习惯性流产男性相关因素研究进展

中山大学附属第一医院泌尿外科 黄燕平综述邓春华审校

摘要：习惯性流产是生殖医学中一种复杂的疾病，其复杂的病因及治疗困难成为影响生育的难题。大部分临床医生对习惯性流产的研究都集中在女性，而考虑男性相关因素的较少。然而，作为提供给胚胎半数基因的男性，其影响因素是不可忽略的。最近的文献表明，习惯性流产男性因素包括：基因因素、精液因素、以及其他因素如年龄。习惯性流产是夫妇因素的一个结果，男性因素对先天性异常、流产、胚胎及胎盘异常产生重要作用。目前的各项研究数据仍是初步的，在不久的将来，随着进一步的调查和研究，男性将成为习惯性流产筛查常规评估的一部分，而且伴随着临床、基础诊断技术的发展，在病因及治疗方面将取得巨大进展。

关键词：习惯性流产 因素 男性 染色体

习惯性流产（Habitual abortion ,HA），亦称复发性流产（Recurrent pregnancy loss，RPL）或复发性自然流产（Repeated spontaneous abortion ，RSA)），是指连续发生三次或三次以上的自然流产。复发性流产过去指自然流产连续发生2 次或2 次以上者，近来国内外不少学者将复发性流产与习惯性流产等同，即凡自然流产连续3次或3次以上者均可称习惯性流产或复发性流产，其发生率大约为（0.5－1.0）％^[1]。习惯性流产病因复杂，治愈困难，实际亦可归纳为一种不育症。

针对习惯性流产的研究，目前还主要集中在女性方面，可分为：遗传因素，如胚胎染色体异常，母体染色体异常及基因突变等；解剖学因素，包括子宫畸形，Asherman综合征（由宫腔创伤、感染或胎盘残留等引起的宫腔粘连和纤维化等影响胚胎种植）和子宫肿瘤等其他因素；内分泌因素，如黄体功能不全，多囊卵巢综合征，高催乳素血症，糖尿病及甲状腺功能异常等；生殖道感染因素，如细菌，支原体，衣原体，病毒，弓形虫等；自身免疫因素，如抗磷脂抗体综合征（抗磷脂抗体），系统性红斑狼疮（抗核抗体），干燥综合征（抗可抽提的核抗原抗体）；其他因素，精神心理及特发性等。然而，即便做了详尽的病因筛查，仍有超过50%的病例原因未明^[2,3]。大量对女性相关因素的研究表明，基因异常是流产最常见的原因，估计占流产原因的50%，习惯性流产夫妇中基因异常大约占1-4%，而正常人群中仅有0.7%^[4]。基因异常主要表现在染色体核型异常，其可通过染色体的缺失或增加产物来辨别。染色体缺失、替代、重复、易位或点突变，是导致大部分流产的常见原因。

习惯性流产可能存在男性的因素，因为男性配子基因内容占胚胎的一半。目前研究男性因素影响也主要集中在男性染色体核型的异常。基因异常导致的流产可能是两种染色体异常引起的结果：一是结构的异常，来源夫妇双方（易位、倒位等）；二是数量上的异常（额外或丢失染色体）。早期研究证实，父母任何一方核型异常都将导致不育或增加流产风险。本文主要分析习惯性流产中男性各种因素的影响作用。

一、核型异常

核型异常中染色体异常有两种异常类型：正常染色体数目（23对46条染色体）异常结构；染色体总数异常（额外、或丢失染色体；例如45，X或47，XXY）

1.结构异常：

染色体结构异常是染色体发生断裂的结果，可能是正常数量染色体有不同的排列，也可以是某个染色体的一部分附着在其他染色体上，因此尽管细胞内的遗传物质无改变，也不引起明显的遗传效应，但表达位置的不恰当，可导致个体产生不平衡的配子，而这个配子是构成个体生殖细胞染色体核型的一半。如果染色体重排导致了配子不平衡易位，这些配子与正常的配子结合后即可导致流产、死胎、智力低下和发生畸形的遗传效应。平衡易位的个体难以通过临床或检查发现得出诊断，只有通过染色体核型检测才能发现。夫妇双方，一方或双方携带平衡易位，也是高风险流产的原因，染色体平衡易位携带者,因其自身遗传物质无丢失，故表型、智力正常,但其生殖细胞在减数分裂时会产生18 种配子,其中只有1/18正常、1/ 18 为平衡易位携带者、其余均为不平衡的配子，可对远期怀孕造成影响。平衡易位由相互易位（Reciprocal translocation）、罗伯逊易位（Robertsonian translocation）或倒位（Inversions）组成，它们与怀孕率低和流产率增加相关。估计人群中罗伯逊易位的发生率约为0.1％^[5]，夫妇携带者习惯性流产的比率高达约8％^[6]。易位通常发生在原始胚胎或由父母中一方的遗传，如果是遗传获得，携带易位的父母通常是正常的。易位的男性可持有一个正常、平衡或不平衡染色体补充的配子，就可产生正常，平衡或不平衡的后代。如果父母一方携带有21q21q易位或等臂染色体，那再发21三体的风险为100％，约50-80％21三体胎儿发生流产^[7]。根据遗传学理论，父母一方是罗伯逊易位携带者产生后代是唐氏综合症（Down’s sydrome）的概率为三分之一，而实际情况是母亲是携带者子代发生唐氏综合症的概率仅为10-15％，而父亲是携带者子代发生的概率为2-3％^[8]，两者发生率不同的原因仍不清楚。最近，日本的一项对1284对习惯性流产夫妇的研究^[6]表明，高流产率与男性携带异常核型相关。其研究显示，带有相互易位的男性造成流产的概率达61.1％，而带有罗伯逊易位的男性也有36.4％导致流产，倒位引起流产的概率为28-42.9％。鉴于其研究样本相对较小（n＝34），所以这些数据的可靠性仍是个疑问。

2.数目异常：

当胎儿发生染色体数目异常时，常导致流产。数目畸变是染色体为非整倍体（Aneuploidy），指染色体数目多于或少于46条，通常由于染色体不分离（Nondisjunction）或染色体后期延迟（Avnaphase）。在能存活的子代中通常有额外染色体，而这些个体都具有明显的异常，临床上可以通过病史和体格检查检测出来，最常见的就是唐氏综合症（Down\"s syndrome ，21-三体，发生率为1/600），及克氏综合征（Kleinfelter\"s syndrome，47，XXY；发生率：1/2000），这些男性大部分都有明显的生育低下或不育以及导致50％或以上的高流产率^[7]

二、精子因素：

1.精子染色体：

精子染色体非整倍体产生通常是由精子发生过程中减数分裂不分离，导致二体性或缺对性的配子产生。习惯性流产的男性精子染色体水平影响的研究仍未探索。由于人群中个体配子的正常增殖动力学的原因，减数分裂的异常可以出现于种系中整个减数分裂不分离过程，因此，正常血细胞核型并不能排除精子染色体异常，外周白细胞检测正常的健康男性中，有小部分的个体可检测到精子非整倍体。随着分子生物学技术的改进，如荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH），使检测精子染色体的异常变为可行。

1）数量异常

精子染色体数量异常是指精子染色体中存在的非整倍体，目前通常检测精子细胞中的X、Y、12、13、15、18及21等染色体。Rubio等人^[9]研究了12份精液样本，这些样本来自有过2次或2次以上早期流产经历的男性，他们正在接受试管婴儿（in-vitro fertilization，IVF），其中5个是利用妻子自己的卵子，7个应用捐献者的卵子。他们分析了浓缩精子的细胞核的二倍体及13、18、21、X和Y染色体的二体性，采用双色和三色荧光原位杂交（Two-color and three-color fluorescent in-situ hybridization），最后发现性染色体的二倍性明显升高（P<0.0001），而且与对照组相比，发生习惯性流产的概率要大15％。研究中发现，习惯性流产的发生只受性染色体影响，常染色体二倍性及二倍体发生频次与普通控制人群并无统计学意义。此外，流产夫妇应用捐献者卵子与父亲结合的精子同样可注意到明显的性染色体二倍性及二倍体。与此同时，这就表明尽管女性年龄影响，父系因素也起影响作用，因为大部分卵子捐献者都是年轻的。Carrell等^[10]报道，与正常人群或对照生育组相比，不明原因流产的男性有更高的平均精子非整倍体率（P<0.005）。另外，他们还发现非整倍体精子的比例与凋亡精子（TUNEL法）比例呈正相关（P<0.001）。另据其研究表明不育男性精液中出现精子凋亡增加和精子形态异常，与IVF的效果呈负相关。

2）结构异常

精子染色体结构异常仅占精子染色体异常的3％－5％^[11，12]，染色质异常可能发生在三个发展阶段：配子的发生、受精、胚胎的发生。高精子染色质结构测定值可预测39％的流产^[13]。和对照组相比，已知由二倍体频率增加导致减数分裂异常引起疾病的病人中，精子细胞内注射周期中，自发流产的概率增加（33.3％：7.1％）^[14]。Syme和Martin^[15]通过观察平衡易位致流产的夫妇，发现精子内非平衡易位发生的频率约为3.4％，而正常和平衡互补染色体发生的频率相同^[15]。此外，配子形成停滞可能发生在罗伯逊易位携带者，这可能导致不育。Somprasit等^[16]应用胚胎植入前遗传学诊断（Preimplantation genetic diagnosis,PGD）和荧光原位杂交（FISH）的技术，研究了一对经历三次自然流产和两次IVF失败的夫妇,其外周血细胞核型均为正常。在对两次失败IVF的PGD诊断中，利用21号染色体具体位点探针检测，发现13个胚胎（卵裂球）中的4个（30.8％）有唐氏综合征（Down syndrome）关键区域的重复序列，随后，用FISH检测到1002个精子细胞核中有66个（6.6％）有同样的重复序列，而这些重复序列被证明为父系性腺嵌合体（Paternal gonadal mosaicism，PGM）。

2.基因突变：

基因突变可发生在任何基因。突变可能是一个单一的点突变导致的氨基酸改变，或者是缺失、替换、插入。目前研究与流产相关的共同基因突变主要有以下几种：

1）HLA-G 多态性：

Aldrich等人^[17]认为HLA-G（一种最初表达在母胎界面上胎儿组织内的非经典人类白细胞抗原）基因型的多态性和不明原因的习惯性流产相关。HLA－G表达被认为在早孕期建立和维持胎儿胎盘单位中发挥重要作用，其可能通过自然杀伤细胞产生作用。Aldrich和他的同事发现，HLA-G*0104或HLA－G0105N 在夫妇任何一方携带都与习惯性流产相关，并且在流产5次以上的夫妇中高于流产2次或3次的夫妇（分别为37％和26％）。作者还指出，这两个等位基因受在HLA－G 异构体上a2区域的多态性限定，并且这些多态性导致习惯性流产，流产率高达三分之一。也有人对此提出异议，因此这仍是个争议。

2）嗜血栓性突变（Thrombophilic mutations）

Jivraj 等^[18]提出基因嗜血栓突变是习惯性流产的潜在原因。在习惯性流产的白人夫妇中，任何一方携带超过一个嗜血栓突变的等位基因，与未携带该基因的夫妇相比，其以后未治疗妊娠的流产相对危险性为1.9（95％置信区间为1.3—2.8）^[18]。此外，该研究指出，男性携带超过一个嗜血栓突变（87.5％，7/8的个体）流产率比女性携带超过一个嗜血栓突变（75％，3/4的个体）流产率要高，但是，由于该研究样本量小，其结论有待进一步探讨。

3）Y染色体的微缺失

在不育研究中，通过分析精液而发现的严重少精或无精男性，是具有高风险的Y染色体微缺失。在这些人群中，Y染色体微缺失的发生率估计为8--18％^[19、20]。鉴于上述研究及这些突变可能导致高流产率，我们期待不明原因习惯性流产夫妇的男方来施行检测以确定发生Y染色体微缺失。与对照组相比，我们发现习惯性流产人群中Y染色体微缺失发生率（约82％）要高^[21]。进一步的研究是必要的。

3.精液质量

男性配偶有严重的精液异常时很难受孕，并且可能有遗传异常的风险。一些研究人员试图表明精液分析中精子质量与习惯性流产的关联。三项为证明精液参数与习惯性流产间相关联的研究已经失败^[22-25]。其中一项研究表明，与一般人群相比，不明原因习惯性流产与锥形精子增多相关(P < 0.005)，但与精子数量、活动力、无定形精子形态、低渗肿胀试验（Hypoosmotic swelling test）或成活率无关联。然而，习惯性流产夫妇与生育捐献者相比，无定形精子形态(P < 0.01)及低渗肿胀试验(P < 0.05)仍具有统计学意义。Buckett等人^[26]观察了20对习惯性流产的夫妇中的男性和20位捐献者男性（对照组），显示习惯性流产与低渗肿胀试验评分有关联。尽管人们对此报导有争议，但就生物学意义上来说，精子的活动力和质量是可能影响受孕和流产率。大部分精子质量与习惯性流产及流产率关联的研究都是以标准的精液分析参数为参照的。Gopalkkrishnan等^[27]调查了更详细的精子质量，特别在观察精子细胞核及染色质浓缩方面，确实发现弱精子质量（检测到精子细胞核空泡或异常染色质增加）和习惯性早期流产相关。总之，尽管精子质量是否与习惯性流产相关一直存在争议，这些最近数据表明，进一步研究更为具体的精子质量标志是值得探讨的。

三、男性年龄

成年男性随着年龄的增加，生育能力也逐步下降。老龄男性中可出现睾丸组织渐萎缩、精子日生成量减少、睾丸生殖组织形态学的改变（如非典型精原细胞及异常精子细胞增加，曲精小管膜间质纤维化以及未成熟生殖细胞脱皮增加）及细胞突变或异倍体增加，以致精子质量降低（特别是活动力）、受孕率降低、流产率增加、子代常染色体区域显性遗传疾病增加（即Apert综合征，软骨发育不全，马方综合症Marfan Syndrome，沃登伯格病Wardenburg等）及胎儿死亡率增加。对于精子功能方面，老年男性和年轻男性间无明显差异，除了老年男性组精子活动力稍降低，而参照世界卫生组织标准，其几乎接近正常水平^[28]。细胞遗传学分析来自精子捐献者精液标本表明，与23-29年龄段的男性比较，59-74岁男性中精子染色质的数量和结构畸形率增加^[29]。这些数据表明，父系年龄可能影响精子染色质结构畸形。美国加州研究^[30]5000妇女表明，当父系年龄在35岁或以上时，第一次早期自发流产和第二次早期自发流产的概率增加。另一项研究指出，流产风险增加取决于父母双方的年龄^[31,32]。以上各报导都针对生育期男性，有些报导的年龄小于35岁，大部分报导的年龄大于40岁或大于50岁。De La Rochebrochard等人^[31]指出，流产风险在40岁及以上的男性中不断增加，特别是当母亲的年龄在35岁或以上。在双方年龄都较大的情况下，优势比增加：母系大于35岁和父系35-39岁，优势比为3.38（95％置信区间＝1.76-6.74）并且随着年龄增长比例越高，父系年龄超过40岁，结果的优势比为6.73（95％置信区间＝3.5-12.95）。丹麦的一项研究显示，父系年龄超过50岁比父系年龄是45岁单独影响早期胎儿死亡率增加2倍。该机制目前尚不清楚，这些结果可能是由于精子非整倍体增加或精子DAN质量的原因。Wyrobek等人^[33]研究97例男子（22-80岁，非吸烟者）发现父系年龄与精子DNA片段化指数频率(P < 0.01)及软骨发育不全风险（1138G>A；P < 0.001；增加 3.3%/岁），通常，高DNA片段指数（> 30%）与生育率降低、低出生率、高流产率相关。父系年龄同样与精子功能获得性突变（Gain-of-function mutations）相关，从而对胎儿产生不利影响。这些功能获得性突变发生在三个确定的热点上：FGFR2、FGFR3、RET。这些基因编码酪氨酸激酶受体^[34]。这些突变中每个突变与一种常染色体显性遗传相关，如果能顺利成活的话，可影响子代（软骨发育不全，Apert综合征等）。

四、胚胎、胎盘相关影响因素

胚胎、胎盘的相关影响因素可能同样对习惯性流产起重要作用。有证据表明，父系基因影响早期胚胎发育，其表达的基因可能影响种植、胎盘增值、胎盘血管及胎盘质量。精子的完整性对精卵相互作用、受精及早期胚胎发育是最重要的^[35,36]。父系的基因组为受精后第一次减数分裂提供中心体^[35]。精子的质量与胚胎到达囊胚期的能力及进展到着床有关。父系的表达基因调节滋养细胞的增殖和浸润以及随后的胎盘增殖^[36]。不仅人类的数据如此，孤雌性生物数据^[37]同样强调雄性基因组的重要性，孤雌性（2个雌配体受孕）受孕体产生的胚胎没有或很少有胎盘，而在孤雄性孕体（2个雄配子受孕），受孕体完全由胎盘组成，很少或根本没有胚胎。Chaouat等^[38]的一项研究表明，对比CBA/J雌性小鼠与DBA/2雄性小鼠（异常）或CBA/J雄性小鼠（对照组）交配，异常组导致习惯性流产，其大多发生在中期流产（12-14天），分析表明可能与蜕膜血管重塑相关。习惯性流产同样与白细胞介素-10缺乏、母系年龄及环境条件有关^[38]。任何对胎盘血管产生不利影响的基因（即血管内皮细胞生长因子，β-转化生长因子，成纤维细胞生长因子等）都可能导致习惯性流产。男性基因组对胎盘血管的作用大于女性基因组。这就是上面提到的孤雌性基因研究产生的理论。进一步研究观察习惯性流产中男性对胎盘血管的影响是有必要的。

五、外部暴露因素：

男性精子的发生是持续不断的，所以成年男性的精子特别可能发生突变且不在体细胞中表现出来，外部暴露可因此影响精子。电离辐射、空气污染以及其他环境暴露因素对诱导突变或精子非整倍体有影响。癌症的治疗（例如化疗和放疗）能增加精子DNA的突变率^[39]。男性随着年龄增长更容易导致突变发生，从而影响精子DNA、降低受孕、增加流产率和增加出生缺陷。一些医学治疗可通过其他机制影响精子质量。Sergerie等^[40]最近研究报道提出，核苷逆转录酶抑制剂同型物的应用，常用来治疗HIV和其他逆转录病毒疾病，可导致精子线粒体能量产生能力的改变。核苷逆转录酶抑制剂同型物已知导致生物体活性氧产生增加，其结果是致使线粒体跨膜电位（Deltapsim）的退化。线粒体跨膜电位缺失易释放一些特殊的凋亡因子，如细胞色素C，其可启动程序性细胞死亡。精子DNA片段，与细胞凋亡有关，可能是上述报导的习惯性流产的一种原因。感染性因素是否影响流产目前仍是个争议，Hill JA ^[23]等研究表明，与对照组相比，不明原因复发性流产夫妇没有异常高比率亚临床生殖道感染（以精液白细胞为标记诊断），只是发现夫妇中女性有精子抗原细胞免疫时，男性精液中CD4+和CD8+T淋巴细胞的浓度明显升高。

六、其他因素

1.甘露糖结合蛋白（Mannan binding protein ，MBP)

MBP是鲜为人知的，有关其对不同人群中生育的影响仍是个争议。Kilpatrick等^[41]人研究MBP水平，发现这种蛋白的缺乏和习惯性流产相关。在经历习惯性流产的夫妇中，16％（21/135）的女性和14％（15/108）男性发现有异常低水平MBP，而正常经产对照组低于5％（P < 0.005）。纯合子等位基因突变的个体中，这种相关更加紧密。这一初步研究表明，胎儿胎盘单位中低MBP增加了流产风险，可能是由于感染导致胎盘细胞因子失衡。Christiansen等^[42]发现在丹麦有习惯性流产的妇女同样与低MBP有关联，但在小样本的丹麦男性中并不明显。Kilpatrick等^[43]进行了一项随访研究，再次发现习惯性流产与夫妇任何一方携带低水平MBP相关，他们的研究旨在确定非孕期MBP水平，男性和女性非孕期最高临界值为0.6，流产率大约是35％（优势比为1.32，P＝0.04）

2.金属蛋白酶组织抑制因子-2（Tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2）

小鼠研究发现表明，男性金属蛋白酶组织抑制因子－2的表达异常可能影响在蜕膜血管重塑而导致习惯性流产。Dixon等^[44]对比CBA/J雌性小鼠与DBA/2雄性小鼠（异常）或CBA/J雄性小鼠（对照组）交配，发现试验组小鼠一种金属蛋白酶组织抑制因子－2过度表达2.6倍（P=0.03），并且这些交配小鼠导致了50-80％的流产率。但也有研究发现，在习惯性流产的一些病例中，这一机制可能不发生或产生异常，而且该研究仅实施于动物实验，目前并无人类相关实验数据，因此金属蛋白酶组织抑制因子-2是否影响习惯性流产仍需进一步的研究。

七、总结与展望

习惯性流产是患者和医生共同面临的难题，在病因筛查方面，目前仍无完整的标准方式，在既往的临床和基础研究中，主要侧重于女性因素的筛查，而从上述研究报道显示，男性在习惯性流产中亦发挥重要作用，因此，对习惯性流产病因筛查加入男性因素筛查是十分必要的。

习惯性流产男性因素主要集中在男性体细胞或生殖细胞基因方面。众所周知，男性染色体数量异常或染色体结构排列异常将导致高流产率、低生育率或不育率。近期研究表明，精子染色体自身可随时间改变，其因素主要有男性年龄、医学诊疗、放射因素及环境因素。精子二体性或非整倍体的增加将同样导致流产风险增加。特殊基因如Y染色体微缺失，嗜血栓突变，或HLA－G 多态性都与高流产率相关。任何明显损伤精子DNA完整性以至于DNA片段增加也可导致高流产率。除了基因外，精子形态学因素也可能与流产相关，如锥形精子数增加、精子细胞核和染色质浓缩异常。某些细胞因子异常（MBP、TIMP-2）和任何影响胎盘血管的父系基因异常提示有流产风险。目前研究报道表明，大量机理显示父系因素能影响胚胎发生、植入、胎盘健康、出生缺陷和流产。

尽管近期的一些报道是初步的，众多途径导致高流产率的事实已经表明男性因素在习惯性流产中的重要作用。随着这些报导的进一步充实，我们对习惯性流产夫妇的研究可能将进一步扩大到男性的评估。深入研究男性因素对习惯性流产影响将使我们得知如何诊断和处理这些疾病。初步的临床病因筛查对习惯性流产夫妇是十分重要的，男性的精液分析及女性的卵泡功能检测是首选的方式，此外，对双方涉及相关影响因素如解剖因素、内分泌因素、免疫因素、感染因素、疾病因素、医源性因素（药物、放射性治疗等）、外环境暴露因素等进行筛查也是必要的，这些因素可能相互产生影响，发现影响因素时可行积极针对性的治疗可能避免部分习惯性流产的发生。

此外TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（Terminal deoxynucleotidyl

transferase–mediated dUTP-biotin endlabeling assay，TUNEL）可用于检测精子DNA碎片率或精子凋亡率，而抗氧化剂的应用将不仅有助于降低精子DNA碎片率^[45]，同样可降低流产率。体细胞核型检测和精子染色体的FISH检测可用于对习惯性流产夫妇的病因筛查，联合IVF技术，可以避免男性相关因素影响而治疗部分习惯性流产。植入前遗传诊断（Preimplantation genetic diagnosis,PGD）可诊断胚胎中非整倍体，同时可评估胚胎的非整倍体是否源自母系或父系，这可作为回避流产风险的一种方法。Vidal等^[46]用7号染色体多重荧光原位杂交试验记录表明，多达41％的IVF胚胎是非整倍体。然而，Aran等^[47]通过研究已知减数分裂异常的男性，将PGD＋IVF与单独IVF对比，发现目前的PGD诊断技术可能不会改善流产率（与对照组比较）。在将来，随着PGD分析谱发展到分析胚胎所有的染色体，在胚胎转移之前，我们可能更有效地利用PGD避免习惯性流产的发生以及改善临床效果。此外，新技术如卵胞浆内单精子注射技术(Intracytoplasmic sperm injection，ICSI) 或“高扩大ICSI”可有助于克服一些父系因素，而且一项研究^[48]已经表明改善了临床效果。在不久将来，我们可能发现其他更有效的治疗方法来治疗因男性因素导致的习惯性流产。

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