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何广胜 三甲
何广胜 主任医师
江苏省人民医院 血液内科

骨髓增生异常综合征病态造血的流式细胞术检测

WHO关于骨髓增生异常综合征MDS)的病态造血评价及形态学分型成为MDS的分型、预后很有效的工具,结合骨髓显著病态造血和典型的细胞遗传学改变多可以确定MDS的诊断。但同时满足这两个条件的,多数为高危组进展期患者,当细胞遗传学不能提供足够信息,MDS诊断常仅仅依靠形态学。江苏省人民医院血液内科何广胜

但有时骨髓细胞形态学异常并不只出现MDS中,还有一些MDS亚型,如环状铁粒幼细胞性贫血、低增生性MDS和伴有骨髓纤维化的MDS,以及骨髓涂片标本的技术和质量不过关,形态学评估也很难提供足够的MDS诊断信息。流式细胞术对MDS的免疫表型的分析,常常能提供丰富的信息[1]

1 应用流式细胞术(FCM) 免疫分型来诊断MDS的基本要求

为了使FCM能够应用于临床,它的分析方法必须基于一些具有特异性和敏感性的数据,这些数据需要能在不同的操作者间具有可重复性,且结果易于被临床医生理解。

FCM是判断血液肿瘤存在的一个敏感指标,同时也可以为排除血液肿瘤提供协助。FCM通过检测抗原表达改变,发现那些形态学检查见不到的骨髓细胞异常分化,因此,免疫表型检查也许能在缺乏明显的形态病态造血和原始细胞增多的情况下有助于确诊MDS。

目前FCM用于MDS的诊断的还有一些挑战[2]。首先,没有证据表明单一的免疫表型参数被证明能够用来区别MDS和其他病理情况,而且在不同实验室之间,使用哪个FCM参数诊断MDS最为合适也尚无共识。其次,由于特殊标记使用的局限性,使用FCM评估红系病态造血(MDS形态学诊断的里程碑)也十分困难。最后,已发表的研究主要是对于流式细胞术变量的定性分析,而受试患者群体的组成成分也各不相同,从而限制了FCM在MDS诊断上的广泛应用。

2 FCMMDS髓系病态造血的评价

据WHO病态造血的定义,约60%MDS存在髓系病态造血,主要包括假性Pelger-Huet异常、无颗粒/少颗粒的中性粒细胞,不成熟粒细胞增多。相应FCM参数常表现为侧散射角(side scatter, SSC)和前散射(forward scatter, FSC)异常。

MDS干细胞自我更新和分化能力的缺陷导致了粒细胞上各种抗原的表达异常。粒细胞抗原的表达异常,比如单个细胞群或系列细胞上淋巴细胞抗原表达和髓系抗原的变异,单核细胞也有表型异常[3]

MDS中低表达CD16或者CD16和CD11b均低表达的粒细胞所占比例增高。成熟过程中,髓系细胞逐渐发育成中幼粒细胞和晚幼粒细胞,同时表达的CD16逐渐增多而CD13逐渐减少,在杆状核阶段达CD13中等水平的表达,分叶核中性粒细胞再达高水平[4]。CD13/CD16成熟模式异常显示出中幼粒细胞和晚幼粒细胞增多,而CD13+CD16+中性粒细胞减少[4]

还有一些抗原,如CD64,CD10和CD56也在MDS粒细胞上的异常表达。淋系抗原,如CD2,CD5,CD7和CD19也会在髓系前体细胞和成熟细胞上异常表达[1]。MDS患者还有一个共同异常:成熟粒细胞上表达不成熟粒细胞的抗原,如CD11b和/或CD15[4]。最近还发现细胞内标记物,如髓细胞核分化抗原在MDS患者和对照组中的表达也存在差异[5]

就单核细胞系而言,在MDS患者中观测到的最常见异常主要是CD56,HLA-DR,CD36,CD33,CD15,CD14,CD13和CD11b表达的改变[4]

FCM测得的异常程度常跟形态学病态造血相关,但不同研究者检测的MDS患者中单系髓系异常呈高度可变。总的来说,中性粒细胞的低颗粒或无颗粒能在大多数MDS患者中(10-84%)观察到,如果一并比较中性粒细胞与淋巴细胞SSC值的话,中性粒细胞的低颗粒或无颗粒情况就有很强的可重复性[4]

尽管研究间的差异较大,但MDS中发现异常的CD11b/CD16以及CD13/CD16表达还是相当高(23-78%)。而中性粒细胞异常表达CD64,CD10,CD56和其他抗原比例不高,变异度也大,有不足5%,也有高达66%[4]

研究表明,与单核系抗原比较,髓系抗原异常表达发生频率更高,在判定骨髓病态造血上更具说服力。约30~40%非克隆性血细胞减少患者有单一髓系免疫表型异常的情况,所以单一的髓系免疫表型异常并不是诊断MDS的确切证据。通过多参数评估髓系和单核系细胞成熟和抗原表达模式有助于在绝大多数的MDS中识别出两种甚至更多的异常情况[4]

FCM对MDS髓系抗原评价缺点是对这些参数的评估缺乏一个标准的,可重复的程序。由于实验结果数据描述非常困难,要进行定量分析也几乎不可能,从而使得正常参考值的确定也变得非常复杂。除极个别情况外,在与MDS诊断相关的FCM实验中,还没有可用的重复性数据。

检测抗原阳性髓系细胞百分比是一种定量方法(FCM检测的结果用数字来表示),至少在实验室检测中被证明有可重复性。然而,用来区分阳性和阴性群体阈值的定义,在大多数情况下却还是没有固定标准,这种方法仍然局限。

另一种FCM变量的定量方式分析方法是平均荧光强度(MFI),测量标志的MFI和细胞平均自体荧光的比率。荧光比率取决于细胞表达的测试标志的百分比以及表达的强度,这在诊断MDS是很重要的,尤其是当特定的髓系细胞标志呈典型的异质性表现[4]。MFI评价MDS髓系抗原有很好的可重复性。

MDS的髓系病态造血程度与疾病严重程度及预后相关的,比如RCUD与RCMD,差别很大。FCM能够敏感地反应髓系病态造血情况,在此亦很有参考价值。在低增生性MDS,骨髓纤维化或标本采集不当时,FCM有助于在对骨髓病态造血的检出,骨髓标本质量优劣对免疫表型分析的影响不如对形态学那么明显。

3 FCM对红系病态造血的评估

由于免疫指标有限,以免疫表型评价红系的病态造血存在困难,但是评价内胞浆铁代谢相关蛋白,MDS红系显示出“铁超负荷”,表现为铁蛋白含量增加而转铁蛋白受体(CD71)下降,这一变化与红系的病态紧密相关联[6]

红系祖细胞的特点是CD45减少或缺失以及低SSC。然而,在成熟(无核)红细胞,细胞碎片,以及非造血细胞中也可能出现这样表现。

从嗜碱性粒红系祖细胞向正色性幼红细胞分化的早期就能观察到血型糖蛋白A(GlyA)增高。CD71是红系成熟阶段早期即表达的抗原之一(早于血型糖蛋白A表达),并在网织红细胞去核后仍表达,直至RNA丢失后才消失。

理论上来说,应以CD71的表达“设门”(gate)红系祖细胞,GlyA+则可以把更早阶段的红系祖细胞排除出来。在MDS中,这群细胞也常常增多。但是在MDS中,CD71表达的调节存在异常,而GlyA在不同个体间强度变化的变异系数很小,所以设定MDS的红系前体细胞应优先采用GlyA。

MDS的红系检测可以采用不经洗涤的细胞溶解法,更简单,也更易应用。

免疫表型异常的红系前体细胞(红系祖细胞)在大多数MDS中均能发现,有报道高达77%,但其主要依据的是红细胞前体(红系祖细胞)表达CD71和GlyA的不一致性。

检测红系细胞铁代谢相关蛋白是克服FCM检测红系病态造血特殊标志局限的有效办法。在细胞水平,带有H和L亚基的铁蛋白在调节细胞内铁稳态中发挥了关键作用。转铁蛋白受体CD71在细胞摄取吸收铁是是不可或缺的。

在MDS中红细胞表现出的铁超负荷的特点是铁蛋白含量的增加(尤其是H亚基)以及转铁蛋白受体表达减少[7]。更值得关注的是,H亚基和CD71的表达两者都反应了由形态学病态造血的程度[7]。此外,红细胞培养模型中H铁蛋白的诱导发生在分化的早期阶段,证明了与骨髓增生异常表型有很强的联系[7]

铁粒幼细胞贫血中红系前体细胞存在线粒体铁的累积。在环状铁粒幼细胞的在核周线粒体沉淀的铁以一种特殊形式的铁蛋白存在,称为线粒体铁蛋白(mitochondrial ferritin,MtF)[8],这可能成为环状铁粒幼细胞贫血的FCM诊断标志。

4 FCM评估原始细胞和CD34阳性细胞

MDS是起源于干细胞的克隆性疾病,因此,CD34细胞相关的参数,如CD34+髓系原始细胞增高,CD34+B祖细胞下降,干细胞和后期髓系抗原共表达、淋系抗原表达、CD45异常表达均很有意义。

造血前体细胞(原始细胞)在形态学上定义为染色质不浓缩,核仁明显,核/浆比低,细胞质颗粒减少/无。

由于流式细胞术的自身和技术的限制,FCM不适用于MDS原始细胞的计数。MDS骨髓中原始细胞常常病不显著增多,而且也缺乏MDS原始细胞的特异性标志,这是FCM计数MDS原始细胞存在一定困难,且可靠性差[3]。比如在低增生骨髓中,原始单核细胞与成熟的单核细胞以FCM鉴别都不能够。表达CD34的是原始细胞,但不是所有原始细胞都表达CD34。所以在WHO的MDS分型中,不推荐以FCM计数形态可见的原始细胞[3]

MDS克隆转化源于CD34+髓系细胞,CD34细胞群存在特殊的表型紊乱,这是诊断MDS的很好指标。MDS髓系原始细胞表型是CD34+CD38+HLA-DR+CD13+CD33+,与正常人和非克隆性血细胞减少患者比较,低危组MDSCD34细胞的B细胞系相关基因表达显著下降,综合各文献报道,约40-70%的MDS存在CD34+B祖细胞下降,而其他的非克隆性患者约20-40%有此现象[4]。B祖细胞高表达CD38,MDS的CD34+CD38+B祖细胞数量下降,而且CD38平均荧光以降低,在高危组MDS此异常更加显著,可能与高危组MDS有更多的CD34+CD38-原始细胞有关[4]

MDS的CD34细胞其他异常包括:干细胞和后期髓系抗原(CD117、CD15和CD11b)或者淋系抗原(CD2、CD5、CD7、CD19和CD56)异常表达。但是由于淋巴细胞与髓系祖细胞的CD45比率因各检测者的设置而异,要确保同一份标本的这些数值在不同实验室间的可重复性很难。

CD34+细胞、CD34+B祖细胞和髓系原始细CD45的表达比率的检测者间变异度小,再合用粒细胞SSC(侧向角)评价,MDS诊断的敏感度达30-70%,而特异性达到90%[9]

在一些形态学没有显著病态造血(仅有环状铁粒幼细胞增多或染色体异常者),或者合并骨髓低增生、骨髓纤维化的情况者,即使骨髓标本存在外周血稀释情况,FCM技术也能通过对CD34细胞参数的评价为诊断提供有力指导。

展望

近来欧洲建议低危组MDS的FCM诊断参数如下表1[10],当积分达到2即可以考虑MDS的诊断,研究还发现这些参数与多系病态造血(P=0.001),输血依赖(P=0.02)和不良预后的细胞遗传学(P=0.04)密切相关,敏感性和特异性分别为69%和92%。

相信随着对MDS本质的深入研究和FCM技术开展,FCM在MDS的诊断,尤其是低危组、特征不显著的MDS中会发挥越来越重要作用。

低危组MDSFCM诊断标准

参数

截止值

回归系数

积分

髓系原始细胞比例(%)*

≥2

2.59

1

B祖细胞比例(%)**

≤5

1.87

1

淋巴细胞对髓系原始细胞的CD45表达比

≤4或≥7.5

1.76

1

中性粒细胞对淋巴细胞的侧向角比

≤6

31

1

*计数所有有核细胞; **计数 CD34+细胞

 

参考文献

1.  Porwit A. Role of flow cytometry in diagnostics of myelodysplastic syndromes—beyond the WHO 2008 classification. Seminars in Diagnostic Pathology (2011) 28, 273-282.

2.  van de Loosdrecht AA, Alhan C, Bene MC, et al. Standardization of flow cytometry in myelodysplastic syndromes: Report from the first European LeukemiaNet working conference on flow cytometry in myelodysplastic syndromes. Haematologica 2009;94:1124–1134.

3.  何广胜 吴德沛 孙爱宁等(专论).WHO2008年骨髓增生异常综合征诊断与分型的修订. 中国实用内科杂志,2010; 30; 398-403.

4.  Della Porta MG, Lanza F, Del Vecchio L; Italian Society of Cytometry (GIC).  Flow cytometry immunophenotyping for the evaluation of bone marrow dysplasia.. Cytometry B Clin Cytom. 2011 Jul-Aug;80(4):201-11.

5.  McClintock-Treep SA, Briggs RC, Shults KE, et al. Quantitative assessment of myeloid nuclear differentiation antigen distinguishes myelodysplastic syndrome from normal bone marrow. Am J Clin Pathol 2011;135:380–385.

6.  Cazzola M, Della Porta MG, Malcovati L. Clinical relevance of anemia and transfusion iron overload in myelodysplastic syndromes. Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2008:166–175.

7.  Della Porta MG, Malcovati L, Invernizzi R, Travaglino E, Pascutto C, Maffioli M, Galli A, Boggi S, Pietra D, Vanelli L, and others. Flow cytometry evaluation of erythroid dysplasia in patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia 2006;20:549–555.

8.  Cazzola M, Invernizzi R, Bergamaschi G, Levi S, Corsi B, Travaglino E, Rolandi V, Biasiotto G, Drysdale J, Arosio P. Mitochondrial ferritin expression in erythroid cells from patients with sideroblastic anemia. Blood 2003;101:1996–2000.

9.  Ogata K, Della Porta MG, Malcovati L, Picone C, Yokose N, Matsuda A, Yamashita T, Tamura H, Tsukada J, Dan K. Diagnostic utility of flow cytometry in low-grade myelodysplastic syndromes: A prospective validation study. Haematologica 2009;94:1066–1074.

10. Della Porta MG, Picone C, Pascutto C, et al. Multicenter validation of a reproducible flow cytometric score for the diagnosis of low-grade myelodysplastic syndromes: results of a European LeukemiaNET study. Haematologica 2012;97:1209–1217.

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