移植技术

血液肿瘤的治疗已进入个体化精准治疗时代。然而，如何对肿瘤细胞或克隆进行精准的监测、何时采取预防或早期的干预措施，仍是待解决的问题。而这一问题的关键，在于寻找简便、可靠的可作为微小残留病（MRD）检测的标志物与检测手段。微小残留病（minimal residual disease，MRD）是指按目前的疗效标准经过治疗取得完全缓解(CR) 后体内残存微量肿瘤细胞的状态。血液肿瘤细胞的残留量实际上取决于检测的灵敏度，检测的灵敏度越高，MRD检测水平会更深。传统细胞形态学的检测灵敏度是可以检测5%的肿瘤细胞，在这之下，可能需要一些更灵敏的方法，比如流式检测的灵敏度达到10-3-4，分子的检测灵敏度更高一些。从分子检测来讲，MRD可以检测多种指标，包括特定的融合基因、基因变异、T/B细胞受体基因克隆性重排序列等。比如，对于淋系肿瘤，通过检测T或B细胞受体基因克隆性重排序列可以检测MRD，使其成为MRD的理想标记。因此识别远低于形态学基础5％阈值残留病的能力， 是完善我们对各种治疗反应及风险分类和预后评估的重要工具。接下来分别向大家讲述一下MRD检测的不同技术之间的差异，以及MRD分子检测指标的相关内容。关于微小残留病监测的不同技术细胞遗传学监测的灵敏度在5%到10%，显然不太适合做MRD监测。流式细胞的监测，也是最常规的、最经典的MRD监测，监测速度比较快，灵敏度可以达到10-3-4。欧洲白血病联盟建议，白血病MRD的监测灵敏度必须要达到0.1% 以下（1000个细胞中有1个突变细胞时必须保证被检出）。最新的队列研究数据建议MRD监测的灵敏度若达到10-4，可进一步帮助评估预后和调整治疗，减少复发。数字PCR检测技术，NGS深度测序，液体活检等这些分子检测技术灵敏度高，特异性好，满足了对灵敏度的要求。下表展示了各监测技术的优势与劣势：通过上表可以看出，不同的监测平台对MRD监测各有优劣势，总的来讲，流式比较快，但是灵敏度中等以上，另外它不足的地方是需要专业性非常高、有经验的专家来进行结果判读，如果有表面抗原变异或其他抗原变异往往会造成一些结果的误判，产生假阳性与假阴性。对于分子检测来讲，检测的灵敏度非常高，但是它的费用成本也是比较高的。另外，如果用二代测序的话，还需要比较好的生物信息分析技术进行配合。那么，MRD分子检测到底要监测哪些分子指标呢？以下将重点从分子监测方面进行阐述。关于血液恶性肿瘤MRD监测的分子指标从分子监测来讲，可以从以下几这些中做些选择。01融合基因 作为淋巴和髓系肿瘤MRD监测的分子指标。融合基因是作为MRD监测是比较好的一类分子监测指标。比如AML中的RUNX1-RUNXT1、CBFB-MYH11和PML-RARA是比较好的微小残留监测指标。02特异性基因变异 作为淋巴和髓系肿瘤MRD监测的分子指标。1)可作为MRD监测指标的单个基因变异有些肿瘤比较特异的、或者病人比较特异的一些基因变异，可以作为MRD监测的分子指标。像欧洲白血病MRD工作组把FLT3、NPM1作为AML的MRD分子监测指标，现在临床上也已经基本在用。那么像FLT3在髓系肿瘤当中非常常见，大概占到20%到30%，之前没有二代测序的时候，它的监测的方法是基于一代测序及其他PCR的方法，监测灵敏度达不到要求，现在可以利用二代测序满足监测灵敏度的要求，目前我们实验室也开发出了这一监测项目。目前FLT3监测的灵敏度可达10-5，也就是十万分之一的水平。研究显示在完全缓解的情况下，对患者血液进行FLT3的监测，MRD＞10-4和MRD＜10-4的患者总体存活率（OS）具有非常大的差异。所以即便是完全缓解的一个ML的病人，如果FLT3的监测有MRD存在，那么预后是不一样的。2)不可作为MRD监测指标的单个基因变异在这里，要特别注意DNMT3A， ET2 ，ASXL1这三个基因被认为是一个克隆性造血相关的基因，这些基因在正常的缓解期也是一直持续地存在，被认为和残留没有很好的关联关系，如果有这三个基因的存在，并不完全影响预后。因此这三个基因并不是MRD一个比较好的指标，这一点要注意，但是最近也有争论，认为监测里面的复杂因素比较多，所以可能并不是简简单单的这三个基因完全起不到MRD评估预后的主要作用，应该要综合考虑。3)单个基因变异会丢失或新的变异出现，应多基因变异结合作为监测指标有一些基因变异，FLT3-ITD、FLT3-TKD、NRAS、KRAS、IDH1、IDH2、MLL-PTD、EVI1在治疗当中由于克隆演变可能会丢失掉，或者复发时出现新的突变，所以最好多个基因结合起来作为监测指标，这样能够确保监测的特异性和敏感性。4)传统指标的监测意义需要提升认知一些传统的监测指标像WT1，虽然一些实验室还在进行这项监测，但欧洲白血病联盟认为这个指标特异性还是比较差的，所以现在一般不建议作为MRD的监测指标，除非没有其它更好的指标来做监测，否则这个监测是不主张再用的，WT1在没有其他好的MRD监测方案时可作为一个参考。5)体细胞来源的与血液肿瘤发生相关的遗传易感基因的变异另外一类的监测指标，如我们已知的与AML发生相关的血液肿瘤遗传易感的基因RUNX1,GATA2,CEBPA,DDX41, ANKRD26的变异，若是来自肿瘤细胞突变，通过DNA测序排除胚系来源，这些基因的体细胞突变可被用作MRD分子标记，是一个比较好监测指标，可以用来做MRD监测。6)个体特异性基因变异图谱可作为个性化监测指标每个个体的肿瘤都可能会有自己的一个变异图谱，如果患者有特定的基因变异，那么这些基因变异可以被用来作为MRD分子监测指标。最主要就是说基于基因的一个筛选的结果，来选出这些比较好的、特定的、个性化的这些基因监测。03淋系肿瘤可监测B/ T细胞抗原受体基因的克隆性重排对淋系的白血病或者肿瘤、淋巴瘤来讲，T或B细胞克隆性重排监测，即在NGS检测之前用一代测序片断分析的方法区别它是T还是B，是克隆性增生还是一个克隆性的反应性的增生，进而来帮助肿瘤诊断。每一个淋巴肿瘤细胞克隆应该有它唯一的一个重排序列，应该可以这么认为这个序列就相当于它的一个身份证，看到这样一个身份证的基因的重排的编码，就可识别是肿瘤细胞，所以现在可以通过二代测序进行克隆性重排检测来实现MRD监测。去年，欧洲EuroClonality-NGS多实验室联盟发表了一系列的研究结果，对于这个方法的技术性能，方法的可靠性，质量控制，包括标准，做了大量的研究工作，认为是一项非常好的监测方法，我们实验室目前也建起来了这套监测方法。结束语分子检测技术的发展和应用，极大地提高了MRD检测的敏感性和特异性。事实上，分子学MRD的检测早已应用于临床，例如利用qPCR等手段检测BCR-ABL1、RUNX1-RUNX1T1等融合基因水平，具有更高的灵敏度和特异性，是更为准确地反映MRD的状态。随着对血液肿瘤遗传学发病机制的认识不断深入，越来越多的血液肿瘤发病相关基因突变被明确，而数字PCR、二代测序等高通量、高精度检测手段的普及，上述基因突变作为常规MRD监测指标也具备了临床可行性，越来越多的研究提示分子学MRD的适用性已大大提高，且随着检测组套的完善，有进一步优化的潜力。除了准确性和适用性，便利性也是肿瘤MRD检测追求的重要目标。ctDNA检测作为一种相对无创的检测手段， 或许更适用于淋巴组织肿瘤的MRD监测。

造血干细胞移植（HSCT）就是通过放疗、化疗先清除患者体内的肿瘤细胞及免疫细胞，再把供者的造血干细胞输注患者体内，重建患者正常造血和免疫系统的一个过程。HSCT可以治疗很多的血液系统疾病，包括恶性血液病，如白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和骨髓增生异常综合征，以及一些非恶性血液病，如重型再生障碍性贫血、噬血细胞综合症、地中海贫血等。HSCT分为自体移植和异体移植两大类。异体移植按照有没有血缘关系，分为有血缘（即亲缘供者）的移植和非血缘（即来自骨髓库的非血缘供者）的移植。按照移植物的种类，可分为骨髓移植、外周血干细胞移植以及脐带血移植。一. HSCT供者如何选择？随着HSCT技术的发展，现国内外多数研究认为HLA相合同胞移植、非血缘移植、单倍型移植预后相当。但是同胞相合HSCT后并发症少及移植相关死亡率低，故目前仍普遍认同首选HLA相合同胞供者。如果没有同胞相合供者，再考虑其他供者。选择HLA完全相合非血缘供者还是单倍型供者尚存争议，多数学者认为应先选HLA完全相合的非血缘供者。非血缘供者HLA位点不合对移植结果有影响，主要位点不合对移植结果影响较大。二.单倍型移植供者如何选择？除了HLA 10个点的高分辨配型以外，还要检测受者（患者）是否存在针对备选供者的HLA特异性抗体（DSA），如果DSA强阳性，有替代的供者则选择替代供者；如果没有替代供者，而且患者有很强HSCT指征的，可以给受者在预处理前及过程中一定的处理，如应用美罗华、丙种球蛋白、血浆置换等，让大部分患者也可以成功地植入。目前血型不合已经不是HSCT的障碍，但是血型不合可能在移植后经过一段时间才能完成血型转换，会增加血制品的应用，所以在其它方面都相当的情况下，我们优先选择和患者血型相合的供者。三. 哪些人不适合做HSCT供者？主要有以下四大类人群：1、有明显的造血、免疫功能异常的，如类风湿性关节炎、免疫球蛋白低、NK细胞功能异常等。2、存在活动性感染（乙肝除外）。3、重要脏器功能受损或衰竭。4、患有严重的疾病，如恶性肿瘤等。四. 总结供者是HSCT成功的重要因素之一，因此选择合适的供者非常重要。对于供者的年龄和性别，并不是绝对的年轻男性就一定是最好的供者。有报道挽救性移植时，半相合供者比同胞全合供者复发率低，所以对于高肿瘤负荷患者的挽救性移植选择半相合供者可能更合适。所以目前，我们对于备选供者，要从多参数综合考虑来选择，如肿瘤、血液病家族史及检测患者及供者的血液与免疫性疾病的遗传易感基因等情况，同时结合造血和免疫功能，综合考虑选择最优的供者，这样有利于提高HSCT的成功率，并且减少移植后的并发症。

日前，吴彤主任带领造血干细胞移植医护团队李智慧医生、赵永强医生、胡正红护士长，开展线上视频直播，在线回答患者及家属关心的相关问题。我们整理了答疑中精华，汇总如下。 个性化问题解答01患者男，8岁2019-10-14诊断急性髓系白血病M1， 计划造血干细胞移植，配型姐姐是6个点，请问成功率高吗？赵永强医生：首先HLA(人类白血病抗原）配型结果要明确是低分辨还是高分辩，做了几个位点的配型，兄妹之间的配型需要做高分辨以进一步明确是同胞半相合还是同胞全相合。关于移植成功率的问题，在有经验的单位，同胞全相合移植和半相合移植成功的几率是相当的。02患者女，30岁，2019-11-01确诊急性髓系白血病，已完成造血干细胞移植，请问移植后如何避免复发，如何避免激素引起的股骨头坏死？赵永强医生：关于移植后复发的预防，需要密切地监测微小残留病（MRD），如果出现了MRD，需要采取一些治疗，比如供者淋巴细胞输注（DLI）或者是干扰素的治疗以增强抗白血病作用。此外，在没有明显的移植物抗宿主病（GVHD）的情况下，尽早减停免疫抑制剂。有靶向药物的可以应用靶向药物预防复发。糖皮质激素是造血干细胞治疗过程中经常要用到的一个药，比如用于GVHD的一线治疗。并非用了激素以后，就一定会引起股骨头坏死，是否会引起股骨头坏死，跟个人体质对药物的敏感性也有关，对于激素的应用不要过度紧张。怎样避免激素引起的股骨头坏死？在治疗允许的情况下尽量减少激素的用量，或选择可替代的药物。另外，患者平常要注意补钙，适当地活动，适当地晒太阳，用一些促进钙沉积的药物，会起到一定的预防效果。03患者女，31岁，2017-09-30诊断为PH＋急性淋巴细胞白血病，移植后一百多天了血小板不涨，做骨穿骨髓易凝固，这段时间谷草，和乳酸脱氢酶，谷氨酰转肽酶都高，尤其是乳酸脱氢酶一千多，钠也一直低每天三袋浓钠都补不上，C反应蛋白二十多，不发烧，请问该怎么处理？赵永强医生：移植后血小板不长可能有多种因素引起，比如移植物功能不良，感染，药物或是GVHD。因此，首先要明确是什么因素引起血小板不长，根据病因采取不同的治疗方式。需要做骨穿，明确骨髓增生情况以及嵌合率。其次需要做病毒检查，或其他相关的一些感染的排查，明确是否有感染的因素，同时也要排除药物的影响。血小板持续低下，乳酸脱氢酶和转氨酶高，需要进一步查尿常规、肌酐，血压等指标明确有没有血栓性微血管病（TMA）的可能性。04患者男 ，2岁半 ，2019-07-31诊断再生障碍性贫血，对移植不了解，想要了解一下移植相关问题。赵永强医生：现在国际指南，40岁以下的重症再障首选移植。重型的或极重型的再障患儿，有造血干细胞移植的指征，如果有合适供者需尽早移植。目前我们中心再障的移植，成功率很高，基本上可以达到90%左右，同胞全合移植成功率会更高。儿童再障还需要鉴别是先天和还是获得性的，因为移植方案会有所不同。05患者男，28岁，2018-11-02诊断为急性淋巴细绝白血病B高危，移植后复发，CART2月25日回输，请问再移什么时期最佳？赵永强医生：B急淋移植后复发，CART治疗达到缓解的患者也不是都需要二次移植。根据我们的数据，这类患者CART治疗后有58%的患者无病生存。CART治疗后需要监测体内的CART细胞数量、B细胞数量及MRD水平，如果MRD不能转阴或阴性后又转阳，CART细胞很快消失，B细胞很快恢复，存在高危的染色体及基因，供者免疫功能有缺陷则需要考虑二次移植。如果需要二次移植，要在细胞因子释放综合征（CRS）消失，没有严重的感染及GVHD时进行。移植后CART是供者细胞来源的，通常在体内存在时间会比非移植患者的自体细胞CART要长。06患者男，11岁， 2019-10-07确诊急性B淋巴细胞白血病复发，孩子2013年10月四岁多时候首次确诊急淋B标危，于当地医院儿科按标危方案化疗，七月出院维持两年半。2017年5月髓外复发(睾丸)入住另一家医院化疗至当年12月出院，又于2019年国庆再次骨髓复发又入院按2017复发方案打化疗，一疗未打完已缓解，11月到上海准备做CAR-T时查微小残留查不出做不了CAR-T又返回昆明接着打化疗。请问这种情况下孩子是否必须移植？赵永强医生：患者化疗治疗结束以后先后发生了髓外复发和血液学的复发，多次复发，具备移植指征，需要做造血干细胞移植，因为一旦复发化疗治愈率低。07患者男，12岁，2018-06-15 诊断为急性淋巴细胞白血病高危，移植前做了7个腰穿，移植后做了9个腰穿，请问还须不须要补腰穿？赵永强医生：在我们中心，移植以后如果没有中枢神经系统白血病腰穿要做4-6次预防中枢神经系统白血病的发生。患者移植后做了九次腰穿，如果没有中枢系统白血病，可以不用再进行腰穿鞘注了。08患者男，13岁，2016-02-06诊断为急性淋巴细胞白血病B型高危 ，无移植，化疗期间很正常，维持将近结束，现在伊马替尼还在吃，其他药都已停，目前看孩子各方面都很好，身体也很棒，请问像这种情况复发率有多高，停药以后需要注意哪些方面，定期都做什么检查，或者还需要移植吗？赵永强医生：患者没有说清是否是Ph+急淋，提到服用伊马替尼，信息不完整。如果是Ph阳性急淋，可以化疗加TKI类药物，持续到维持结束考虑停药。儿童Ph+急淋应用化疗联合TKI的治疗，治愈率约60%-70%，复发率20%~30%。停药以后，要监测血象，进行基因定量的检测，如果BCR-ABL基因定量不能持续为0或伴有其它高危因素或疾病复发了则需要进行造血干细胞移植。09患者女，42岁，2018-10-08诊断急性淋巴细胞白血病B高危，做了二次移植，请问如何更好地防止复发？赵永强医生：移植后复发的预防需要密切监测MRD，如果没有GVHD，尽早地减停免疫抑制剂。此外也可以通过基因检测后，选择靶向药做维持治疗预防复发。10患者，男，20岁，2016-10-21诊断为急性淋巴细胞白血病，化疗其间肺部真菌感染，后在医院做移植，移植后3个月复发，复发后在另一医院做CART治疗，年前回家过春节感冒咳嗽，导致肺部感染，因疫情不能去北京，现在在当地医院治疗，用的药是口服伏立康唑早4晚4，阿奇霉素早1晚1，如何尽快缓解？赵永强医生：患者提问如何尽快缓解？是肺部感染的缓解还是疾病的缓解问题不太明确。如果考虑肺部问题，建议做痰培养明确病原以便指导用药。不要长期服用阿奇霉素，此外，口服一段时间伏立康唑后可以去做肺CT，评估肺部情况。11患者女，66岁，2019-07-05诊断MDS IPSS中危，IPSSR高危，类风湿关节炎，心脏二尖瓣返流，支气管扩张，高血压，请问目前的身体状况是否可以移植（全相合），单倍体抗体高，已被拒绝。赵永强医生：这位属于老年患者，是否可以做移植需要更详细的检查结果，评估脏器功能能否耐受移植，进行Karnofsky、CCI、HCT-CI评分等，综合判断。尽量不选择DSA（供者特异性抗体）强阳性的供者，有植入失败的风险。如果没有其他供者选择，需要做相应的处理，以保障供者细胞的顺利植入。12患者男，年龄40岁， 2019-09-25诊断急性淋巴细胞白血病，打了一个化疗完全缓解了，去检查的就是肺部真菌感染了，现在已经三个多月没有打化疗了。下一步如何操作？赵永强医生：患者年龄大于35岁属于高危急淋，目前需要尽快控制肺部感染，监测原发病的情况，在允许的情况下给小剂量的化疗，以维持缓解状态，待肺部感染控制后进行造血干细胞移植。13患者女，54岁 2019-12-05诊断Ph费阳，请问这个年纪用不用移植？赵永强医生：随着移植技术的发展，减低强度预处理方案的应用，现在异基因移植的年龄可以做到70岁。主要看患者的身体状况，该患者年龄不是问题，是否要做移植，要看疾病是不是需要做移植，有没有合适的供者。患者54岁的女性，Ph费阳，不知道是慢性髓系白血病还是急淋，需要更多的资料以便给出更合适的建议。14患者男，4岁，母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤（BPCDN）。2020-01-31 确诊。移植前供者的选择方向及风险？移植后对孩子的远期生活有哪些影响？赵永强医生：首先，移植供者的选择涉及到很多的方面，如果患者有合适同胞相合的供者，选择同胞相合的供者。如果没有的话，可以找非血缘或者单倍体供者。再者，关于移植的风险，会有移植相关的并发症风险，常见的有：感染风险、GVHD、复发风险以及其他并发症。移植后对患者远期生活的影响，一般来说，大部分人移植以后，长期生活质量不错，很多人达到了正常人生活的状态。移植以后很多人可以去上学，工作、组建家庭。部分患者如果存在一些合并症，比如慢性GVHD，可能将来对生活质量会有所影响，影响的轻重跟疾病的轻重相关。再一个，清髓移植对孩子的生育可能有一定的影响，移植对于生育的影响取决于预处理方案的选择。现在生殖医学发展非常迅速，使更多的患者能够通过辅助生殖技术实现成为爸爸妈妈的愿望。15患者男，24岁，T淋巴母细胞白血液病，2018-07-08确诊。请问，化疗后在哪个节段做移植最好，移植后要注意哪些安全?赵永强医生：T淋母是一种恶性白血病，属于高危。如果打化疗获得了缓解，应该在强化治疗后，尽早去做移植。移植后要注意很多事项，包括饮食、生活各方面。详细事宜可以咨询移植科的医生。16患者女，11岁，髓系M2，2017-07-29确诊。移植十一个月了老是发烧，如何处理？赵永强医生：信息量比较少，发热的原因很多，需要更多的信息以便确定方向，查找原因，而后选择合适的治疗。除了发热表现，血象、骨髓的情况，服药情况都不知道，所以可能要找到发热的原因，才能更好地去处理，要做相关的检查。建议就诊。17患者女，26岁，急性淋巴细胞白血病B-ALL，2017-08-25确诊。半相合移禃过后多长时间最容易复发？应注意什么？有哪些排异为正常排异？移禃后多长时间排异才正常？怎样提前预防？多长时间为移禃后的危险期？过了多少年才是"长期无病生存率″？赵永强医生：患者主要想问复发相关的一些问题。首先，关于排异，专业术语叫移植物抗宿主病（GVHD）。GVHD是对正常组织的攻击而表现出来的一些疾病状态。没有正常排异这一说法。移植后多久出现排异才正常？同样没有这一说法，这个说法是不正确的。从预处理开始就给予预防GVHD的药物。关于移植后复发的危险期，取决于患者移植前的状态，移植前是复发状态还是缓解状态，如果移植前是不缓解状态，患者早期可能容易复发，好发于半年或者一年内，移植后时间越久复发风险越低。通常移植后5年不复发被认为治愈，所以判断移植的疗效常用长期无病生存率（≥5年的无病生存率）。