差检验,两组间比较用t检验;记数资料采用卡方检验。p<0.05为统计学上有显著性差异。本研究经过本院医学伦理委员会批准。结果3.1四组患者当月妊娠率和子宫内膜厚度、类型比较与自然周期组比较,西药组患者的妊娠率下降最明显而中西医结合组则升高幅度最大;同时,西药组患者的子宫内膜厚度比自然周期组也有显著性下降(p<0.05),而中药组、中西医结合组与自然周期组无显著性差异,但比西药组有显著性升高(p<0.05)。此外,内膜类型除西药组以C型为主外,其他三组均以A、B型为主(表1)。表1 四组患者妊娠率和子宫内膜厚度、类型比较组别 n 妊娠数 内膜厚度 内膜类型 (%) (cm) A型 B型 C型自然周期组 30 3 (10%) 0.9±0.21 21 8 1西药组 20 1 (5%) 0.7±0.19* 4 7 9中西药结合组 20 4(20%) 0.9±0.17** 6 11 3中药组 20 3(15%) 1.0±0.14^ 15 5 0*, 与自然周期组比较,p<0.05; **, 与西药组比较,p<0.05; ^ , 与西药组比较,p<0.053.2 四组患者子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA水平变化 经1%琼脂糖凝胶电泳分析,ER mRNA、PR mRNA、整合素β3 mRNA、β-actin mRNA的扩增产物和理论长度一致。由表2及图1可知,与自然周期组相比,西药组患者子宫内膜ER、PR mRNA水平显著下降(p<0.05), 而整合素β3 mRNA无明显差异;而中西医结合组与自然周期组比较无显著性差异,但比西药组有显著性升高(p<0.05)。对中药组而言,其ER、PR 及整合素β3 mRNA水平比自然周期组亦有显著性增高(p<0.05,)。 表2,四组患者子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA水平变化组别 n ER/β-actin PR/β-actin 整合素β3/β-actin 自然周期组 30 1.23±0.02 1.33±0.06 1.19±0.04西药组 20 0.92±0.07 * 0.89±0.10* 1.12±0.12中西药结合组 20 1.19±0.11 ** 1.35±0.08 ** 1.21±0.09中药组 20 1.51±0.09^ 1.67±0.12^ 1.53±0.13 ^*, 与自然周期组比较,p<0.05; **, 与西药组比较,p<0.05; ^ , 与自然周期组组比较,p<0.053.3,四组患者子宫内膜ER、PR、整合素β3 蛋白水平变化 ER、PR 及整合素β3阳性效应产物呈棕黄色颗粒,前二者主要分布于腺体细胞核而整合素β3则主要定位于腺体细胞膜和胞浆中(图2)。由H-score方法进行半定量分析可知:与自然周期组相比,西药组患者子宫内膜ER、PR 蛋白水平显著下降(p<0.05), 而整合素β3 蛋白水平无明显差异;而中西医结合组与自然周期组比较无显著性差异,但比西药组有显著性升高(p<0.05)。对中药组而言,其ER、PR 及整合素β3蛋白水平比自然周期组亦有显著性增高(p<0.05, 表3)。表3,四组患者子宫内膜ER、PR、整合素β3蛋白水平变化组别 n ER PR 整合素β3 自然周期组 30 0.89±0.07 0.73±0.04 1.13±0.11西药组 20 0.67±0.03 * 0.59±0.01 * 1.09±0.07中西药结合组 20 0.91±0.02 ** 0.75±0.03 ** 1.15±0.05中药组 20 1.34±0.08 ^ 1.29±0.08 ^ 1.67±0.19 ^*, 与自然周期组比较,p<0.05; **, 与西药组比较,p<0.05; c , 与自然周期组组比较,p<0.05讨论 胚泡着床是其与子宫内膜相互作用的过程,而后者只有在特定的时期(即“种植窗”)内才允许胚泡着床,因而子宫内膜容受性是影响胚胎着床的主要因素之一(3)。子宫内膜是卵巢甾体激素的主要靶器官,也是雌孕激素发挥作用最直接的器官,两者协同调节胚胎着床前子宫内膜的容受状态。而最近的研究还提示,子宫内膜雌孕激素受体及整合素β3的表达也影响了子宫内膜容受性(4)。当前对于排卵障碍性不孕不育,国内外较多采用克罗米芬及性激素治疗,但此类药物在受体水平上阻断了雌激素作用,导致子宫内膜DNA合成受阻,使得内膜发育迟缓,呈现高排卵率、低妊娠率的特点(5, 6)。我们的研究发现,使用西药组患者的妊娠率为5%,比自然周期组10%要低,而使用中西药结合组和中药组的妊娠率分别上升到20%和15%。由于纳入实验的人数有限并且妊娠率的统计是在实验结束后3个月后进行,因而本次实验的妊娠率偏低且组间的差异只是种趋势,在进行卡方检验时无显著性差异。但后续研究发现,与自然周期组相比,西药组患者的子宫内膜厚度显著下降,这与之前的研究克罗米芬等促排卵药物影响子宫内膜厚度从而影响妊娠率相符;而中西药结合组则能显著拮抗促排卵药的这种副作用。此外,子宫内膜类型当呈现典型“三线征”即A型时,其处在最佳的容受状态,而B型、C型的子宫容受性则依次递减。从表1可知,西药组A型子宫内膜占20%,与中药组的75%相比有显著性差异(X2=12.13, p<0.05);而西药组A+B型子宫内膜占55%,与中西药结合组的85%相比亦有显著性降低(X2=4.29, p<0.05)。上述子宫内膜形态学的阳性结果从形态学的角度提示助孕汤能改善子宫内膜容受性,拮抗克罗米芬等促排卵药对子宫内膜造成的损害。 除了上述的形态学指标,我们还深入研究了助孕汤影响子宫内膜容受性的可能分子机理,从mRNA和蛋白水平揭示了子宫内膜ER、PR、整合素β3在其中的作用,现分述如下:雌孕激素的生理效应有赖于ER、PR的介导,因而后者表达失常均将导致着床失败(7);既往对不孕女性子宫内膜ER、PR水平的研究显示内膜异常组ER显著低于正常组,提示ER异常在影响子宫内膜容受性中的作用(8)。我们的结果也证实与自然周期组相比,助孕汤能显著增加ER、PR mRNA和蛋白的表达水平并且拮抗克罗米芬等促排卵药所导致的ER、PR表达下降。整合素β3是一类细胞黏附分子,由α、β两亚单位以非共价键形式连成异二聚体分子构成(9)。它可作为子宫内膜容受性的标志分子,其表达受到激素、细胞因子、胚胎因素等多种信号的调节,并且通过识别配体发挥作用(10)。我们的研究发现与自然周期组比较,西药组患者整合素β3 mRNA和蛋白水平无显著性降低,这与Gonzalez RR等观察到的克罗米芬对不明原因不孕患者种植窗口期的整合素β3表达无影响相一致(11)。但中药组患者整合素β3 mRNA和蛋白水平与自然周期组比较有显著性增高。ER、PR、整合素β3的阳性结果提示助孕汤可能通过作用于这些分子,一方面拮抗克罗米芬等促排卵药导致子宫内膜容受性降低的副作用,另一方面自身就具有提高子宫内膜容受性进而增加妊娠率的作用。但是,受体内实验的限制,我们无法研究助孕汤是直接还是间接作用于上述分子;此外,与其他中药研究所面临的问题一样,助孕汤作为一味复方试剂,我们无法研究上述作用是来自于具体哪味药还是多种药物的加成。这些问题有待于在将来更加严谨的随机对照双盲实验中来解决。 从中医药的角度,助孕汤改善妊娠期妇女子宫内膜容受性也是具有理论依据的。该方剂的主要作用是补肾温阳,养血活血。中医认为肾主生殖,主藏精;肾精之血,冲任直接参与生育的生理活动,补肾养血药调节“肾——天葵——冲任——胞宫”轴。方中淫羊藿、葫芦巴温肾助阳,调节冲任,促进性腺功能,提高卵巢、子宫重量及垂体重量增加;鹿角片温阳暖宫,促使卵泡发育,改善黄体功能;何首乌、当归、熟地补肾养血,可抑制血管内血栓形成;丹参活血,具有使子宫内膜螺旋动脉变粗、变长、增加子宫内膜血流灌注量大,使得内膜增厚,为受精卵着床做好准备(12)。 综上,我们的实验再次证实了克罗米芬能降低子宫内膜厚度、减少ER、PR mRNA和蛋白表达,从而损害妊娠期妇女子宫内膜容受性并影响妊娠。我们首次发现助孕汤能拮抗上述作用,并且单独使用助孕汤能增加妊娠率,这可能与其能改善子宫内膜类型并增加子宫内膜ER、PR、整合素β3 mRNA和蛋白表达相关。由于克罗米芬具有显著的促排卵作用,我们建议在临床上将其与助孕汤合用,以助孕汤能改善子宫内膜容受性之长,补克罗米芬降低子宫内膜容受性之短。我们的研究结果代表了中医从宏观上协调机体内分泌环境与西医助孕技术微观治疗相结合的模式,为中药与人工助孕技术相结合从而提高不孕症治疗成功率提供了实验依据;为中西医结合治疗不孕症提供了新方法。参考文献1,Al-Inany H. 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多囊卵巢综合征患者中非酒精性脂肪性肝病患病情况研究郑若姮 丁彩飞* 浙江省中西医结合医院生殖医学科摘要 目的 胰岛素抵抗是多囊卵巢综合征(PCOS)和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的共同病因,本研究在此理论基础上拟探讨PCOS患者中NAFLD患病情况 方法 开展以非妊娠期PCOS患者(无药物治疗)为研究对象的病例对照研究。NAFLD的诊断根据腹部B超结果并排除酒精过量摄入、病毒性和自身免疫性肝病。同时测定人体测量学指标、血清胰岛素、血糖、血脂、谷丙转氨酶水平(ALT)和胰岛素抵抗评价稳态模型(HOMA-IR)。 结果 60名PCOS患者入选实验组(平均年龄:23.52±7.01;体重指数:29.52±6.88);其中38名患有胰岛素抵抗、25名患有NAFLD,与对照相比具有更高的NAFLD患病率(41.7% vs 20%, p=0.013)和胰岛素抵抗率(63.3% vs 35%, p=0.018)。与只患有PCOS患者相比,同时患有PCOS与NAFLD的妇女体重指数(p=0.002)、腰臀比(p=0.014)、ALT水平(p=0.015)、CRP (p=0.036)、空腹胰岛素(p=0.035)、OGTT实验2小时后胰岛素水平(p=0.043)和HOMA-IR (p=0.023)显著增高。 结论 PCOS患者中NAFLD患病率增高,提示了两种疾病在临床上的相关性与对PCOS患者进行肝脏B超检查的必要性。关键词 多囊卵巢综合征 非酒精性脂肪性肝病 胰岛素抵抗AbstractObjective To explore the prevalence and characteristics of nonalcoholic fatty liver disease (NASLD) in patients with polycystic ovary syndrome (PCOS) on the well acknowledged hypothesis that they may share common pathogenesis as insulin resistance. Methods A case-control study employing non-pregnant patients with PCOS was conducted. The diagnosis of NAFLD was based on abnormal hepatic ultrasound performance with exclusion of alcohol consumption, viral or autoimmune liver diseases. Anthropometric variables, serum biomarkers (serum glucose, insulin, lipids and aminotransferase (ALT)) and homeostasis model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) were further determined. Results Sixty PCOS patients (mean age 23.52±7.01, mean BMI 29.52±6.88) were enrolled. Among them, 38 PCOS patients had insulin resistance while 25 had NAFLD, which presented higher prevalence of NAFLD(41.7% vs 20%, p=0.013)and insulin resistance (63.3% vs 35%, p=0.018)when compared with controls. Moreover, patients with coexisting PCOS and NAFLD had statistically significant higher body max index (p=0.002), waist-hip ratio (p=0.014), ALT (p=0.015), C-reaction protein (p=0.036), fasting insulin (p=0.035), insulin after 2 hour OGTT test (p=0.043) and HOMA-IR (p=0.023) levels than those only had PCOS. Conclusion The increased prevalence of NAFLD in PCOS patients showed a relevant clinical association between these two conditions and the necessity of hepatic ultrasound screening for PCOS patients for potential NAFLD.Key words Polycystic ovary syndrome, Nonalcoholic fatty liver disease, Insulin resistanceAuthors: Ruo-heng Zheng, Cai-fei Ding Reproduction department: Zhejiang Combination of TCM with Western medicine HospitalCorrespondence to: Dr Cai-fei Ding; Email:dingcf008@sina.com 多囊卵巢综合征(PCOS)是以慢性排卵障碍、月经过少或闭经、多毛等为主要表现的临床综合症(1)。PCOS是妇女中最常见的内分泌疾病,在育龄期妇女中的发病率达10%(2;3)。 现有研究证实大约50%PCOS患者具有胰岛素抵抗并符合代谢综合征的诊断标准(4)。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种以脂肪在肝脏的沉积伴或不伴炎症及纤维化为主要特征的临床常见综合症(5),而胰岛素抵抗也是其重要的致病因素之一(6)。因此有可能PCOS患者同时患有NAFLD,因而引出新的临床问题:是否有必要对PCOS患者进行肝脏检查?如有必要,何时采用何种方法进行?目前对这方面的研究较少(7;8),我们通过病例对照研究来探讨在我科就诊的PCOS患者中NAFLD的发病情况与特征,以期为临床决策提供线索。资料与方法一、研究对象于2005年6月至2007年6月在杭州市红十字会医院生殖医学科首诊的非妊娠期PCOS患者入选PCOS组(60名);同时选取60名年龄和体重指数(BMI)匹配的非PCOS、非妊娠期妇女作为对照组。PCOS的诊断根据最新的鹿特丹标准,主要以月经不规则与雄激素过高为基础(9)。此外,研究对象如有以下任一种情况也被排除:使用治疗PCOS的药物,酒精摄入量> 20g/天,有慢性病毒性肝炎、血色素沉着病、自身免疫性肝病、其他慢性肝病病史,或者使用肝毒性药物。本实验经过医院临床伦理委员会的批准并得到所有实验对象签署的知情同意书。二、方法 PCOS组和对照组实验对象的社会经济状况、民族、既往医疗史(高血压、糖尿病等)、饮酒史、体格检查结果等情况都以问卷的形式记录。人体测量学指标包括身高、体重、BMI、腰臀比,同时常规测定空腹血糖、胰岛素水平、口服葡萄糖耐量试验(OGTT)及2小时后葡萄糖与胰岛素水平、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-Chol)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-Chol)、甘油三酯、血清谷丙转氨酶(ALT)水平(>25IU/L视为异常)、C反应蛋白水平(实验对象在CRP>10mg/L时视为有急性炎症,予以排除)、乙型肝炎表面抗原、抗丙型肝炎抗体。胰岛素抵抗评价稳态模型(HOMA-IR)根据如下公式计算:胰岛素(μU/mL) * 空腹血糖(mmol/L)/22.5(10),在本实验中其值>2.6可诊断为胰岛素抵抗(11)。 NAFLD诊断主要根据①常规腹部B超显示:肝实质显示“光亮肝”或同质粗回声、后方回声衰减、肝内血管管腔结构不清等(12) ;②排除酒精过量摄入、病毒性和自身免疫性肝病等。肥胖定义为BMI>30kg/m2(13), 高血压定义为BP>140/90mmHg,而糖尿病的诊断根据美国糖尿病学会的最新标准(14)。代谢综合症的诊断需满足下述异常中至少三项:腰围增大(男≥102cm,女≥88cm)、高甘油三酯(≥105mg/dl)、HDL低(男<40mg/dl、女<50mg/dl)、血压高于130/85mmHg、空腹血糖高于110mg/dL(15)。三、统计学分析 连续变量使用X±S,独立样本间的比较采用t检验;二分类变量采用百分比表示,独立样本间比较采用X2检验。统计分析在SPSS11.0上进行,P<0.05为差异有统计学意义。结果一般情况:PCOS组与对照组在年龄、BMI、腰臀比、血压、胆固醇、甘油三酯方面无显著性差异。而ALT水平在PCOS患者中显著高于对照组(28.52±15.37 vs 14.92±13.24,p=0.023),提示此时可能已存在肝脏损害;PCOS患者中空腹胰岛素和HOMA-IR水平显著高于对照组(19.35±12.38 vs 11.05±7.53, p=0.035; 0.47±0.29 vs 0.31±0.21, p=0.019),提示PCOS患者存在更加严重的胰岛素抵抗。表1、 PCOS患者与对照组的基本临床和生化指标组别 年龄 BMI(kg/m2) 腰臀比 收缩压(mmHg) 舒张压(mmHg)PCOS组 23.52±7.01 29.52±6.88 0.85±0.07 115.41±15.23 72±10.05 对照组 26.87±6.53 29.22±5.37 0.84±0.07 115.07±15.37 71.9±12.88 P值 0.061 0.45 0.51 0.79 0.85组别 ALT(IU/L) CRP(mg/L)对数值 总胆固醇(mg/dL) 低密度胆固醇(mg/dL)PCOS组 28.52±15.37 0.21±0.39 180.25±43.6 48.32±9.56 对照组 14.92±13.24 0.19±0.42 183.41±41.69 49.85±12.23 P值 0.023 0.29 0.55 0.23 组别 高密度胆固醇(mg/dL) 甘油三酯(mg/dL) 空腹血糖(mg/dL) PCOS组 48.32±9.56 123.36±85.98 86.7±11.59 对照组 49.85±12.23 124.87±72.23 83.4±9.63P值 0.77 0.91 0.18组别 空腹胰岛素(mg/dL) HOMA-IR对数值 PCOS组 19.35±12.38 0.47±0.29 对照组 11.05±7.53 0.31±0.21P值 0.035 0.019所有的数据都以平均数±标准差来表示;连续变量采用组间t检验;HOMA-IR(评价胰岛素抵抗的稳态模型);ALT(谷丙转氨酶);CRP(C反应蛋白)相关疾病发病情况:PCOS患者和对照伴发肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、代谢综合症和NAFLD等疾病的情况详见表2。胰岛素抵抗、NAFLD和ALT异常比率在PCOS患者中显著增高,其中胰岛素抵抗在PCOS患者中为63.3%,与对照组35%比较,差异具有显著性(p=0.018)。NAFLD患病率在PCOS患者中为41.7%,约为其在对照组中的两倍(p=0013);60名PCOS患者中有24名为ALT异常,与对照组中仅有2名ALT比较,差异具有显著性(p=0.002)。表2 、PCOS患者与对照组相关疾病及实验室指标比较 组别肥胖(BMI>30) 高血压 糖尿病 ALT异常(>25IU/L)例数 百分率 例数 百分率 例数 百分率 例数 百分率PCOS组35 58.3% 10 16.7% 5 8.3% 24 40%对照组33 55 % 8 13.3% 1 1.7% 1 2 3.3%P值0.712 0.458 0.109 0.002 组别胰岛素抵抗(HOMA-IR>2.6) 代谢综合症 非酒精性脂肪性肝病 例数 百分率 例数 百分率 例数 百分率PCOS组38 63.3% 9 15%25 41.7%对照组21 35% 10 16.7% 12 20% P值 0.018 0.629 0.043 所有的数据都以实际数值(百分数)来表示;二分类变量组间比较采用采用X2检验;HOMA-IR(评价胰岛素抵抗的稳态模型);ALT(谷丙转氨酶);PCOS组(n=60),对照组(n=60)。PCOS患者伴或不伴NAFLD的亚组分析:对PCOS患者的临床、人体测量学、生化指标按照伴或不伴NAFLD进行亚组分析(表3)。PCOS患者同时患有NAFLD,与不伴有NAFLD的PCOS患者相比,表现为显著增高的BMI(p=0.002)、腰臀比(p=0.014)、ALT水平(p=0.015)、CRP (p=0.036)、空腹胰岛素(p=0.035)、OGTT实验2小时后胰岛素水平(p=0.043)和HOMA-IR对数值(p=0.023)。此外,56%同时伴有NAFLD的PCOS患者与30%不伴NAFLD的PCOS患者表现为ALT水平增高。表3 、 PCOS患者伴或不伴NAFLD的临床、人体测量学、生化指标的比较组别 年龄 BMI(kg/m2) 腰臀比 收缩压(mmHg) 舒张压(mmHg)不伴NAFLD 23.41±7.05 27.52±6.68 0.84±0.08 112.41±13.23 72.23±11.05 伴NAFLD 24.87±6.53 35.22±6.37 0.89±0.07 115.07±13.37 71.8±11.88P值 0.071 0.002 0.014 0.061 0.35 组别 ALT(IU/L) CRP(mg/L)对数值 总胆固醇(mg/dL) 低密度胆固醇(mg/dL) 不伴NAFLD 19.52±12.37 0.12±0.49 170.25±33.06 99.5±29.14 伴NAFLD 34.92±23.24 0.31±0.42 193.41±51.69 115.56±42.09 P值 0.015 0.036 0.25 0.36组别 高密度胆固醇(mg/dL) 甘油三酯(mg/dL) 空腹血糖(mg/dL) HOMA-IR对数值不伴NAFLD 49.32±11.56 98.36±47.98 83.7±13.59 0.46±0.27 伴NAFLD 45.85±10.23 164.87±122.23 88.4±8.63 0.71±0.31P值 0.47 0.09 0.43 0.023 组别 空腹胰岛素(mg/dL) 餐后2小时血糖 (mIU/L) 餐后2小时胰岛素(mIU/L)不伴NAFLD 13.35±7.38 110.3±30.17 99.45±45.25 伴NAFLD 27.05±17.53 131.6±31.74 161.25±45.23P值 0.035 0.062 0.043所有的数据都以平均数±标准差来表示;连续变量采用组间t检验;HOMA-IR(评价胰岛素抵抗的稳态模型);ALT(谷丙转氨酶);CRP(C反应蛋白)讨论 胰岛素抵抗是NAFLD(16)和PCOS(17)的共同病因,这为本实验探索PCOS患者中NAFLD的患病率提供了理论基础。本实验发现41.7%的PCOS患者具有NAFLD的B超表现,同时这批患者中约半数表现为ALT水平增高,提示患非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的可能性。然而进一步证实NASH需要肝脏活检标本的病理学检查,可在后续的实验中开展。本实验提示临床医生在接诊PCOS患者时,需考虑到同时患有NAFLD的可能性,而NAFLD在单纯性脂肪肝阶段是可逆的,积极干预可预防其进一步进展为NASH甚至肝纤维化。 迄今关于PCOS与NAFLD共存情况的研究不多。Setji(7)等最早在一份回顾性研究中报道15%PCOS患者具有ALT水平增高,同时在6名患者的肝脏活检标本中发现NASH伴不同程度的纤维化。进一步研究发现PCOS伴NASH患者具有HDL降低,甘油三酯、空腹血糖和ALT增高的表现,提示PCOS患者有可能存在严重的肝脏疾病。而Gambarin-Gelwan等(14)的最新研究发现,55%PCOS患者具有NAFLD,这与我们的41.7%相接近,远远高于NAFLD在正常人群中3%-24%的患病率(18)。同时Cristian Cerda等(8)的队列研究揭示PCOS患者NAFLD的患病率为41.5%。考虑到其患者来源于智利人群,而本实验患者来源于中国人群,因而人种的差别并不是造成NAFLD患病率偏高的原因,胰岛素抵抗作为二者发病的共同病因,可能在其中起到重要作用。 与Gamgarin-Gelwan和Cristian Cerda的结果相似,本研究发现PCOS患者中并发NAFLD与增高的BMI和HOMA-IR相关,提示肥胖和胰岛素抵抗对其发病起到重要作用,这也与之前报道的雄激素和胰岛素抵抗在PCOS发病中有协同作用相符(19)。此外,伴NAFLD的PCOS患者出现ALT水平增高(56%),其中有部分可能为非酒精性脂肪性肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis, NASH),但确诊需要肝脏活检。考虑到目前对NAFLD患者肝脏活检的时机选择还存在争议,并且个体差异影响较大(20),本实验并没有开展肝脏活检。在前述Setji et al(7)的研究中,6名年轻的PCOS患者肝脏活检示NASH伴不同程度的纤维化,提示严重的胰岛素抵抗和肥胖可能导致NASH在PCOS患者中的发生。但是,仍有必要进一步探讨肝脏活检对PCOS患者伴NASH的诊断价值。从循证医学的角度,病例对照研究可信度不如队列研究与随机对照临床试验,再加上本研究对象数目相对不足,因而需要前瞻性的队列研究来进一步明确NAFLD在PCOS患者中的发病率。当然,我们也采取了必要的措施来控制偏倚,如所有PCOS和NAFLD的诊断都由同一组医生做出,以增加同质性;以及正在接受其他药物治疗(如避孕药、二甲双胍或其他胰岛素增敏剂)的患者不被考虑进入本研究等等。考虑到NAFLD具有潜在的进展为NASH甚至肝纤维化的可能,同时早期的干预(生活方式改变、适当锻炼和减轻体重)能改善NAFLD(21),因此患PCOS的妇女有必要进行肝脏B超检查。此外,部分患者还可进行药物治疗(22),而对同时患有PCOS和NAFLD患者是否应进行肝活检的评价、非侵入性诊疗手段的开发以及治疗药物的验证等,都是今后进一步研究的方向。 参考文献 (1) Welt CK, Gudmundsson JA, Arason G. 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原因不明不孕症患者子宫内膜容受性研究进展浙江省中西医结合医院(310003) 丁彩飞 郑若姮综述 鲍严钟审校progress on endometrial receptivity of patients with idiopathic infertility Ding Caifei, Zheng Ruoheng,, Bao YanzhongZhejiang Combination of TCM with Western medicine Hospital摘 要 近年来随着不孕患者的日渐增多,出现了一部分原因不明的不孕症。在对这部分患者深入研究后发现,胚胎着床过程中,子宫内膜一些细胞表面结构也随着着床的进行发生一系列的变化,同时与白血病抑制因子(LIF),胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)及其I型与Ⅱ型受体(IGFⅡ-ⅠR 、IGFⅡ-ⅡR)的mRNA水平,基质金属蛋白酶9(MMP-9)、整合素α ν β3 ,Lewisy寡糖抗原的表达,以及血清中微量元素(TE)水平都有相关性,这些为进一步研究不明原因的不孕症提供了依据。关键词 子宫内膜容受性 不孕症 吞饮泡 白血病抑制因子 微量元素胚胎着床是处于活化状态的胚胎泡与处于接受态的子宫相互作用,胚胎滋养层与子宫内膜建立紧密联系的过程。着床窗口的出现和消失依赖于子宫内膜中一套特定基因时空特异性表达,使胚泡和内膜间建立分子对话。近年来发现,在胚胎着床过程中,子宫内膜一些细胞表面结构也随着着床的进行发生一系列的变化,同时与许多因子,如近年来发现的白血病抑制因子(LIF),胰岛素样生长因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)及其I型与Ⅱ型受体(IGFⅡ-ⅠR 、IGFⅡ-ⅡR)的mRNA水平,基质金属蛋白酶9(MMP-9)、整合素α ν β3 ,Lewisy寡糖抗原的表达,以及血清中微量元素(TE)均有一定相关性,这些为进一步研究不明原因的不孕症提供了依据,本文对近几年相关方面的研究做一综述如下。胚胎着床过程中子宫内膜细胞表面吞饮泡及细胞连接的变化一、吞饮泡子宫内膜上皮细胞的质膜顶端部分的突起被作为准备着床和细胞活动活跃等特点的标记,由于具有胞饮功能,从而被命名为“吞饮泡”。吞饮泡的出现代表子宫具有接受胚泡着床的状态。吞饮泡的发育依靠孕酮,又被雌激素抑制,在孕酮的单独作用下,吞饮泡出现的频率很高,可能也表示吞饮泡的出现仅代表子宫即将具有接受性而不是已经进入接受状态。在人子宫内膜中曾观察到吞饮泡的形成在排卵后第5天,第8天吞饮泡几乎消失,而人的着床窗口开放是在排卵后的5~7 d[1]。二、桥粒桥粒是细胞通过中间纤维锚定到细胞骨架上的粘着连接方式,是一种多分子,直径约0.5 μm。有研究证据表明,桥粒在着床过程中有表达下降的趋势,在人体中,着床前的子宫腔上皮细胞膜上桥粒的比例明显下降,桥粒表达的下降使细胞粘附力下降,胚泡细胞易于侵入上皮细胞间,从而促进胚泡着床。三、紧密连接子宫腔上皮细胞顶端侧面紧密连接分布的调节具有种属特异性。紧密连接对子宫内膜上皮结构完整性的维持起到一定的作用,而分布的改变伴随有桥粒表达的下调,也许会产生一种稳定的更有弹性的上皮,并使侵入的胚泡细胞更容易穿过这一上皮。四、间隙连接是动物细胞间最普遍的细胞连接,由6个间隙连接蛋白(lx)亚单位组成的跨膜结构,发挥相邻细胞间物质运输的作用,在人的接受性子宫内膜中,缺少间隙连接的表达,这对人胚胎的顺利着床有利,并且也可能是子宫内膜接受性的一种标志。LIF在不孕患者黄体中期子宫内膜中的表达LIF是六十年代发现的一种多功能细胞因子,近年来研究发现LIF在胚胎发育及胚泡着床过程中起着关键作用[2-3]。LIF表达在人月经周期19~24 d达高峰,而在人类胚胎着床和发育中的作用尚不清楚,并且有大量研究资料表明,围着床期子宫内膜表达LIF是判断内膜是否对胚泡有接受性或胚泡能否着床的重要标志之一[4-5]。有研究通过分析不明原因不孕妇女及行体外受精-胚胎移植(IVF-EF)时多次胚胎着床失败的妇女子宫内膜LIF分泌情况,结果发现,有生育妇女子宫内膜分泌期分泌LIF产量远高于增生期,而不孕妇女LIF产量在分泌期中无升高性变化,在多次胚胎着床失败的妇女中,分泌期LIF呈下降趋势[6]。LIF调节胚胎着床的可能机理:在胚泡着床前及着床过程中,胚泡和子宫内膜均处于生长发育动态阶段,胚泡和子宫内膜彼此相容,发生一系列形态、生理、生化等变化,胚泡着床的关键在于子宫内膜和胚胎发育的同步性。子宫内膜仅在极短时期内允许胚胎着床,即着床窗口期。此期内,子宫内膜受雌孕激素共同作用,同时上皮细胞分泌某些物质,如粘附分子,LIF等,激活胚泡着床。已知人月经周期19~24 d LIF表达达峰值。LIF增加早孕期滋养叶细胞人绒毛膜促性腺激素(HCG)分泌,而HCG具有促进滋养层细胞生长分化及维持胎盘的功效。许多实验证明,蛋白水解酶与其抑制因子的协同作用是滋养细胞侵入子宫内膜的关键,而LIF对鼠胚泡的金属蛋白酶,尿激酶型纤溶酶原激活因子mRNA水平的表达有调节作用。IGF II及其受体mRNA的表达与不明原因不孕症的相关性人类子宫内膜存在完整的IGF系统,在局部以自分泌和旁分泌的方式发挥重要的调节作用,与子宫内膜的增殖、分化、代谢及胚胎种植等密切相关[7-8]。IGF-II主要在黄体期子宫内膜中表达,提示其可能在胚胎中起重要作用,并在间质细胞蜕膜化过程中起作用,其调节机制尚不清楚,可能与性激素、细胞因子、生长因子及同源框基因等有关[9]。有研究发现,激素治疗子宫内膜不规则出血时,可上调子宫内膜中IGF-II ,IGF结合蛋白-I mRNA的表达,下调孕酮受体,IGF-I,而IGF-IR,雌二醇(E2)受体mRNA表达无明显变化,推测激素治疗中孕酮通过调节IGF-II,胰岛素样生长因子结合蛋白-I (GFBP-I),介导子宫内膜分化而对内膜起保护作用[10]。研究结果提示,原因不明不孕患者黄体中期IGF-II及受体基因表达降低,可能与性激素尤其孕酮不足有关。受体表达下降,将进一步抑制IGF-II生物学功能的发挥,影响黄体中期子宫内膜间质的蜕膜化。IGF II及其受体mRNA的表达对胚泡植入的影响。近期研究发现,IGF II及其受体mRNA不仅在分泌期子宫内膜表达,而且在滋养层固定的绒毛柱上呈梯度形式高表达,侵入的最前端浓度最高,提示其在滋养层侵入中发挥重要作用,同时IGF-II调节两者抑制绒毛侵入的作用[11]。由此推测,原因不明不孕患者子宫内膜IGF-II及其受体基因表达下降,进而使蛋白分泌减少,影响子宫内膜腔上皮与间质细胞相互作用及IGF-II生物学信息的传递,抑制上皮细胞DNA合成及有丝分裂,影响子宫内膜间质蜕膜化而与不孕有关。子宫内膜种植窗口期整合素α v β3与MMP-9的表达及其相关研究近年来发现子宫内膜局部调节失衡,导致子宫内膜容受性下降,可能是不明原因不孕的病因之一[12]。已有实验依据表明,整合素αvβ3与MMP-9可确定为子宫内膜容受性标志物[13-14]。有研究发现MMP-9在子宫内膜种植窗口期表达特异性升高,推测其与子宫内膜容受性有关,认为MMP-9的强阳性表达有助于加强蛋白水解酶活性,完成细胞外基质(ECM)的转化,促进子宫内膜的分化和蜕膜化改善子宫内膜容受性,使子宫内膜更适合胚胎植入[15]。以往研究认为,甾体激素和细胞因子是胚胎植入的调节因素。ECM和整合素αvβ3可能构成一种更为精细的植入调节机制,整合素α v β3与MMP-9以功能活性形式共同存在于细胞表面。胚泡上的整合素受体与子宫内膜的ECM结合,ECM与整合素αvβ3相互作用及时启动胚泡中MMP-9的合成与表达,使得局部ECM水解顺利进行,从而保证了胚泡的正常侵入。因此子宫内膜种植窗口期局部MMP-9及整合素αvβ3表达减少,子宫内膜功能成熟滞后,子宫内膜容受性下降,种植窗口期内膜发育异常是不明原因不孕的病因之一。人子宫内膜Lewisy寡糖抗原的表达和调控近年来研究发现在哺乳动物胚泡着床期间,其子宫内膜上皮细胞及胚泡表面均有丰富的岩藻糖化抗原表达,其中以岩藻糖化乳糖系列寡糖(Lex,Ley,H1)为主[16]。Ley寡糖抗原在动物生殖周期不同阶段具有特异性表达以及受雌激素和孕激素调控的特点。如小鼠着床期间子宫内膜有特异性的Ley糖蛋白出现,并受雌激素上调。关于人子宫内膜,可观察到在增生期和分泌期Ley糖蛋白的表达有所不同,有研究应用免疫组化及免疫印迹法观察人子宫内膜不同功能时期Ley寡糖蛋白量的变化,以及雌、孕激素对Ley寡糖蛋白的调控。胚泡着床并非是一个简单的“进入”过程,研究表明小鼠胚泡与子宫上皮之间的粘附起始时并非膜与膜之间的直接接触,其大约有0.3~0.7 μm的缝隙,提示细胞表面分子参与了细胞最初的识别和粘附过程。研究发现如细胞粘附分子,细胞因子,生长因子及血管形成因子等多种因素可影响胚泡的着床。在人子宫内膜的研究中发现,不明原因的不孕症患者,其内膜的Ley寡糖抗原表达减少,本文所示Ley寡糖在分泌期高表达,且受孕激素的调控,也提示Ley与人胚泡着床可能密切相关,而对人胚泡表面的Ley寡糖抗原的表达,Ley寡糖抗原与其他各种影响胚泡着床因素间的关系,以及是否存在着床窗有明显变化,都有待进一步的研究。子宫内膜容受性与血清中TE的关系TE是人体生长发育,维持正常生理功能必不可少的元素,与生殖关系极为密切。目前TE与生殖生理、病理之间的关系的研究已成为生育不育研究的新课题,有研究通过对不孕妇女黄体期子宫内膜及血清中锌(Zn),铜(Cu),铁(Fe),锰(Mn)水平的测定,探讨原因不明不孕的可能机制[17]。子宫内膜酶作为生物催化剂与孕卵植入及植入后内膜的生长发育关系密切,而TE参与内膜酶的构成与激活[18]。因此研究子宫内膜的TE,在生育和不育中尤显必要,有研究发现,正常妇女黄体期子宫内膜Zn高于卵泡期,而血清中正相反。有研究发现[19]黄体期Zn优先从血浆蛋白中游离出来而被子宫内膜摄取,从而调节内膜E2及孕酮受体的结合。还有研究发现[20],除卵泡期子宫内膜Fe与血清Fe呈正相关与甾体激素调节贮存Fe在子宫内膜重新分布有关外,黄体期子宫内膜Zn、Cu、Fe与血清中的含量并无相关性,不孕妇女子宫内膜Cu与血清Cu呈正相关,内膜Mn与血清Mn呈负相关,且子宫内膜Zn、Fe低于正常妇女,而血清Zn、Fe则高于正常妇女,表明TE在体内各组织中的形成和分布不均一性,提示体内TE异常分布和代谢紊乱,可能是原因不明性不孕因素之一。并且显示自排卵后7~8d即黄体中期,对照组子宫内膜平均厚度明显高于不孕组,且正常组子宫内膜Zn与内膜厚度呈正相关,提示阴道预测子宫内膜厚度可作为超声评估卵巢功能的有力参数。资料表明,在子宫内膜中生殖激素与其受体的相互作用依赖于Zn,其机制可能是:① 内膜中甾体激素的受体为含Zn蛋白质,Zn参与其中形成“锌指”的环状结构,影响子宫内膜激素受体的浓度和效应 ② 子宫内膜核酶和蛋白质合成过程中的关键酶是含Zn金属酶制约着子宫内膜的容受性 ③ 子宫内膜Zn通过协同,置换或拮抗作用于干扰其他TE的代谢和生物学作用。由此推测,不孕妇女子宫内膜Cu、Mn增高可能是继发于Zn浓度减低,低Zn与原因不明性不孕有关。综上所述,近几年研究发现子宫内膜容受性的变化与细胞表面吞饮泡及细胞连接、LIF、IGF-II及其受体mRNA的表达、整合素αvβ3与MMP-9的表达、Lewisy寡糖抗原的表达和调控、血清中TE等密切相关,这为进一步研究和治疗不明原因的不孕症提供了有力的依据。参 考 文 献[1] Usadi RS, Murray MJ, Bagnell RC, et al. 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