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揭盛华 三甲
揭盛华 主任医师
武汉协和医院 感染科

如何正确看待自身免疫抗体

       自身免疫性肝病(ALD)是一组免疫介导的肝脏损伤,根据其临床表现、生化、免疫学、影像学和组织病理学特点,可简单分为以肝炎为主型,即自身免疫性肝炎(AIH)和以胆系损害及胆汁淤积为主型,即原发性胆汁性肝硬化(PBC)、原发性硬化性胆管炎(PSC)。此外,还有这三种疾病中任意两者之间的重叠综合征(overlap syndromes),主要以AIH-PBC重叠综合征多见。由于我国肝炎和肝硬化多因肝炎病毒,尤其是乙型肝炎病毒引起,故过去认为ALD较少见。但近年来由于临床经验的累积以及实验室诊断技术的发展,使得ALD检出率升高。由于本组疾病病因和发病机制尚未完全阐明,目前亦尚无治愈性药物,因此是导致肝功能衰竭的重要病因。在病程早期, ALD临床症状并不明显,主要根据生化、免疫学、影像学和组织病理学特点进行综合诊断。血清自身抗体对于自身免疫性肝病的诊断和鉴别诊断至关重要,本文对自身免疫性肝病中自身抗体的检测进展及其诊断价值进行综述。华中科技大学同济医学院附属协和医院感染科揭盛华

    一、自身免疫性肝炎

    AIH是一种由于失去对肝细胞的免疫耐受,长期对肝细胞产生免疫介导损伤的慢性疾病。临床上以波动性黄疽、高γ- 球蛋白血症、循环中存在自身抗体及女性易患为特点。持续存在的肝实质损害易进展为肝硬化,病死率较高。但免疫抑制剂治疗AIH有效,故早期诊断十分重要。根据血清自身抗体谱把AIH分成三个血清亚型。I型AIH即经典型,最为常见,约占全部AIH的60%~80%。抗核抗体(ANA)、抗平滑肌抗体(SMA)、抗肝细胞膜抗体(LMA)或核周型抗中性粒细胞胞浆抗体(pANCA)阳性为其特征。II型AIH主要发生于儿童,以抗肝肾微粒体I型抗体(LKM-1)或抗肝细胞胞浆I型抗体 (LC-1)阳性为特征。III型AIH是最不确定的类型,以抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(SLA/LP)阳性为特征。

    (一)抗核抗体(ANA) ANA是AIH患者血清中最先被发现的自身抗体,至今仍是诊断AIH敏感性最高的标志性抗体匡。它是细胞内所有核抗原成分的自身抗体总称,其靶抗原包括细胞核、细胞浆、细胞骨架和细胞分裂周期蛋白等。虽然ANA是I型AIH的血清学标志(约75%I型AIH患者为阳性)但它不具有疾病特异性。在慢性病毒性肝炎,其他自身免疫性疾病甚至健康老年人群中亦可有阳性表现。但AIH 时ANA效价一般较高,通常超过1:160间接免疫荧光法)。用间接免疫荧光法检查ANA时有以下几种荧光模式:抗脱氧核糖核蛋白,免疫荧光为均质型;抗可提取核蛋白为颗粒型;抗核仁杭体为核仁型;抗脱氧核糖核酸抗体为核膜型;抗组蛋白抗体为均质型。ANA的荧光模式与AIH分型并无直接联系且不足以提示疾病的发展与预后。用分子生物学方法提取部分ANA靶抗原,即抗可提取的核抗原(ENA)。常规ENA 谱包括:抗双链DNA抗体(dsDNA)、抗干燥综合征抗原A抗体(SSA)、抗干燥综合症抗原B抗体(SSB)、抗核糖核蛋白抗体 (nRNP)、抗组蛋白抗体(Histones)、抗Jo-1抗体、抗Sm抗体和抗硬皮病70抗体(Scl-70)等。上述抗体有助于对ALD以及是否同时合并其他自身免疫性疾病进行诊断与鉴别诊断。

    (二)抗平滑肌抗体(SMA) AIH可出现高滴度的SMA, 其靶抗原为细胞骨架蛋白,包括微丝(F肌动蛋白和G肌动蛋白)、中间丝(波形蛋白、细胞角蛋白和结蛋白)以及微管。其中最具诊断价值的靶抗原是F肌动蛋白,与肝细胞质膜有密切关系,对I型AIH的诊断特异性优于ANA。但与ANA相同, SMA亦无器官和种属特异性,在慢性丙型肝炎、传染性单核细胞增多症等患者血清中可呈阳性表现。但I型AIH时SMA 滴度多超过1:80(间接免疫荧光法)。经免疫抑制治疗后,大多数I型AIH患者血清ANA和SMA可转阴,但抗体水平不能提示疾病预后。以间接免疫荧光法可将SMA分成三种荧光模式:索状(SMAv)、球索状(SMAvg)和管球索状(SMAvgt) 染色。其中SMAvgt结合抗微丝(MF)反应阳性SMA或抗F 肌动蛋白型SMA是诊断I型AIH的高灵敏性及特异性抗体。 8o0oI型AIH患者可同时出现SMAvgt及抗MF型SMA, 两者高度相关。与常规间接免疫荧光法相比,采用纯化抗原的 ELISA法检测F肌动蛋白,在两者特异性相似的前提下可提高I型AIH诊断的敏感性困。有学者研究发现,抗F肌动蛋白抗体阳性的I型AIH患者,其发病年龄往往偏小且治疗效果不佳。

    (三)抗肝肾微粒体抗体(LKM) 最早在1973年应用间接免疫荧光法发现,在一些由免疫介导的肝病,如II型AIH、丙型和丁型肝炎等以及药物性肝炎患者中可检测出LKM。 LKM包括三种亚型,其中LKM-1和LKM-3的靶抗原为细胞色素单氧化酶P4502D6(CYP2D6),是构成AIH患者识别线性抗原的决定簇。最近有学者发现人类白细胞抗原I类基因 (HLA-A2)限制的CYP2D6特异性CD8+T细胞,其免疫反应能力因AIH的严重程度而有所不同,并且与肝细胞的损害有关。CD8+T细胞所识别的CYP2D6上主要抗原表位位于第245~254位氨基酸残基,研究提示该序列有望成为II型 AIH免疫干预治疗的一个新热点川。总之LKM-1是II型 AIH的主要血清学特征,抗体阳性率可达90%,多出现在进展期肝病患者中,此类患者通常需进一步行免疫抑制治疗, CYP2D6对研究AIH的发病机制以及预后的判断有所帮助。

    (四)抗肝细胞胞浆I型抗体(LC-1) LC-1同样是II型 AIH的标志性自身抗体,在50%II型AIH患者中可有阳性发现,而在I型AIH或慢性丙型肝炎患者中则低得多。LC-1所识别的靶抗原是亚氨甲基转移酶一环化脱氨酶,在谷氨酸与四氢叶酸之间进行亚氨甲基转移和脱氨作用。在10%II型AIH 患者中LC-1是惟一可检测到的自身抗体,且LC-1与AIH的疾病活动度和进展有关。

    (五)抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体(SLA/LP)两者分别在1987年和1983年被发现,起初认为互不相同,直到 Wies从人肝组织中成功克隆出SLA全长DNA序列并检测出2000例各种慢性肝病患者,发现SLA是肝细胞浆内的一种不知名的可溶性蛋白,与IT相同。如今将两者合称为 SLA/LP抗体,是III型AIH的血清标志物。虽然它出现率较低,但特异性很高,几乎仅见于AIH,故而具有确诊意义。此外,SLA/LP阳性与AIH病情严重程度存在一定联系。

    (六)抗肝细胞膜抗体(LMA)和抗肝特异性蛋白抗体 (LSP)两者均为肝脏特异性自身抗体,但并非疾病特异性抗体。LMA在I型AIH活动期呈阳性,而LSP最常发生于 AIH。此外,两者均可在PBC、急性病毒性肝炎、慢性乙型肝炎中有阳性表现。

    (七)核周型抗中性粒细胞胞浆抗体(pANCA)抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是一组与中性粒细胞反应的异源性自身抗体。自1985年首次发现后,ANCA就成为诊断和观察治疗系统性血管炎(如Wegner's肉芽肿、多发性动脉炎等)极有价值的血清学标志物。根据免疫荧光可分为胞浆型ANCA (cANCA)和核周型ANCA(pANCA)。近年来,在ALD中发现其ANCA类似于pANCA却又带有胞浆荧光,称之为非典型性pANCA o它在I型AIH中的阳性率为40%~96%,而在II型AIH中则几乎为阴性。有60%~92%。PSC亦可检测出该抗体,而在PBC患者中仅为0-39%。此外pANCA还可见于60%~87%的溃疡性结肠炎,5%~25%的克罗恩病和其他疾病。

    (八)抗去唾液酸糖蛋白受体抗体(ASGPR) ASGPR是肝脏特异性的内吞受体,位于肝细胞膜上,是与AIH密切相关的肝特异性膜脂蛋白的组成成分之一。其疾病特异性较好,可见于各型AIH且很少存在于其他肝病或肝外自身免疫性疾病。该抗体的效价随AIH活动度变化。ASGPR阳性或高效价时提示疾病处于活动期,治疗好转后抗体水平可下降甚至转阴,因而对观察疗效和评价病情有重要价值。

    (九)抗谷胧甘肤硫转移酶抗体(GSTA1-1) Kato等研究发现,抗GSTA1-I抗体也是AIH的一个自身抗体,在AIH 中的阳性率为16%。虽然阳性率低,但阳性患者临床表现往往较重。

    (十)抗异质性核糖核蛋白A2/B1(hnRNP A2/B1)抗体 Hugnet等应用蛋白质组学技术发现了I型AIH的一个新抗原,即hnRNP A2/B1。其抗体阳性可为诊断I型AIH提供更多依据。

    二、原发性胆汁性肝硬化(PBC)PBC是一种病因不明的慢性进行性胆汁淤积性肝脏疾病。本病多见于中年妇女,临床上出现伴或不伴黄疽的疹痒。常规应用血清学筛查可在出现症状前发现。大多数病例可通过升高的碱性磷酸酶(ALP)和血清抗线粒体抗体(AMA)阳性确诊。而抗线粒体2型抗体 (AMA-M2)对本病有确诊意义。PBC的自然演变史是一个缓慢的伴有肝损害、肝纤维化、肝硬化及其并发症的进行性胆汁淤积过程。

    (一)抗线粒体抗体(AMA)和抗线粒体2型抗体(AMA- M2)高效价AMA,尤其是AMA-M2是诊断PBC的重要依据,其敏感性大于90%,特异性达98%。线粒体上有多种抗原成分,根据AMA的靶抗原在线粒体内膜或外膜上的位置及对胰蛋白酶的敏感性和电泳特征,将其分为9型(M1-M9)。而 PBC患者的AMA主要识别线粒体的M2抗原组分。M2抗原决定簇为线粒体上2-氧酸脱氢酶复合体的一些成分,包括丙酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(PDC-E2)、支链二酮酸脱氢酶复合体E2亚单位(BCOADC-E2)、2-酮戊二酸脱氢酶复合体E2亚单位(OGDC-E2)以及二氢硫辛酞胺脱氢酶结合蛋白(E3BP),其中PDC-E2是其最主要的自身抗原。虽然AMA在大部分PBC患者中未出现临床表现、肝功能异常及肝组织学改变之前就可被检测到,但其效价和分型并不与PBC的严重程度及病情发展有关。大约5%~100oPBC患者即使用目前最敏感的检测手段亦无法检出AMA,即AMA阴性PBC,但与阳性 PBC患者相比,两者在临床表现、生化指标、组织学特征、预后以及对熊去氧胆酸的治疗反应上均一致。PBC患者之间的 AMA效价可有200倍的差异,但单就同一患者而言,其AMA 效价应是稳定的。通过Western印迹法可检出AMA的具体分型,但其分型与肝病的分期、临床表现、生化指标、组织学、免疫特征或Mayo危险积分并无直接联系。虽然未经证实,但有学者认为针对BCOADC-E2的IgA抗体可能是预测肝脏组织学恶化的指标。而经熊去氧胆酸治疗后,血清中针对丙酮酸脱氢酶的IgA抗体水平有所下降。最近研究发现,若 PBC患者的AMA为1gG3,则可能较其他患者更易发生肝硬化,AMA IgG3效价与Mayo危险积分有密切联系。尽管 PBC中AMA的分型及阳性率与患者性别无关,但通常男性患者发现较晚,确诊时疾病多已处于进展期。

    (二)抗核抗体(ANA)除AMA外,ANA同样是一个重要抗体,在PBC患者中的阳性率为50%,尤其当AMA阴性时可作为其诊断的一个重要指标。近来,越来越多学者认为 ANA与PBC严重程度相关,可成为判断预后的指标。PBC 中ANA的常见荧光模式为多核点型、核周型和抗着丝粒型。

    1.核点型ANA:其靶抗原主要包括SP100、早幼粒细胞性白血病抗原(PMI)以及微小泛素相关修饰因子(SUMO)。 SP100为可溶性酸性磷酸化核蛋白,相对分子质量为100000。抗SP100抗体在PBC患者中的阳性率约为30%,而在其他自身免疫性或风湿性疾病中的出现率仅3%,因此是PBC的特异性抗体。但近来许多研究发现,抗SP100抗体在非PBC患者中的阳性率高于以往报道,特别是在系统性红斑狼疮的患者中,故对其在PBC诊断中的高特异性表示怀疑。但这些研究同时发现,抗SP100抗体阳性者发生肝硬化和高胆红素血症的可能性要高于阴性者,且病情进展迅速。

    PML蛋白为细胞转化和生长的抑制蛋白,异常表达于早幼粒细胞白血病细胞中。抗PMI抗体最先在PBC患者中发现,也可见于其他自身免疫性疾病,但其阳性率明显低于PBC。同时在正常人群中为阴性。以免疫荧光法分析过度表达的 PMI细胞,发现抗PMI抗体主要出现在抗SPI00抗体阳性的患者中,两者具有相同的敏感性和特异性,阳性患者往往病情进展快,预后不佳。 SUMO是近来在PBC中发现的一种新抗原成分,它可共价结合SP100和PMI。其中抗SUMO-1抗体和SUMO-2抗体可出现在抗核点型ANA抗体阳性的PBC患者中,两者的检出率分别为15%和42%,在阴性的PBC患者中则检测不出。

    2.核周型ANA:核周型ANA也是PBC的一个特异性血清学标志,其靶抗原为核孔复合物和核膜。其中,核孔复合物主要包括gp210和p62。核孔膜糖蛋白(gp210)参与核心复合体成分的粘附。抗gp210抗体对PBC的诊断具有高度特异性,虽然敏感性仅10%~53%,但它和疾病活动性密切相关,阳性者较阴性PBC患者其肝衰竭发生率明显增加。p62是存在于核孔复合物中的糖蛋白,是PBC的一种自身抗原。抗p62 抗体在PBC患者中阳性率为140%~32%,干燥综合征患者中为13%,此外还可见于少数混合性结缔组织病患者。研究提示抗p62抗体在PBC患者中的敏感性与特异性均高于其他自身免疫性疾病,且可能与晚期或进展型PBC有关。

    少数PBC患者(约1%)可检出抗核内膜上核纤层蛋白B 受体(LBR)抗体。抗LBR抗体对PBC亦有特异性。

    3.抗着丝粒型ANA:其在PBC患者中的靶抗原为着丝粒蛋白B(CENP-B),一种相对分子质量为80 000,与人类染色体着丝粒异染色质有关的蛋白。相关研究发现,日本PBC患者除抗gp210抗体是肝衰竭的显著危险因素外,抗着丝粒型 ANA阳性者同样提示预后不佳,它与门脉高压的发生密切相关。

    4.其他靶抗原:SOX13(ICA12)是一种转录因子,近来有研究发现抗SOX13抗体在PBC患者中阳性率为18%,AIH中为13%,自身免疫性胆管炎中为14%,并且还可在18%的1型糖尿病患者中检测出。不过,抗SOX13抗体在PBC中的诊断及临床意义还有待进一步研究。

    三、原发性硬化性胆管炎

    PSC是一种原因不明的慢性胆汁淤积性肝病,常见于中青年男性。患者常出现肝内和(或)肝外胆管进行性狭窄,最终导致肝硬化和门静脉高压。约75% PSC患者伴发炎症性肠病,最常发生的为溃疡性结肠炎,而克罗恩病则较少发生。非典型性核周型抗中性粒细胞胞浆抗体(pANCA)阳性支持本病的诊断,其识别的靶抗原主要为乳铁蛋白、组织蛋白酶G等。但由于其他慢性肝病,如PBC、AIH患者中也可发现非典型性 pANCA,因此仅为非特异性指标,对PSC尚无确诊意义。在 PSC,AIH及溃疡性结肠炎中发现的非典型性pANCA特异性识别相对分子质量为50 000的核膜蛋白,其阳性率达92%,且仅存在于中性粒细胞和其前体髓样细胞核膜上,故而将这种抗体称为核周型抗中性粒细胞核抗体(pANNA)。但其效价水平与PSC临床表现、生化指标、疾病进程以及疗效观察之间无密切联系。相比而言,肝脏组织学检查及胆管逆行造影对PSC 的确诊有较大帮助,其典型胆道造影为胆管壁不规则增生和弥漫分布的多位点狭窄。Angulo P等在73例未经治疗的 PSC患者中ANCA检出率为84%,抗心磷脂抗体为66%,而 ANA为53%,同时发现抗心磷脂抗体的效价似乎与PSC的组织学变化及疾病严重程度有关。最近又有学者发现63%PSC 患者存在针对胆管上皮细胞的自身抗体,该抗体介导CD44和 IL-6的表达与生成。CD44是一种广泛参与病理生理过程的粘附分子,抑制CD44的表达及其功能可能是PSC的一个新治疗方法。

    综上所述,血清自身抗体检测在自身免疫性肝病,尤其是 AIH和PBC的诊断中占有重要地位。但多数自身抗体既无器官特异性,亦无疾病特异性,虽然在疾病自然演变及治疗过程中效价水平会有所波动,但多数学者认为不宜将自身抗体的绝对水平及其变化作为判断疾病严重程度或疗效的指标。希望随着实验室检验技术的不断发展,能够发现更多新的具有疾病及器官特异性且能提示预后的自身抗体来提高自身免疫性肝病的临床诊断及治疗水平。

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