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ATP-泛素-蛋白酶体途径在癌性恶液质肌萎缩中作用的研究进展 袁磊等,中国临床医学 2008;15(6):914-916

袁磊 副主任医师 海军军医大学第三附属医院(东方肝胆外科医院) 肝胆外科
2009-06-26 3221人已读
袁磊 副主任医师
海军军医大学第三附属医院(东方肝胆外科医院)

恶性肿瘤患者常伴随癌性恶液质(cancer cachexia,CC),CC表现为厌食、贫血、蛋白质分解增加、瘦组织群丢失、进行性体重下降甚至器官功能受损,但CC 尚无统一诊断标准。研究[1]发现,约半数癌症患者有CC,它是癌症患者死亡的重要原因。CC可导致患者生活质量下降,生存时间缩短,对治疗疗效降低。

CC伴有糖、脂肪、蛋白质三大物质代谢改变,其中蛋白质代谢改变最有意义,可特征性表现为骨骼肌加速分解萎缩、负氮平衡。骨骼肌约占正常成人体重的40 % ,是蛋白丢失的主要场所。研究发现,ATP-泛素-蛋白酶体途径ATP-ubiquitin-proteasome pathway,UPP) 的激活与上述骨骼肌蛋白加速分解密切相关。海军军医大学第三附属医院(东方肝胆外科医院)肝胆外科袁磊

1  UPP 简介

UPP主要成分为泛素和蛋白酶体。泛素在生物体内大量存在,序列高度保守,故命名“泛素”。蛋白酶体呈哑铃状,包括20s蛋白酶和2个19s“帽子”。20s蛋白酶是蛋白质降解部位,19s帽状复合物主要作用是识别、转运和拆开折叠的底物。蛋白酶体高度保守,其所含蛋白酶可分为4类: ①活性部位为丝氨酸的蛋白酶类。②半胱氨酸蛋白酶类。③金属蛋白酶类。④酸性蛋白酶类。

2  UPP 降解蛋白机制

2.1  靶蛋白泛素化 UPP降解蛋白包括靶蛋白泛素化和靶蛋白降解两个步骤。靶蛋白泛素化涉及3种酶:泛素活化酶(E1)、泛素耦合酶(E2)和泛素蛋白连接酶(E3)。E1有1种, E2有数10 种,而E3有数千种之多。E3是整个系统的关键酶, 决定UPP的特异性和速率。有3种E3蛋白亚单位仅在肌肉中表达:Atrogin-1 、MuRF-1 和E3a-II[2]。肌肉特异性E3在肌肉萎缩中起重要作用。Atrogin-1能与Skp1、Roc1 和Cul1结合,共同组成SCF型E3。Atrogin-1有多个蛋白底物结合位点,SCF型E3分布范围广,其底物蛋白范围大[3]。

靶蛋白泛素化过程:首先E1将泛素C端甘氨酸活化,活化的泛素转移到E2,最后泛素从E2转移到靶蛋白上;或者靶蛋白首先连接到E3的特异位点上,然后泛素再从E2转移过来,连接到需要降解的蛋白质底物上。泛素分子结合反应不断重复,形成由5个或更多泛素分子相互连接而形成的泛素链,与蛋白质底物相连接。

2.2  靶蛋白降解 蛋白酶体是大多数细胞蛋白降解场所,在ATP参与下,泛素化蛋白底物被19s复合体识别结合,结合后泛素链被释放回收再利用,蛋白质在19s复合体促进下进入20s核心蛋白复合体内,这个复合体的中央环上含有多种水解位点。蛋白质在此被逐渐切成6~12个氨基酸组成的短肽,这些短肽迅速被胞质中的外肽酶降解为氨基酸或被转运到内质网或以I类抗原被呈递。整个反应至少有3 个步骤需要ATP。

泛素与蛋白质底物的结合是UPP的限速步骤,不同类型的蛋白质底物的降解需要特定的E2和E3参与,UPP具有高度选择性、有效性和可控性。

3  UPP CC

3.1  基础研究

3.1.1  大鼠Yoshida腹水肝癌CC模型 Baracos等发现,荷瘤大鼠蛋白降解率增高,泛素和蛋白酶亚基表达明显上调,阻断UPP能使荷瘤大鼠的蛋白降解率降低到正常水平。Yoshida肿瘤细胞接种大鼠后,骨骼肌重量有明显下降,肌肉蛋白丢失主要由于蛋白分解增加,而非蛋白合成的减少,同时还发现,肌肉中泛素以及蛋白酶亚基mRNA、Atrogin-1mRNA 和MuRF1mRNA表达明显上调。能使机体产生促炎因子的肿瘤可加剧内毒素引起的机体整体和肌肉的分解代谢,导致UPP的激活,泛素mRNA、Atrogin-1mRNA和MuRF1mRNA水平明显升高,而同样剂量的内毒素对正常对照动物无明显影响[4]

3.1.2 小鼠C226结肠癌CC模型UPP激活与IL-6表达增强相关,对Atrogin-1-/-或MuRF1-/-小鼠的研究[2]发现,在许多能导致肌肉萎缩的状态下,它们的肌肉丢失都要少得多。结肠-26腺癌细胞接种的小鼠均可发现肌肉中E3а-Ⅱ表达增加、活性增强; E3а-Ⅱ表达在CC早期就明显增高, E3аⅡ的激活可引起蛋白的泛素化增加,这一反应可被E3а-Ⅱ选择性抑制剂-甲基脂精氨酸抑制,这提示E3а-Ⅱ是

治疗CC 的潜在靶点。

3.1.3 小鼠MAC16 CC模型 蛋白分解刺激因子(PIF)是一种从小鼠MAC16瘤或CC患者尿中提取的糖蛋白,正常小鼠静脉给予PIF可导致腓肠肌和比目鱼肌重量下降,蛋白分解增加和UPP 激活;荷MAC16瘤小鼠可见到UPP 激活,E214K表达增加,C9 蛋白酶体亚基表达增加。使用PIF单抗可缓解该模型蛋白分解。体外实验发现, PIF可以导致肌细胞蛋白分解增加,且能够被PIF抗体所抑制。

在上述研究中,动物总体肌肉mRNA下降,而泛素、蛋白酶体各组成部分mRNA表达均可见升高,这种增加不是一种简单的非特异性应激反应而是一种特异的机体适应性反应,这表现在增加的mRNA只出现于外周骨骼肌组织内而在肝组织中并未观察到这种mRNA的增加。

3.2 临床研究 目前有关UPP在人类CC中的作用机制研究较少。Bossda等[7]报道,体重下降6%的胃癌患者腹直肌中泛素mRNA升高与肿瘤分期有良好相关性。泛素mRNA升高先于全身营养状态改变前出现,提示泛素基因表达升高是肌肉消耗的早期信号。

4  UPP 与细胞内外信号传导通路之间的关系

4.1 细胞因子相关途径 细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6、IFN-γ等参与UPP的激活,TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-6能使肌肉中泛素mRNA、Atrogin-1mRNA和E3а-Ⅱ表达明显上调[4]。其中,TNF-α与CC、UPP之间的关系尤为突出。TNF-а可引起CC 动物骨骼肌分解萎缩,UPP组成成分表达上调,TNF抗体可以抑制肌肉中泛素mRNA的表达。种植了Lewis 肺癌的大鼠外周血中TNF-α水平升高与肌肉蛋白降解增加以及UPP的激活相关;而TNF2α受体基因缺陷小鼠外周血中TNF-α浓度虽同样增加,但却未见到UPP的激活。TNF-α的上述作用机制与NF-κB 密切相关。E2 基因启动子附近有NF2κB 结合位点,在TNF-α刺激下,NF-κB与该位点的结合增加,E2表达增加,抑制NF-κB能阻断TNF-α引起的E2表达上调和泛素结合能力的增加[8]

4.2 IGF-1-PI3K/AKT相关途径 另一条重要通路是胰岛素样生长因子-1 (IGF-1) 相关通路。IGF-1激活两个主要途径: MEK-ERK和PI3K/Akt。MEK-ERK途径控制纤维组成类型,但不能调控肌纤维的大小。在IGF-1下游信号中,PI3K-Akt在此方面研究中处于中心地位,在Akt的下游信号中,促进肌肉合成、肥大的有GSK-3β、mTOR、p70s6k和4E-BP1;促进肌肉分解萎缩的有Foxo1、Foxo3、Atrogin-1和MuRF1。用PI3K抑制剂或者针对mTOR的雷帕霉素,可引起Atrogin-1mRNA表达增多,蛋白分解增加,而MuRF1mRNA变化不明显或仅有轻度增多。IGF-1通过PI3K/AKT途径来抑制Atrogin-1、MuRF1的表达[9], AKT不仅能促进肌肉细胞肥大,而且能通过抑制FOXO蛋白来抑制Atrogin-1、MuRF1表达从而抑制肌肉萎缩[9-10]。这是通过激活PI3K-Akt-Foxo-Atrogin-1途径来实现的,IGF-1降低MuRF1mRNA的速度较慢,Atrogin-1mRNA这一调节途径灵敏和快捷。FOXO蛋白在肌肉代谢中起着关键调节物的作用,但具体哪一种FOXO蛋白促进何种E3蛋白的表达,需要进一步研究。IGF-1还可通过Akt/mTOR 途径来缓解肌肉萎缩,抑制mTOR也能引起Atrogin-1表达下调,如果Akt被激活而mTOR仍受抑制,则蛋白合成不明显。

4.3 Myostatin相关途径 研究[11]发现,Myostatin是转化生长因子-β(TGF-β) 超家族的成员之一,在肌肉生长和分化中起负调节作用,Myostatin可引起肌肉萎缩、肌肉蛋白分解,myoD、pax表达下降,Atrogin-1、MuRF1、E214K表达增强,这些均是通过抑制IGF-1-PI3K-Akt途径进而激活FOXO1来实现的,并且与NF-κB无关。

5  ATP-泛素-蛋白酶体途径进行干预在治疗癌性恶液质中的作用

目前尚无有效的治疗方法可以逆转CC,除非治愈肿瘤,但在成人晚期实体肿瘤中几乎不可能。针__对癌性恶病质的治疗主要包括食欲刺激剂、代谢调节剂、营养支持等,但这些治疗常不能保持机体无脂体重,未提高CC平均生存时间及远期生存,短期体重增加是水潴留所致。现在看来,在CC发生的分子机制上阻断CC 的进展是有可能实现的。

研究[12]发现,多聚不饱和脂肪酸(如EPA和DHA)能改善CC,提高患者的生活质量,增加机体瘦组织群。给予荷MAC16小鼠CC模型EPA后,CC状态改善,腓肠肌的蛋白酶体活性被抑制,表达下降,但E214 K的表达不受影响,提示蛋白酶体表达下调可逆转CC。多聚不饱和脂肪酸和亮氨酸代谢产物( HMB)均能降低蛋白酶体活性,应用后蛋白酶体亚基和ATP酶亚基的表达均见减少,E214K表达也见减少。两者联用能比单用一种效果更明显。乙酮可可碱能减少荷瘤小鼠肌肉蛋白降解,降低E214K和蛋白酶亚基的mRNA的表达,β2-肾上腺素能受体激动剂能降低泛素基因的表达,能抑制UPP的过度激活,从而缓解CC肌肉分解。吲哚美辛等环氧合酶抑制剂能抑制炎症因子的释放,进而抑制肌肉UPP活性,尤其是抑制特异性E3表达,从而抑制荷瘤小鼠肌肉蛋白降解。

6  总结

CC是伴随癌症的临床综合征,明显的CC诊断并不困难,可是最低程度和最早时间的界定尚无统一标准。UPP在CC肌肉蛋白降解萎缩中的重要性已得到公认,这一途径在CC的早期阶段即可激活。目前仅对该途径的某些蛋白或mRNA作了研

究,在CC状态下某些因素引起UPP的某些成分的基因转录增加,但目前还不知道是否存在UPP的每种组分的转录表达都增加从而引起蛋白分解增加,需要进一步研究以确认。

目前尚无真正有效的方法改善CC负氮平衡。对UPP的研究将给CC肌萎缩治疗带来曙光,如果在CC代谢改变初期即对该途径进行干预,可能会取得良好的治疗效果。完全阻断这条途径可能会引起其他功能(如细胞周期和细胞分化) 的进行,所以选择性的抑制某些成分可能对临床更有利。可供选择的抑制步骤包括泛素的结合反应及蛋白酶体的活性等。目前还需要进一步阐明此途径的上游激活机制以及肌肉蛋白降解过程中可以干预的关键步骤,寻找可能的调控措施,以期为临床治疗CC 开辟新途径。另外针对触发这条途径的相关因素的抑制,如对糖皮质激素的抑制、TNF2α及IL21 的抗体应用都可能阻断异常增加的蛋白质的降解。随着对这条蛋白水解途径的深入了解,将会有越来越多的治疗方法应用于临床,在肿瘤持续存在的基础上,阻断CC 的发展是有可能实现的。

参考文献

1  Tisdale MJ . Cachexia in cancer patients [J].Nat Rev Cancer,2002,2 (11) :862-871.

2  Bodine SC ,Latres E ,Baumhueter S ,et al . Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy [J]. Science,2001 ,294 (5547):1704-1708.

3  Skowyra D,Craig KL,Tyers M,et al.F-box proteins are receptors that recruit phosphorylated substrates to the SCF ubiquitin-ligase complex [J].Cell,1997 ,91 (2) :209-219.

4  Baracos VE ,DeVivo C ,Hoyle DH ,et al . Activation of the ATP-ubiquitin-proteasome pathway in skeletal muscle of cachectic rats bearing a hepatoma [J]. Am J Physiol , 1995 ,268 ( 5Pt1) :E996-E1006.

5  Mackenzie ML, Bedard N, Wing SS, et al. A proinflammatory tumor that activates protein degradation sensitizes rats to catabolic effects of endotoxin[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab,2005,289(4): E527-533.

6  Lorite MJ, Smith HJ, Arnold JA,et al. Activation of ATP-ubiquitin-dependent proteolysis in skeletal muscle in vivo and murine myoblasts in vitro by a proteolysis-inducing factor (PIF)[J]. Br J Cancer,2001 ,85 (2):297-302.

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8  Cai D, Frantz JD, Tawa NE Jr, et al. IKKbNF-kB activation causes severe muscle wasting in mice [J]. Cell, 2004,119 (2):285-298.

9  Sacheck JM, Ohtsuka A, McLary SC, et al. IGF-1 stimulates muscle growth by suppressing protein breakdown and expression of atrophy-related ubiquitin-ligases , atrogin-1 and MuRF1[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab,2004,287(4): E591-E601.

10  Sandri M,Sandri C, Gilbert A,et al. Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletal muscle atrophy[J]. Cell,2004,117(3):399-412.

11  McFarlane C, Plummer E, Thomas M, et al. Myostatin induces cachexia by activating the ubiquitin proteolytic system Through an NF-kB-Independent, FoxO1-Dependent Mechanism[J].J Cell Physiol,2006,209 (2):501-514.

12  Smith HJ, Mukerji P, Tisdale MJ. Attenuation of proteasome induced proteolysis in skeletal muscle by B-Hydroxy-B-Methylbutyrate in cancer-induced muscle loss[J]. Cancer Res,2005,65(1):277-283.

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袁磊 副主任医师

海军军医大学第三附属医院(东方肝胆外科医院) 肝胆外科

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