首页 我的

原创 用石蜡切片检测端粒酶RNA基因诊断与鉴别子宫颈上皮内瘤变1级与2级的意义

何春年 主任医师 河北省人民医院 病理科
2013-10-18 941人已读
何春年 主任医师
河北省人民医院

用石蜡切片检测端粒酶RNA基因诊断与鉴别子宫颈上皮内瘤变1级与2级的意义

何春年  徐明堂 荀文娟

【摘要】  目的 探讨在石蜡切片上用FISH技术检测TERC基因对诊断鉴别诊断CIN1级与CIN2级的实用意义。方法 选取手术切除及活检的子宫颈组织,有效样本137例,其中正常宫颈鳞状上皮20例, CIN1级组织46例,CIN2级组织49例,HE染色难以确定CIN1/CIN2级组织22例。采用FISH技术在石蜡包埋组织上检测TERC基因拷贝数增加的情况。 结果 正常宫颈鳞状上皮中无TERC基因拷贝数的增加,CIN1级组中TERC基因扩增率15.2%(7/46),CIN2级组中TERC基因扩增率47%(23/49),并且出现大量的三倍体、四倍体及非整倍体扩增,两组之间差异具有统计学意义(p<0.05)。CIN1/CIN2级组中TERC基因扩增率27.8%(5/22)。组间两两比较:正常宫颈鳞状上皮组与CIN1级组组间比较差异无统计学意义(p>0.05);正常宫颈鳞状上皮组与CIN2级组组间比较差异有统计学意义(p<0.05);CIN1级组与CIN2级组组间比较差异有统计学意义(p<0.05)。TERC 基因扩增在鉴别CIN 1级与CIN 2级中的敏感度为46.9%,特异度为84.7%,准确度为65.0%,阳性预测值为 76.6%,阴性预测值为60%。结论 当组织学上鉴别CIN1级与CIN2级有困难时,在石蜡包埋组织切片上应用FISH技术检测TERC基因,发现拷贝数增加可有助于CIN2级的确诊,也预测其有恶性进展的风险;反而无TERC基因异常,可确认为CIN1级,无恶性进展风险。TERC基因检测具有实用价值及应用前景。河北省人民医院病理科何春年

【关键词】  子宫颈上皮内瘤变;FISH检测;TERC基因;基因拷贝数

Detection of TERC gene amplification in differential diagnosis between CIN1 and CIN2 onno Paraffin-Embedded Tissues  HE Chun-nian *,XU Ming-tang, XUN Wen-juan. Department of Pathology, Hebei General Hospital Shijiazhuang 050051, China

Corresponding author: HE Chun-nian(E-mail:hechn2@163.com)

[ABSTRACT] Object  To study practical significance of the detection of TERC gene amplification by FISH in the CIN1 and CIN2 tissue microarray. Method  Select the 137 cases of cervical tissue samples, which 20 cases of normal cervical squamous epithelium, 46 cases of CIN11, 49 cases of CIN2 and 22 cases of CIN1/CIN2. With FISH method detected TERC gene amplification. Result  TERC gene have no amplification in the normal cervical squamous epithelium. TERC gene amplification increased by 15.2% (7/46) in the CIN1, by 47% (23/ 49) in the CIN 2, by 27.8% (5/22) in CIN1/CIN2. There were significant differences between any two

                                       

作者单位:050051 石家庄,河北省人民医院病理科(何春年、徐明堂、荀文娟)  

通讯作者:何春年(E-mail:hechn2@163.com  Tel:0311-85988639).

基金项目:河北省自然科学基金项目:H2012307001.

groups (p<0.05). normal cervical squamous group and CIN1 level group difference was not statistically significant (p>0.05); groups of normal cervical squamous epithelial groups with CIN2 level of group difference was not statistically significant (p<0.05); the CIN1 level group CIN2-level group group difference was statistically significant (p <0.05).TERC gene amplification in the identification of CIN 1 lesions with CIN 2 lesions were sensitivity 46.9%and specificity 84.7%and accuracy of 65.0%and a positive predictive value of 76.6% and negative predictive value of 60%. Sensitivity of the TERC gene amplification was 62.26%, the specificity was 92%, the accuracy was 71.79%,the positive predictive value and negative predictive values were 94.29% and 53.49% . Conclusions  The method is feasible and reliable results, in application of FISH detection TERC gene amplification on CIN1-2 paraffin section. It is a expansion to detected TERC gene amplification on histologic paraffin section. The having theoretical significance and practical value in TERC gene amplification could be as a differential diagnosis between CINⅠand CINⅡ, as well as estimating the development of CIN to a cervical cancer.

Key words  CIN; FISH; TERC-gene; Gene amplification;

由于HPV的传播及诊断技术的提高,子宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)的发病率有上升趋势。CIN发展为宫颈癌是一个长期的过程,早期诊断和恰当的治疗完全可能阻止其发展为宫颈癌,并彻底治愈。就妇科临床治疗而言,CIN1级可随访观察,而CIN2级则需要锥切等手术治疗,故正确诊断CINⅠ级与CINⅡ级对临床治疗的指导意义是显而易见的。然而病理学诊断是形态学的方法,有时因人为因素的影响及病变不典型等因素很难将CINⅠ级与CINⅡ级准确地鉴别出来,一些病例导致治疗过度或治疗不足。因此迫切需要一种敏感、准确、稳定及可靠的方法或指标来辅助病理学诊断。有研究表明3号染色体长臂拷贝数增加尤其是TERC基因的拷贝数增加在细胞学上鉴别宫颈高度癌前病变与低度癌前病变的敏感性及特异性均在90%以上[1],推断检测TERC基因的拷贝数增加有助于CIN1级与CIN2级的正确诊断。我们前期在组织切片上对子宫颈癌和CIN的TERC

基因检测的研究有相近的结论[2,3]。本研究在宫颈组织石蜡切片上,采用FISH技术检测TERC基因,探讨其在CIN1级与CIN2级组织中的拷贝数变化情况,对其诊断分级、鉴别诊断的作用,预测恶性进展风险及其临床病理的实用价值。

                               材料与方法

1. 一般资料:  选取河北省人民医院2011年8月~2012年8月间手术切除或活检子宫颈标本150例,组织用中性缓冲福尔马林液固定,石蜡包埋;得到137例有效样本,进行FISH检测。其中正常对照宫颈鳞状上皮20例,取自因子宫平滑肌瘤或子宫腺肌症而切除的标本,经光镜下证实鳞状上皮无异常者,年龄25岁~54岁,平均年龄42岁; CIN1级46例,年龄23岁~60岁,平均年龄41.5岁;CIN2级49例,年龄24岁~58岁,平均年龄41岁;CIN1/CIN2级22例,年龄25岁~56岁,平均年龄40岁。全部标本首先由高年资病理医师分析筛选,分类。最后利用十人共览显微镜对所有标本进行联合复诊,将分类最终统一的标本纳入研究样本。这样复核的意义在于避免因主观因素的影响而导致的分级不准确。

2.CIN1级与CIN2级病理学诊断标准

CIN1级:鳞状上皮棘细胞层下1/3区域细胞核异型,罕见核分裂象,上2/3区域轻度异型,有成熟现象。CIN2级:鳞状上皮棘细胞层的上层、下层细胞异型均明显,核分裂象一般限于上皮下2/3区域以下,上皮上1/2有成熟现象[4]。?

3. 探针及FISH检测方法:

3.1探针:hTERC/CSP3 DNA双色荧光探针由北京金菩嘉医疗科技公司提供。hTERC DNA 探针杂交到 3 号染色体长臂(q26.3),荧光信号为橘红色 (Rhodamine);CSP3 DNA探针杂交到3号染色体着丝粒 (3p11.1~q11.1),荧光信号为亮绿色 (FITC)。

3.2石蜡切片预处理:切取4μm厚的切片,置于65℃烤箱烤蜡(过夜);新鲜二甲苯脱蜡10min×2,随后100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、85%乙醇、70%乙醇中各2 min,复水后浸入去离子水中3 min;90℃的蒸馏水处理30分钟;室温下蒸馏水洗片5min×2;置于0.4%胃蛋白酶溶液中,37℃孵育20分钟;室温下2XSSC液洗片5min×2;置于室温的10%中性缓冲福尔马林液中固定5min,于室温下2XSSC液洗片5min×2,依次置于70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各2分钟脱水,室温自然干燥。

3.3 FISH操作步骤(避光环境):探针液 (7μl杂交缓冲液、1μl去离子水和 2μl探针)在(78±1)℃的水浴中变性5min;探针液置于45℃的水浴锅中;组织切片在(78±1)℃在70%甲酰胺液中变性5min后,依次置于-20℃的70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中各2分钟,梯度脱水后室温自然干燥;于 56℃烤片机上预热切片片刻后将10μl探针液滴于杂交区域,加盖盖玻片,密封置42℃湿盒中杂交过夜。次日玻片依次置于预热46℃的50%甲酰胺洗液10min×3、2×SSC溶液10min、0.1%NP-40混合溶液中5min洗涤;室温70%乙醇漂洗3min,避光自然干燥后加15μl DAPI复染液复染,立即盖上盖玻片,10~20分钟后荧光显微镜下观察。

4.FISH检测判读方法与标准

依据FISH技术检测宫颈细胞学TERC基因的方法[1,4,5],参考FISH方法乳腺癌HER2检测指南[5]等文献及探针试剂盒说明,在暗室中用OLYMPUS B×51荧光显微镜,DAPI/FIFC/TexasRed三色滤光镜激发,100x物镜下观察间期细胞,判断FISH信号;用VideoTest公司提供的FISH分析软件分析图像,评估整个切片的CSP3和TERC基因双色探针杂交情况。红色、绿色信号互为对照,淋巴细胞、基质细胞、内皮细胞的杂交互为对照。组织细胞中≥75%的细胞核显示出双色信号,视为杂交成功(图1);否则为杂交失败[6]。细胞拷贝数的确定:选择细胞核大小一致,胞核边界完整、DAPI染色均一,细胞核无重叠、红绿色信号清晰区,确定细胞内FISH信号数的最大值,超过10%-20%的细胞所出现的信号数作为细胞拷贝的指标,用这种方法,病变可分类为二倍体、四倍体和非整倍体(异倍体),再于病变的其他区域计数100-200个细胞的TERC基因的拷贝数,以验证拷贝数(倍体数)的判断。

5. 统计学处理:统计学分析采用SPSS16.0统计分析系统,以α=0.05为检验水准,当P<0.05时差异有统计学意义。样本率之间的比较采用卡方检验;多样本率之间两两比较采用卡方分割法。敏感度、特异度、准确度、阳性预测值、阴性预测值计算公式:敏感度=a/(a+c)×100%,特异度= d/(b+d)×100%,准确度= a+d/(a+b+c+d)×100%,阳性预测值为= a/(a+b)×100%,阴性预测值= d/(c+d)×100%。(a:CIN1级中拷贝数增加的例数,b:CIN2级中拷贝数增加的例数,c:CIN1级中拷贝数不增加的例数,d:CIN2级中拷贝数不增加的例数。(见表2

结   

1.FISH实验结果:荧光显微镜镜下观察:可见组织轮廓清晰,细胞核被DAPI复染呈蓝色,可见细胞核的面积差异较大;荧光信号随机分布于核染色区内,细胞核边界清楚,TERC基因探针杂交为橘红色荧光信号;CSP3(3号染色体着丝粒)探针杂交为亮绿色荧光信号,荧光信号均清晰。正常子宫颈鳞状上皮为二倍体细胞,未见TERC有异常杂交信号(出现信号数大于2) (图1);CIN1级中少部分病例出现TERC基因的异常杂交信号,主要位于中-底层(图2);而CIN2级中3倍体、4倍体、非整倍体及TERC基因的异常杂交信号明显增多,出现在中-表层(图3-4)。部分病例亦可见明显的多体信号成片融合现象(图5)。

2. TERC基因检测在CIN1-2级组织中拷贝数增加的情况:正常宫颈鳞状上皮组中TERC基因无扩增,0(0/20),CIN1级组中TERC基因扩增的情况为15.2%(7/46),CIN2级组中TERC基因扩增的情况为47%(23/49),并且出现大量的三倍体、四倍体及非整倍体扩增,两组之间差异具有统计学意义(p<0.05)。CIN1/CIN2级组TERC基因扩增的情况为27.8%(5/22)。在光镜下将其初步分级为CIN1级的病例8例,其中TERC基因扩增者1例,无扩增者7例;CIN2级的病例14例,其中扩增者4例,无扩增者10例。组间两两比较:正常宫颈鳞状上皮组与CIN1级组组间比较差异无统计学意义(p>0.05);正常宫颈鳞状上皮组与CIN2级组组间比较差异有统计学意义(p<0.05);CIN1级组与CIN2级组组间比较差异有统计学意义(p<0.05)。(表1-2)。

表1  TERC基因在CIN1与CIN2病变中拷贝数增加的比率

组别

n

TERC基因拷贝数

Χ2

P

增加

不增加

正常

20

0(0%)

20(100%)

20.927

<0.05

CIN1

46

7(15.2%)

39(84.8%)

CIN2

49

23(47.0%)

26(53.0%)

 

表2  TERC 基因扩增在CIN1 与 CIN2 级组间两两比较

组别

n

TERC基因拷贝数

Χ2

P

增加

不增加

正常

20

0(0%)

20(100%)

0.092

>0.05

CIN1

46

7(15.2%)

39(84.8%)

CIN1

46

7(15.2%)

39(84.8%)

11.05

<0.05

CIN2

49

23(47.0%)

26(53.0%)

正常

20

0(0%)

20(100%)

14.08

<0.05

CIN2

49

23(47.0%)

26(53.0%)

 

3. 经公式计算其TERC 基因扩增在鉴别CIN 1级病变与CIN 2级病变中敏感度为46.9%,特异度为84.7%,准确度为65.0%,阳性预测值为 76.6%,阴性预测值为60%。(表3)。

表3  TERC 基因扩增在 CIN1 and CIN2 级的特异性

 

宫颈病变

CIN2

CIN1

合计

TERC基因拷贝数

增加

23 (a)

7(b)

30(a+b)

不增加

26(c)

39(d)

65(c+d)

合计

49(a+c)

46(b+d)

95(a+b+c+d)

 

                                 讨 

CIN是子宫颈癌的一组癌前病变,其发生发展是一个连续的过程。目前病理组织学诊断CIN尤其是CIN1级或CIN2级,有时难以做出明确诊断。但绝大多数的CIN1级会转归正常,只有15%的病灶会继续进展,最后甚至演变成浸润癌[5,6]。而CIN2级进展为浸润癌的比率则大大增加,因此,如能早期发现CIN2级和正确鉴别CIN1级与CIN2级,是早期防治子宫颈癌前病变的关键。

现代遗传学及分子生物学研究表明,人类大多数肿瘤细胞表现为染色体不稳定性;TERC基因的上调可以维持端粒的长度,使肿瘤细胞能够突破正常的增殖限度,逃避细胞凋亡,从而导致恶性肿瘤的发生[7-9]。 宫颈癌是由CIN发展而来,除了高危型HPV感染和整合因素外[10]可加文献(已经增加),基因的改变亦有重要作用。Kloth?(此文献有误)[11]发现CIN及宫颈癌中,常见3号染色体长臂的扩增,并且异常基因多位于3q26.1-3q28,并把3q的增加部位定位于3q26的TERC基因。2003年,Heselme yer[1]首次采用FISH技术检测子宫颈细胞中TERC基因,发现极少正常及CIN1级细胞中可检测到TERC基因拷贝数增加,阳性率为7.14%,而在CIN2级细胞中TERC基因拷贝数增加阳性率为62.5%,并且在CIN1级与CIN2级间比较,二者有统计学意义。我们前期工作及本次研究在石蜡包埋组织切片上用FISH方法检测TERC基因[2,3],同样发现TERC基因是参与宫颈癌发生、发展的重要基因,其拷贝数增加可能是宫颈癌变的早期分子事件。在正常子宫颈鳞状上皮中TERC基因无拷贝数增加,在CIN1级中仅有少量扩增(14.8%),而CIN2级中扩增明显增多(67%),并且出现三倍体、四倍体及多倍体,二者比较差异具有显著的统计学意义。在鉴别与诊断CIN1级与CIN2级时有明显的临床实用价值。其特异度、阳性预测值及准确度均较高,对于CIN恶性进展具有预测价值。对于CIN1与CIN2级鉴别困难的病例,发现TERC基因扩增的将其诊断为CIN2;而无TERC基因扩增的诊断为CIN1级,找到了基因水平的依据。

妇科临床上对CIN2级及以上病变采取锥切等手术治疗,而对CIN1级病变采取定期随访或电烧灼等保守治疗。通过FISH 技术检测TERC基因,对有争议的CIN2级病例进行了更准确地诊断,以确保临床正确、适度地治疗,具有很大的实用意义。综上所述,TERC基因检测能有效的弥补形态学诊断CIN1级及CIN2级病变的不足,尤其是对CIN2级病变的确诊与鉴别,有临床实用意义及应用价值。

目前TERC基因检测成本较高,尚达不到在CIN组织学切片上普遍应用的程度,对于明确诊断的病例,不需要做TERC基因的检测,仅一部分诊断有困难的病例,尤其是CIN1级与CIN2级鉴别困难时,为指导临床治疗或预测风险,可检测TERC基因辅助诊断与鉴别。随着FISH检测TERC基因成本的降低,该技术将被广泛普及。

 

参考文献:

[1]      Heselmeyer-Haddad K, Janz V, Castle PE, et al. Detection of genomic amplification of the human telomerase gene(TERC) in cytologic specimens as a genetic test for the Diagnosis of cervical dysplasia. Am J Pathol,2003,163(4):1405-1416.

[2]  袁艳龙,何春年,徐明堂,等.应用荧光原位杂交技术在组织标本中检测宫颈上皮病变的端粒酶RNA基因扩增.中华病理学杂志,2011,40(3):182-186.

[3]  He C, Xu C, Xu M,etal. Genomic amplification of hTERC in paraffin-embedded tissues of cervical intraepithelial neoplasia and invasive cancer. Int J Gynecol Pathol. 2012 ,31(3):280-5.

[4] 中华医学会,临床诊疗指南病理学分册,人民卫生出版社,2009,1

[5] AHN Hopman, W Theelen, PPH Hommelberg, et al.Genomic integration of oncogenic HPV and gain of the human telomerase gene TERC at 3q26 are strongly associated events in the progression of uterine cervical dysp lasia to invasive cancer J Pathol, 2006, 210 (4) : 412

[6]  Shingleton HM, Patrick RL, JohnstonWW, et al.The current status of the Papanicolaou smear 〔J〕CA Cancer J Clin 1995, 45: 305

[7]  Ju Z,Rudolph KL.Telomeres and telomerase in stem cells duringaging anddisease[J].GenomeOyn,2006(1):84-103.

[8]   Nowak T,Januszkiewicz D,Zawada M,et al.Amplification of hTERT and hTERC genes in leukemic cells with high expressionand activity of telomerase[J].Oncol Rep.2006,16(2):301-305.

[9]   Royle NJ,Mrndez-Berm6dez A,Gravani A,et a1.The role of recom—bination in telomere length mainten ce[J].Biochem Soc Trans,2009,37(pt 3):589-595.

[10]  徐明堂,何春年,许长田等.宫颈鳞状上皮病变中乳头状瘤病毒16/18存在状态的研究[J].中华病理学杂志,2013,42(6):400-401.

[110]  He H, Xia HH,Wang JD,et al. nhibition of human telomerase reverse transcriptase by nonsteroidal anti-inflammatory drugs in colon arcinoma.Cancer,2006,106(6):1243-1249.

图1  正常子宫颈鳞状上皮:信号清晰,细胞核 DAPI染蓝色, TERC 基因为橘红色信号;CSP3为亮绿色信号. ×2000

图2  在CIN1级 TERC 无扩增;仅一个细胞为三倍体. ×2000

图3   在 CIN2 级TERC基因扩增明显:可见三倍体,四倍体及多倍体. ×2000

图4  在 CIN2 级TERC 扩增的多倍体.×2000

图5  在 CIN1/CIN2 级TERC扩增阳性病例的三倍体,三倍体和多倍体.×2000

有帮助
期待更新

何春年 主任医师

河北省人民医院 病理科

问医生 去挂号

更多文章

用石蜡切片检测端粒... 的相关咨询
由于相关规范,IOS用户暂不可在小程序订阅