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卢绪章 三甲
卢绪章 副主任医师
常州第二人民医院 血液科

CIK细胞生物治疗方法在肿瘤治疗领域的研究进展

近年来,在分子生物学和基因工程技术的飞跃发展的推动下,以免疫治疗为基础发展而来的肿瘤生物治疗日益受到重视,显示出良好的应用前景,肿瘤生物治疗已经成为继手术、放疗和化疗三大经典治疗模式后的第四模式。肿瘤生物治疗是指通过肿瘤宿主防御机制或生物制剂的作用以调节机体自身的生物学反应,从而抑制或消除肿瘤生长的治疗方法。肿瘤生物治疗中的过继性细胞免疫疗法(adoptive cell immunotherapy,ACI)是指向肿瘤患者转输具有抗肿瘤活性的免疫细胞(包括特异性的和非特异性),直接杀伤肿瘤或激发机体免疫反应来杀伤肿瘤细胞,达到治疗肿瘤的目的。研究适合于该疗法的新型免疫活性细胞是目前国内外的热点并逐渐受到重视,特别是随着介导免疫细胞间相互作用的细胞因子(cytokine,CK)的不断发现和重组成功,使得现代ACI已发展成为主要采用由这些细胞因子激活的免疫细胞进行免疫治疗的方法。淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞(CD3AK)、细胞毒性T细胞、 树突状细胞(DC)、基因改造的免疫活性细胞以及CIK细胞等均属于肿瘤生物治疗的免疫活性细胞。南京医科大学附属常州第二人民医院血液科卢绪章

CIK细胞是由美国斯坦福大学的Schmidt-Wolf等于1991年率先发现的,他们将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得了一群异质细胞,该细胞共同表达了CD3和CD56两种膜蛋白分子,是目前所知杀伤活性最强的一种肿瘤生物治疗效应细胞,该细胞兼具T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤等优点,又称为NK样T淋巴细胞(NKT细胞),被认为是新一代抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。CD3+CD56+T细胞是CIK群体中主要效应细胞。研究发现CIK细胞对肺癌、肠癌、胃癌、肝癌等多种肿瘤有明显的杀伤效应,同时也有报道CIK细胞可提高肿瘤患者的自身的免疫功能,所以CIK细胞的临床应用研究也倍受人们的关注。

1 CIK细胞的生物学特性

1.1 CIK细胞的制备

Schmidt-wolf 等使用密度离心方法常规分离患者的外周血,制备单个核细胞悬液,调整细胞浓度1×106个/ml进行培养,于培养体系中加入γ-干扰素(IFN-γ)、重组人白介素-2(rhIL-2)、重组人白介素-1(rhIL-1)、抗CD3单克隆抗体等多种细胞因子进行诱导扩增。这样制备出来的CIK细胞在培养的15d,细胞数可增长754倍。在30d的观察期内,细胞增殖高峰时间在第21-28d,细胞数可增长1000倍以上,并与Jiang等报道相符合。

1.2 CIK细胞的增殖力

大部分研究者均通过干扰素γ、rIL-2和抗CD3McAb等细胞因子诱导外周血或脐血中的CIK细胞,经14-21d扩增的CIK细胞其比例可由0.10%-0.13%,上升至19.0%-20.5%,CIK细胞的高增殖活性解决了体外扩增效应细胞所获细胞数目少的难题。

1.3 CIK细胞的表型分析

CIK细胞在肝脏中分布最多,其次为外周血。通过表面标志分析,CIK细胞为CD3、CD56双阳性细胞群,但主要来源于CD3+CD56-的T淋巴细胞,而非CD3-CD56+的NK细胞。CIK细胞的另一个重要来源是CD4-CD8+的T淋巴细胞群。此外,CD4-CD8-的T细胞经过细胞因子诱导培养后,其中56%可同时表达CD3+CD56+,故CIK细胞也可来源于CD4-CD8-的T细胞。这种双阳性T细胞按细胞受体(TCR)的不同,进一步可分为CD3+CD56+ αβT细胞及CD3+CD56+ γδT细胞两个亚群,利用FACS测定CIK表面的CD分子表达情况及其百分率,显示CIK细胞高度表达CD3、CD54、CD11a,中度表达CD3CD56、HLA-DR、CD28CD54、CD28,不表达CD86和CD80。

1.4 CIK细胞的杀瘤活性

CIK具有广谱的肿瘤杀伤作用,其很强的细胞毒活性源于其较高的存活率和较强的增殖能力,近期研究表明,CIK细胞不仅以非MHC限制杀伤靶细胞,而且以MHC限制的方式杀伤靶细胞,树突状细胞以MHC限制的方式呈递抗原给CIK细胞中的CD4+或CD8+T淋巴细胞,使其中的细胞毒T淋巴细胞大量扩增,激活CIK细胞中的MHC限制性杀伤功能,从而在抗肿瘤免疫治疗中,清楚残余的肿瘤细胞,发挥更强大的细胞毒作用,更有效的阻止或延缓肿瘤的复发。实验研究证明CIK细胞可通过两种方式杀伤肿瘤细胞: 1) 直接杀伤作用。CIK细胞识别靶细胞(肿瘤细胞)并与之结合,启动细胞溶解反应释放一些细胞毒颗粒或因子,从而溶解靶细胞(肿瘤细胞)。2) 间接杀伤作用。CIK细胞除自身直接溶解细胞外还能分泌高浓度的IL-2、IL—6、肿瘤坏死因子(TNF)、Y干扰素(Y-IFN)等多种细胞因子(此类因子对肿瘤细胞均有直接的细胞毒活性或抑制作用)产生间接杀伤作用。Verneris等研究表明过继性免疫治疗失败的一个重要原因是效应细胞被肿瘤细胞表面表达的某些蛋白诱导而凋亡,而CIK细胞虽然在Fas被占据后会引起少量细胞凋亡,但对其杀瘤细胞毒性没有明显影响,表明CIK细胞具有合成FasL的能力。

1.5 CIK细胞对正常淋巴细胞和组织细胞无杀伤作用。

CIK细胞是有选择性的直接或间接杀伤肿瘤细胞,但对自体或异体转化的淋巴细胞,对正常组织细胞没有杀伤活性。因此就CIK细胞而言对人体没有毒副作用。

1.6 CIK细胞调整人体免疫功能

CIK细胞可以调整人体的免疫状态,纠正患者的免疫功能,提高肿瘤患者对手术、放疗和化疗治疗的耐受性。国外研究资料证实CIK细胞治疗1—2周后,患者外周血中不仅CD3、CD4、CD4/CD8等均有不同程度的提高,而且淋巴细胞因子分泌增多,淋巴细胞免疫功能明显增强,具有显著的调整机体免疫状态,提高免疫功能的作用。

1.7 刺激骨髓造血。

CIK细胞能分泌多种集落刺激因子如GM-CSF、G-CSF、M-CSF。经CIK细胞治疗上述因子在血清中的浓度可提高500倍以上,因此具有非常显著的促骨髓造血作用。

2 CIK细胞的激活机制

CD3+CD56+ T细胞是CIK群体中主要效应细胞。T细胞是机体免疫系统实现细胞免疫和免疫调节的重要成分,特别是在抗病毒感染和对癌细胞的免疫监视上有重要作用。CD3是T细胞的表面分子,它有5种肽链,即γ、δ、ε、ζ和η。CD3分子与T细胞表面的抗原受体(TCR)结合成复合体,TCR是免疫球蛋白超家族成员之一,是T细胞特有的表面标志。在MHC分子限制下能够识别抗原。CD3的5种肽链均能转导TCR的信号,传递并转换抗原信息,其中ζ链起着重要的作用,同时还能增加TCR结合抗原的敏感性。T细胞的活化主要是通过CD3_TCR复合体途径:CD3_TCR复合体参与对抗原的识别是通过磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)代谢和蛋白酪氨酸激酶(PTK)的活化而实现的。T细胞活化信号经磷脂酰肌醇代谢活化蛋白激酶C(PKC),启动细胞内的Ca2+途径及Ras_MAP激酶途径,产生激酶磷酸化的级联反应,导致细胞因子基因转录活化,产生细胞因子,调节T细胞活化。为了保持TCR的激活信号需要T细胞协同刺激分子共同参与,其中CD28和B7激活途径在抗肿瘤免疫中起重要作用。

3 CIK细胞与多种细胞因子的协同作用

CIK细胞是多种细胞因子共同诱导培养的细胞,多种细胞因子的作用是相互协同,单一因子对效应细胞的增殖及细胞毒活性无作用或者小于多种细胞因子的联合作用,联合作用的机制是最终共同激活静止T细胞,提高细胞表达IL_2受体和产生IL_2的能力,启动自分泌途径IL_2依赖的T细胞激活反应。 CIK细胞的体外增殖需要外源性细胞因子如IL_2、IL_7、IL_12等的辅助,外源性IL_2、IL_7、IL_12可以显著促进淋巴细胞的生长,而对CIK细胞的细胞毒作用无影响[3]。

4 CIK细胞的不同来源

4.1 自体CIK细胞

避免由于交叉感染引发的其他疾病,用患者自身的CIK细胞经体外扩增回输,使CIK细胞输注的安全性得到了极大提高。Shi等将自体CIK细胞回输原发性肝细胞癌患者体内后,提高了患者机体的免疫应答水平,改善了肝脏功能,患者的症状减轻,无不良反应。

4.2 脐血CIK细胞

脐血CIK细胞因具有采集方便、来源广泛、输注不易引起严重移植物排斥反应、体外扩增快、杀伤活性强等优点,而且对肿瘤细胞的作用显著优于外周血CIK细胞,大量体外实验已为进一步临床应用奠定基础,而治疗疗效还有待于进一步的临床试验去验证。

4.3 骨髓CIK细胞

骨髓来源CIK细胞增殖能力较外周血来源的CIK细胞稍差,但仍具有相当高的增殖能力,且在细胞毒方面与外周血CIK细胞相似。

5 CIK细胞杀伤靶细胞的机制

首先,与靶细胞的结合阶段。靶细胞表面分子与效应细胞表面的相应受体结合。由于CIK的细胞杀伤作用是非MHC限制性的,故CD4和CD8在其识别肿瘤细胞的过程中并非必不可少。Wolf等[4]证实CIK细胞的细胞毒活性可被抗淋巴细胞功能相关抗原_1(LFA_1)或抗细胞间粘附分子_1(ICAM_1)的单克隆抗体所阻滞,提示上述细胞表面粘附分子在CIK细胞识别肿瘤过程中起关键作用。其次,致死性打击阶段。效应细胞对靶细胞造成不可逆损伤。Mehta等认为,当CIK细胞被激活时通过FcR使LFA_1和ICAM_1的结合状态从低亲和力转为高亲和力,同时向细胞间排出含有α-氮-甲苯碳酰基-左旋-赖氨酸硫甲苯酯(BLT)的胞浆毒性颗粒,这些颗粒能够直接穿透封闭的靶细胞进行胞吐,从而导致肿瘤细胞的裂解。使用主要组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类和Ⅱ类抗体不能阻滞CIK细胞对靶细胞的杀伤作用,说明CIK细胞的杀伤作用具有非MHC限制性。Sun等在研究CIK细胞对MGC_803胃癌细胞株诱导凋亡作用及机制中证明:随着CIK细胞与胃癌细胞效靶比增加及作用时间延长,抑制率明显增强。同一作用时间不同效靶比之间差异有统计学意义(P<0.01),同一作用时间同一效靶比之间差异也有统计学意义(P<0.01); 扫描电镜观察结果:在效靶细胞混合培养5 h后,可见效靶细胞的相互接触,靶细胞表面有孔洞形成。共培养14 h后,多数靶细胞发生凋亡,细胞表面可见许多直径不一的圆形凋亡小体及孔洞。共培养24 h后,可见靶细胞遭到严重破坏,细胞发生破裂,死亡方式有细胞凋亡及溶解坏死2种; CIK实验组P53、P16、C_myc、Bcl_2蛋白随作用时间延长表达均下降,Bax蛋白表达上调。另外,CIK细胞活化后产生大量的炎性细胞因子,如IL_2、IFN_γ、TNF_α等,不仅对肿瘤细胞有直接抑制作用,还可通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。Verneris等认为,某些肿瘤细胞(如黑色素瘤、卵巢癌)通过FasL介导TIL、CTL凋亡而逃脱免疫清除,但对CIK细胞敏感,这是因为在CIK细胞诱导的过程中,由于IFN_γ等细胞因子的作用或/和活化诱导的细胞死亡(ACID)机制导致对Fas敏感的或已被活化的T细胞逐渐被选择性清除,最后诱导获得的CIK细胞便对Fas耐受。此外由于细胞型Fas相关死亡区域蛋白样白介素_1β转换酶抑制蛋白(cFLIP)的存在及Fas死亡区结合蛋白(FADD)水平很低,影响了死亡信号的传导,再加上CIK细胞高水平表达Bcl_2、Bcl_xL、DADI、survivin等抗凋亡基因,这些原因共同导致了CIK细胞可以耐受表达FasL的肿瘤细胞诱导的凋亡,从而对其进行有效的杀伤。国内研究者证实CIK细胞可以影响胃癌腹膜种植转移细胞的细胞周期,并具有诱导细胞凋亡的作用[8]。在Ewing's家族肿瘤细胞中,Verneris等发现CIK参与了CD3xHer2/neu双特异性抗体介导的细胞毒作用。又有研究者使用寡核苷酸序列刺激急性髓性白血病和非急性淋巴细胞性白血病细胞,发现刺激后CIK细胞中与蛋白合成有关的基因、信号转导相关基因以及与免疫应答相关基因均高表达,同时CIK细胞产生TNF_β增多。最后,靶细胞溶解阶段。在此阶段不依赖于效应细胞的存在,靶细胞溶解死亡。

6 CIK细胞的基础实验研究

目前已经广泛开展了针对多种肿瘤细胞系和活体肿瘤组织应用CIK细胞的动物实验和临床前期试验,并有一些相关报道。Wolf等[11]在研究CIK细胞表面标志时发现:当培养14d时,CIK细胞的T细胞受体(86.5±5.7)%为TCR_α/β阳性, CD56阳性表达为(28.5±8.6)%,培养前后的CD56+细胞增加1071倍,表明CD3+CD56+T细胞是CIK群体中主要效应细胞,Wolf和Lu[12-13]均发现CD3+CD56+的CIK细胞来源于CD3+CD56-T细胞而非 CD3-CD56+的NK细胞。表达CD56抗原的细胞大多起源于CD4-CD8+细胞。Leemhuis等通过实验证实,CIK细胞在培养过程中,CD16+CD56+细胞<1%,CD3+CD56+细胞绝对数扩增290倍,说明CIK细胞发挥抗体依赖性的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用的可能性很小。

Flieger等[15]研究发现体外实验中CIK细胞对急、慢性髓系白血病的治疗效果得到肯定。Li等[16]将多药耐药基因(MDR_1)转入CIK细胞后,CIK细胞获得了多药耐药性,并且转染后的CIK细胞仍然保持原有的肿瘤细胞杀伤活性,这样CIK细胞的免疫治疗和化疗可以同时进行,从而扩大了CIK细胞治疗的应用范围。Linn等[17]在另一项研究中用正常供者的异体CIK细胞输注给白血病小鼠,该异体CIK细胞不诱导移植物抗宿主病(GVHD) ,而且可以延长荷瘤小鼠的生存期。该研究同时显示CIK细胞可以与树突状细胞(DC) 相互作用增加细胞的抗瘤活性。Nagaraj[18]将包含人IL_2基因片段的重组质粒用电穿孔法导入CIK细胞,并与细胞DC共同孵育后治疗胰腺癌,体外检测发现转染后CIK细胞在增殖率和细胞杀伤活性上均高于未转染细胞。Zhang等[19]研究发现从原发性肝细胞癌患者获得的CIK细胞对多药耐药性细胞系Bel_7402/R具有很强的细胞毒作用。

7、CIK细胞在肿瘤治疗方面的研究

CIK细胞等过继免疫疗法可以在不损伤机体免疫系统和功能的前提下,直接杀伤肿瘤细胞。同时在调节和增强机体的免疫功能、清除微小残余病灶方面等方面也发挥着重要作用,因而成为肿瘤手术、放化疗的重要辅助手段,为预防肿瘤复发,改善晚期患者的生存质量提供了新途径。

7.1 CIK细胞治疗肝癌

Zhou QM等在85名接受过微创治疗的肝细胞癌患者中观察CIK的疗效,发现微创技术治疗后再用CIK治疗能提高肝癌患者的免疫力,减少癌症的复发。Zhao等应用肝动脉栓塞化疗(TACE)序贯联合CT引导下射频消融(RAF)治疗和CIK的新型模式治疗原发性肝癌,显示可明显降低乙肝病毒含量或消除乙肝病毒,阻断致癌因素,提高治疗疗效。

7.2 CIK细胞治疗肾癌

CIK细胞免疫治疗对肾癌和淋巴瘤具有较好的应用前景,国内专家用CIK细胞治疗14例术后转移的Ⅳ期肾癌患者,结果显示3个周期以上的总有效率可达44.8%,平均生存期为19.36个月。并且,由于CIK细胞治疗不使用大剂量IL-2,因此在治疗过程中,出现低血压和血管外漏综合征等严重副作用的可能性大大降低,患者耐受性提高,值得进一步深入研究。

7.3 CIK治疗肺癌

Li等[24]对42例I-IIIa NSCLC的术后患者,分为单纯化疗组和化疗联合DC/CIK细胞组,DFS和OS作为评价标准,应用乳酸脱氢酶的方法检测CIK细胞抗肿瘤活性。结果显示:经DC激活的CIK细胞的抗肿瘤活性明显提高,CIK细胞组2年生存率比单纯化疗组有明显提高(94.7 +/- 3.6% versus 78.8 +/- 7.0%, P < 0.05),两组的DFS无统计学差异。在无疾病进展的患者中,经DC激活的CIK细胞治疗使IFN-γ, MIG, TNF-α and TNF-β细胞因子抗肿瘤作用增强,而在疾病进展或转移的患者中无此效应。结论:这项研究表明,DC/CIK细胞在恶性肿瘤化疗治疗中的作用是通过上调细胞因子产生的抗肿瘤活性。

Wu等将59例晚期非小细胞肺癌患者随机分为化疗组和化疗联合CIK细胞组,化疗组:多西紫杉醇 75g/m2,d1;顺铂25g/m2,d1-4,3周为一个周期。对两个治疗组的机体的免疫功能、临床治疗疗效及生活质量进行了评价,结果显示:与单纯化疗组相比,化疗联合CIK细胞组的机体免疫功能增强,生活质量也有明显改善。DDR分别为43.3%和44.8%。CIK组的疾病控制率(DCR)明显明显高于化疗组(89.7% vs. 65.5%, p = 0.030)。TTP:化疗组4.67月,CIK组6.65月,中位生存时间分别为:11.0月和15.0月。与化疗组相比,CIK组的疾病无进展生存(PFS)和总生存(OS)时间都有明显延长。且CIK组无严重副作用。研究结论显示化疗联合CIK细胞治疗晚期NSCLC较单纯化疗更有益于患者,且自体CIK细胞无明显副作用。

7.4 CIK治疗血液肿瘤

Introna等对11例经异体造血干细胞移植后复发的恶性血液系统肿瘤患者予以CIK细胞治疗,结果3例完全缓解,1例造血功能改善,1例病情稳定,6例病情进展或死亡,此类患者对CIK细胞治疗有较好的耐受性,且疗效确切。研究显示CIK/IL-2的临床疗效受肿瘤负荷制约,接受CIK/IL-2辅助治疗前应联合其他疗法尽量降低肿瘤负荷,肿瘤负荷低于106细胞时免疫治疗可能取得最佳效果。

7.5 CIK治疗其他实体瘤

有研究者应用CIK/IL-2联合治疗15例接受过手术和放化疗2周后的头颈部肿瘤患者,并随访6-18个月,其中有13例患者未发现局部复发和远处转移,显示CIK/IL-2联合应用可延缓头颈部肿瘤进展时间,提高患者的生活质量,无明显毒副作用,可作为综合治疗方案的辅助治疗手段。Olioso等研究CIK细胞免疫疗法的临床试验,有6例进展期淋巴瘤,5例转移性肾癌和1例肝癌患者入组,结果显示3例完全缓解(CR)和2例病情稳定且中位随访时间长达33个月。得出结论是 CIK细胞的免疫疗法是安全有效的,可明显增强机体的免疫功能。若能被大量的临床试验证实,那将对肿瘤传统治疗产生极有利的影响。

国内研究者通过系统观察和分析CIK细胞过继免疫疗法对多种中晚期恶性肿瘤的临床疗效,发现在256例接受CIK细胞治疗患者中,总缓解率为80.86%,随访1年生存期为96.09%,2年生存期为92.96%和3年生存期为88.28% ?得出CIK细胞过继免疫疗法对多种中晚期恶性肿瘤具有广谱高效杀抑瘤作用,能明显地提高患者免疫功能,减轻临床症状,提高生活质量,延长生存期。

8、小结

CIK细胞凭借其增殖速度快、杀瘤谱广、杀瘤活性高的优势,已经成为了新一代肿瘤过继免疫疗法中的主要细胞,对其在基础及临床方面的研究正在不断深入,相信在不远的将来,CIK细胞治疗恶性肿瘤具有广阔的前景,必将成为肿瘤生物治疗中最具潜力的发展方向。如何通过CIK治疗和其他治疗手段相结合,提高治疗疗效和改善生存质量,无疑将有助于更好地发挥细胞治疗的作用,推动肿瘤生物治疗健康有序的发展。

总之,CIK细胞不仅具有由被动抗癌变为主动抗癌的特点,而且在杀瘤活性、扩增力和临床应用的可行性等诸多方面,CIK细胞都是新一代抗肿瘤过继性免疫治疗的首选方案,对清除肿瘤微小残留病灶有肯定疗效。
真诚赞赏,手留余香
卢绪章
卢绪章 副主任医师
常州第二人民医院 血液科
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