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屈静 副主任医师 北京同仁医院 中医科

脾胃湿热与变应性鼻炎模型小鼠相关性的实验研究

屈静 副主任医师 北京同仁医院 中医科
发表于2018-01-15
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笔者临床治疗过敏鼻炎多年,据前期的临床观察,脾胃湿热在变应性鼻炎发病中起着重要作用,本研究拟建立脾胃湿热的动物模型,观察其症状学、病理学、细胞因子的改变,以期从实验角度证实。北京同仁医院中医科屈静

1.材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物

采用SPF级、8-10周龄雄性BALB/C小鼠,体重最低17.7g,最高21.6g,平均体重19.81±0.96g,共30只,购于维通利华公司。在北京市眼科研究所屏障系统动物房饲养,恒温恒湿的环境下,固体饲料,适应性饲养7天后开始正式实验。30只小鼠随机分为3组:脾胃湿热并变应性鼻炎模型组、变应性鼻炎模型组、空白组。

1.1.2试剂及药品

卵清蛋白(OvalbuminOVAsigma公司)、氢氧化铝(Al(OH)3,上海美兴化工股份有限公司)、生理盐水、蜂蜜水、猪脂、55度白酒、10%甲醛、10% 依地酸钠钙EDTA)、石蜡、IL-4IFN-γELISA检测试剂盒(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 AR模型

Ogasawara HYuhui Ouyang方法稍加改动,基础致敏阶段(1-14天):OVA 50μg/只加入免疫佐剂Al(OH)35mg/只)制成生理盐水混悬液1ml,予小鼠腹腔注射,隔天1次,共7次;激发阶段(15-21天):以5% OVA20μL/ 点鼻,1/d,共7次。

1.2.2 脾胃湿热+AR模型

AR造模基础致敏阶段同时进行。

采用吕冠华、刘冬梅方法稍加改善,第1-5天,将小鼠单日禁食(自由饮水),双日正常饮食,自第6天起每日每只大鼠给予20%200g/L蜂蜜水,自由饮用,不再给其他饮水。第791113天,每只小鼠灌服白酒10ml/kg,第68101214天每只给予猪脂30g/kg第15至21天,恢复正常饮食、饮水,与AR模型组处理完全相同。

1.2.3与造模同时进行的对照处理

在脾胃湿热状态造模的同时,空白组和AR模型组置于正常环境下正常饲料喂养,自由饮水。AR造模时,空白组给予同等剂量生理盐水作致敏液,激发期给予等剂量生理盐水滴鼻。

1.3观察项目

1.3.1观察一般情况

观察并详细记录每日小鼠的皮毛、状态、体重、大便、行为、状态。

1.3.2 鼻部症状观察

末次鼻腔滴药后30分钟,观察小鼠搔鼻、喷嚏、流清涕鼻部症状,并进行评分。

评分标准按照赵秀杰采用,陈炜稍加改进的积分办法。鼻痒:无抓鼻为0分,抓鼻1-5次为1分,5次以上为2分;喷嚏:无喷嚏0分,1-3个为1分,4-10个为2分,11个以上为3分;清涕:无鼻涕为0分,流至前鼻孔为1分,超出前鼻孔为2分,涕流满面为3分。

1.3.3鼻粘膜病理改变 

取血后将小鼠断头处死,分离组织,剪去鼻腔周围骨性结构,将整个鼻腔取出,用10%甲醛固定,用10%EDTA脱钙,以针刺鼻甲骨性结构无阻力为标准,进行石蜡包埋,行苏木素—伊红(HE)染色,莱卡组织切片机将标本做4μm厚切片。应用奥林帕斯光镜,视野(×10-×400)倍观察。

1.4统计分析

采用SPSS 13.0统计软件包,全部数据按计数资料、计量资料选择统计方法,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1病理观察

个标本任选3张切片,应用奥林帕斯光镜,自低倍视野(x 10)至高倍视野(x 400)观察。主要观察项目有粘膜是否完整,有无渗出、出血,嗜酸粒细胞数目。

脾胃湿热+AR模型组中可见鼻中隔粘膜有明显渗出、出血,粘膜内及髓腔见大量嗜酸粒细胞浸润,AR模型组中可见鼻中隔粘膜较上组出血、渗出情况要好,粘膜不连续,内见嗜酸粒细胞浸润,空白组偶见嗜酸粒细胞、鼻粘膜完整、连续。典型片略。

2.2 末次激发后小鼠症状评分比较

比较各组小鼠体重。末次鼻腔滴药后30分钟,观察小鼠搔鼻、喷嚏、流清涕3个鼻部症状,并进行评分。

表1  三组小鼠体重、症状评分比较(分, — X±S)

体重

症状评分

脾胃湿热+AR模型组

19.88±0.99

4.5±0.71

AR模型组

19.63±1.06

2.67±1.03

空白组

19.81±0.96

0.5±0.58

P

P>0.05

P<0.05

比较实验前各组小鼠体重,无明显差异。各组分数比较,P<0.01,应用lsd法两两比较:“空白组”与“AR模型组” P<0.01“AR模型组”与“脾胃湿热+AR模型组” P<0.05

统计分析表明,三组造模后变应性鼻炎评分有显著差异,两两比较也有显著差异。

2.3 三组小鼠体征比较

空白组小鼠在整个饲养、造模过程中,毛色鲜亮,活动灵敏;“脾胃湿热+AR模型组”在造模开始后5天始,逐渐毛色稀疏、无光泽,精神差,活动迟缓;“AR模型组”自进入造模激发阶段,逐渐有毛发脱落、光泽变差。如下图示。略。

3 讨论

变应性鼻炎的免疫反应过程是体外环境作用于机体导致异常免疫反应,造成Th1(1型辅助性T细胞)和Th2(2型辅助性T细胞)免疫反应失衡引发的以鼻腔粘膜Th2免疫反应为主的变应性炎症反应。细胞因子对变应性炎症的调节作用被逐步阐明

Th1细胞主要分泌白细胞介素2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ),介导细胞免疫反应,Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5,促进体液免疫反应。在变应原致敏阶段,Th2细胞分泌IL-4刺激B细胞合成IgE。在速发相反应阶段,肥大细胞产生炎性介质,引发急性变应性反应。同时,肥大细胞还产生IL-4和IL-5。另外,T细胞、巨噬细胞等还可分泌神经营养素,参与慢性变应性反应。本研究测定IFN-γ、IL-4正是变应性鼻炎病理机制中的关键作用因子,更好的反应脾胃湿热状态对变应性鼻炎免疫反应进程的影响。结果显示,在三组小鼠实验完成后,IFN-γ、IL-4三组之间有显著差异,两两对照,亦有差异,说明变应性鼻炎疾病小鼠较正常小鼠的免疫因子高,脾胃湿热状态下,免疫因子较单纯变应性鼻炎状态的免疫因子高。脾胃湿热状态在变应性鼻炎发病中有着促进作用。之前有学者研究证实脾胃湿热证大鼠免疫功能低下,应用治疗脾胃湿热的中药有恢复机体免疫功能的作用。亦说明出中医脾胃湿热状态时鼠的免疫功能下降,从而对变应性鼻炎发生发展起到推进作用。

通过病理学检测和体征观测的结果,亦反应出,在脾胃湿热的条件下,小鼠的变应性鼻炎体征表现更显著,变应性鼻炎评分之间有显著差异,鼻黏膜的病理性变化更加明显。

脾胃湿热是目前临床上变应性鼻炎的常见证候,在现代社会中,环境因素,生活压力增大,饮食不规律、嗜食肥甘厚味,熬夜等生活方式的变化,导致人群中脾胃湿热证候状态逐渐增加。内在证候状态加之外在过敏原,从而发生变应性鼻炎鼻炎关于脾胃湿热的实验研究随之增多,形成了比较成熟的造模方法,本次脾胃湿热模型综合了饥饱失常、进食油腻、饮酒等因素而成。

此次从基础实验角度证实了脾胃湿热与变应性鼻炎发病的内在关系,认为中医脾胃湿热状态与变应性鼻炎发病存在密切关系。

       本文发表于《中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志》2017年第2期

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