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蒋毅 三甲
蒋毅 主任医师
攀钢总医院 男科

慢性前列腺炎之耐药菌株研究by蒋氏男科

一)耐药性的一般概念:耐药性是指病原体(或肿瘤细胞)对反复应用的化学治疗药物敏感性降低或消失的现象。根据遗传特性,将细菌耐药性分为固有性耐药,即耐药性来源于该细菌本身染色体上的耐药基因,代代相传,具有典型的种属特异这种耐药性较为稳定通常不会发生改变;获得性耐药,即由于细菌在生长繁殖过程中,其DNA发生改变而使其形成或获得了耐药性表型,获得性耐药产生类型包括染色体介导的耐药性与质粒介导的耐药性,这种耐药性不稳定且十分容易发生改变。攀钢集团总医院男科蒋毅

       由染色体介导的耐药,一般是由于遗传基因DNA自发变化的结果,具有典型的种属特异性,能够代代相传。细菌的这类耐药性,一般对一种或两种相类似的药物耐药,且比较稳定,耐药性的产生与消失与药物接触无关,在自然界中这类耐药菌占次要地位。

       由质粒介导的耐药,这类耐药性是由于细菌获得外源新基因而产生的。细菌外源耐药性基因既可以通过染色体垂直传播而获得,又可以通过质粒或转座子水平传播而获得。细菌可以在生长繁殖过程中自发地获得外源性物质,这种耐药性的传播方式主要有转化(transformation)、转导(transduction)、接合(conjugation)和转座(transposion)4种。所谓转化是指耐药菌溶解后释放出的DNA进入敏感菌体内,其耐药基因与敏感菌的同种基因重新组合,使敏感菌成为耐药菌。转化过程常限于革兰氏阴性菌;所谓转导是指借助于噬菌体将耐药基因转移给敏感菌,由于噬菌体有特异性,且通过噬菌体传播的DNA量很少,因此耐药性的转导现象仅能发生在同种细菌内,通常仅能传递对一种抗菌药的耐药性。临床上是金黄色葡萄球菌耐药性转移的惟一的方式;所谓接合就是指由接合传递的耐药性也叫感染性耐药,主要是通过耐药菌与敏感菌菌体的直接接触,由耐药菌将耐药因子转移给敏感菌。接合转移不仅可在同种菌之间进行,也可在属间不同种菌之间进行,通过接合方式,一次可完成对多种抗菌药耐药性的转移。这种方式主要出现在革兰氏阴性细菌中,特别是在肠道菌中;所谓转座子就是指一种比质粒更小的DNA片段,它能够随意地插入或跃出其它DNA分子中,将耐药性的遗传信息进行传递,转座子不能进行自身复制,必须依赖于细菌的染色体、噬菌体或质粒中而得以复制和繁殖。转座子的宿主范围广,它可在革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间转移,从而使耐药基因的宿主范围也扩大,是耐药性传播的一个重要原因。

(二)慢性前列腺炎综合征细菌耐药的可能机制:细菌耐药的生化机制产生包括抗生素滥用与机体免疫内环境变化、灭活酶或钝化酶的产生、细菌药物作用靶位改变、细菌细胞膜渗透性改变、药物主动外排系统、细菌生物被膜的形成等几个方面。

(1)抗生素滥用与机体免疫内环境变化:不规范应用,非药敏经验性应用、断断续续应用、应用剂量与疗程不够、同一类抗生素选择的差异性造成耐药、超剂量与超长疗程对机体免疫机能损伤,对肝功损伤,而机体免疫微环境发生改变导致细菌变异而耐药性增加。

(2)细胞壁或细胞膜的通透性改变,如铜绿假单胞菌特异性孔蛋白OprD2缺失导致碳青霉烯类抗生素耐药。

(3) 细菌细胞壁的缺失与抗菌药物作用靶点的丧失:细菌细胞壁不同程度的缺失造成细菌L型不同的耐药性与致病性,细菌细胞壁缺陷变异是细菌以这种被动逃避方式,逃避抗菌药物伤害的最常见类型。任何细菌L型都属于非遗传型变异,稳定细菌L型放弃了细胞壁及其合成代谢活动、以及细胞壁相关的几乎各种抗菌药物作用的靶点,能够在包含诱导剂的环境中保持缺乏细胞壁的状态(原生质体或圆球体)和生长繁殖,因此各种细菌形成的稳定细菌L型都对作用于细胞壁的抗生素之敏感性降低或丧失敏感性,如自发形成的或利福平等抗结核分支杆菌抗生素之稳定细菌L型不但难以返祖而且形成了对抗利福平等抗结核药的耐药性,但是大多数细菌保留了重新合成细胞壁与返祖的特质,细菌一旦返祖,通常就恢复对干扰细菌细胞壁合成的抗生素以及其它许多抗生素的敏感性。

       细菌细胞壁缺失使细菌的代谢活性减弱或停滞。

 (4)钝化酶或灭活酶的产生:所谓钝化酶(Modified enzyme)是细菌耐药菌株产生的,具有破坏或灭活抗菌药物活性的某种酶,它能够使抗生素发生水解、磷酸化、糖基化、或酰基化,其中b内酰胺酶(b-lactamase)是最主要的灭活酶,还包括氨基糖苷类钝化酶、磷酸转移酶、乙酰转移酶和核苷转移酶、氯霉素乙酰转移酶、以及磷霉素、红霉素乙酰化酶、林可霉素、克林霉素乙酰化酶等等。

       b内酰胺酶是一类能够水解β内酰胺环,导致b内酰胺类抗生素丧失抗菌活性的酶类,目前已发现的b内酰胺酶多达2000多种,其中超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum βlactamase,ESBL)已超过50种。临床上产超广谱b内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)、高产头孢菌素酶 (AmpC诱导酶)、碳青霉烯类酶 (金属酶及2f组b内酰胺酶) 的菌株受到高度关注。

       细菌产生β内酰胺酶是最主要的细菌耐药机制(据统计占80%),也是细菌对b内酰胺类抗生素耐药的主要机制,它能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)和7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中b内酰胺环酰胺键的灭活酶。细菌的b内酰胺酶分别由细菌质粒携带的抗性基因和遗传染色体DNA上的抗性基因编码产生,即分为染色体介导酶和耐药质粒介导酶两大类。以其水解对象可分为青霉素酶、头孢菌素酶、广谱酶和超广谱酶四种。

       质粒是一种密闭环状双股螺旋结构的DNA,存在于胞浆内,也是具有遗传功能的基因成分,质粒带有各种基因,包括耐药基因,但不是细菌存活所不可缺少的组成物质。质粒介导的β内酰胺酶用等电聚焦法分型有TEM型(TEM-1,TEM-2),OXA型(OXA-1~3),PSE型(PSE-1~4),SHV-1,HMS-1等标准酶,均为G-杆菌,主要为大肠杆菌、克雷伯氏杆菌、肠杆菌属、绿脓杆菌等产生。TEM型酶分布很广,尤以TEM-1型分布最广,出现频率最高,约占50%。染色体介导酶有K1型,P99型及D31型,染色体基因决定细菌对抗生素固有耐药性,近代研究证明在院内感染病人中产生质粒介导酶的耐药菌,其产生耐药性大多是在接触抗生素后获得的,并通过耐药基因的转移而播散,也可由基因表达而传至下代。

       b内酰胺酶依据氨基酸序列的不同又将其分为A、B、C和D四类,其中A、C和D类依靠酶活性位点的丝氨酸表达催化活性,因此被称为丝氨酸b-内酰胺酶(serine-β-lactamases,SBLs),至今至今SBLs的数量已经超过了1000种(临床上,克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦、阿维巴坦这4类抑制剂可以抑制 SBLs的催化活性,恢复b-内酰胺类抗生素对细菌的抗菌活性)。A型β内酰胺酶按Bush分类法属2群,向下又分为8个亚群(2a,2b,2c,2d,2e,2f,2be,2br),因此,A型β-内酰胺酶在底物动力学性质上显示多样性。大多数青霉素类抗生素都是A型β-内酰胺酶的良好底物,侧链上有氨基的氨苄西林,含羧基的羧苄西林。侧链上具有空间障碍基因的苯唑西林和甲氧西林都是A型β-内酰胺酶的良好底物。从整体上看,A型β-内酰胺酶对青霉素类的水解率较头孢菌素类为高,但也有例外。此类酶的活性可被克拉维酸等酶抑制剂所抑制。B类β内酰胺酶酶依靠活性位点的1 ~ 2个Zn 2 + 表达催化活性,因此被称为金属β内酰胺酶(metallo-β-lactamases,MBLs),MBLs又可分为3个亚群:B1、B2和B3亚群。B1和B3亚群MBLs ,可以水解青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类抗生素,B2亚群MBLs ,专一水解碳青霉烯类抗生素。MBLs与临床感染的相关性中,B1亚群MBLs 数量最多且大部分与临床有相关性, 如在多种革兰阴性致病菌中发现的亚胺培南酶(imipenemases, IMPs)、维罗那亚胺培南酶(Verona imipenemases,VIMs)和新德里金属β内酰胺酶(New Delhi metallo-β-lactamases,NDMs),以及在铜绿假单胞菌中发现的巴圣保罗金属β内酰胺酶1(Sao Paulo metallo-β-lactamases 1,SPM-1)、蜡样芽孢杆菌中发现的β内酰胺酶Ⅱ、脆弱拟杆菌中发现的耐碳青霉烯和头孢菌素酶以及脑膜炎脓毒菌中发现的β内酰胺酶B; B2亚群MBLs数量最少; B3亚群MBLs多存在于机会致病菌中。

       临床上产超广谱b内酰胺酶(extended-spectrum b-lactamases,ESBLs)、高产头孢菌素酶 (AmpC诱导酶)、碳青霉烯类酶 (金属酶及2f组β内酰胺酶) 的菌株受到高度关注。ESBLs是由G-杆菌的质粒介导的2be类b内酰胺酶,即质粒介导酶,能灭活窄谱和广谱头孢菌素、单环类抗生素及抗G-杆菌青霉素等抗生素为特征,由b内酰胺基因编码,属于Ambler分类的A类,按Bush分类属2be群。大多数的ESBL都是TEM-1、TEM-2、SHV-1酶的突变体,它有较广的水解底物谱,可以通过质粒在G-细菌之间传播。同时因其质粒上常携带对其他抗生素的耐药基因,很容易通过接合过程转移到其他菌株,从而出现多重耐药株,部分产ESBL菌株不但对β内酰胺类耐药,有的还可对氨基糖苷类、磺胺、四环素、氯霉素和喹诺酮类耐药,其作用机制,除了能水解青霉素类和一、二代头孢菌素外,还能水解三代头孢菌素及单环b内酰胺类氨曲南被b内酰胺酶抑制剂如克拉维酸(CA)所抑制,但ESBLs不能水解碳青霉烯类和头霉素类抗生素,ESBL一般可被克拉维酸、青霉烷砜和他唑巴坦等酶抑制剂所抑制,其中他唑巴坦的酶抑制作用最强。它主要由肺炎克雷伯氏菌及大肠艾希氏菌产生。往往如尿道插管、所谓的后尿道药物灌注治疗、泌尿外科腔镜等有创操作、就诊前大剂量使用第3代头孢菌素是发生此类菌株感染的高危因素。产生此酶的菌株,对所有青霉素类、头孢类(1-4代)和单酰胺类抗生素耐药,而对碳青霉烯类和头霉烯类较为敏感(2001,NCCLS)体外对酶抑制剂敏感,但使用酶抑制剂复合药不一定有效。

       AmpC诱导酶的特点往往在抗生素(特别是三代头孢菌素)治疗过程中诱导产生,并有可能选择出持续高产AmpC β-内酰胺酶的突变株,持续高产的I类酶是由G-杆菌产生(染色体介导,AmpC基因编码)。高产AmpC酶的产生机制:在整个Amp耐药基因组中,AmpD突变,形成稳定的去阻遏作用,从而使AmpC基因自由表达,成为持续高产AmpC酶。易发生产AmpC酶细菌感染的因素:大量使用3代头菌素、长期住院免疫抑制、高龄使用导管装置,多种细菌均可产生,尤其是肠杆菌科肠杆菌属(阴沟肠杆菌)、枸橼酸杆菌属(枸橼酸杆菌)、沙雷氏菌属(粘质沙雷)、摩根摩根氏菌属(摩根摩根氏菌)、不动杆菌属。所有β内酰胺酶抑制剂均不能解决AmpC酶,相反,克拉维酸是强诱导剂突变株不仅对第三代头孢菌素耐药,而且对β-内酰胺类抗生素/酶抑制剂复合物也耐药。目前大约30%~50%肠杆菌属、弗劳地枸橼酸菌、沙雷菌等高产AmpC酶。碳青霉烯是潜在的AmpC酶诱导剂,但对AmpC酶高度稳定,故没有选择去阻遏突变株的作用。产AmpC酶耐药菌引发的临床感染后果相当严重,有报道产AmpC酶肠杆菌属感染患者死亡率是非耐药菌感染患者的2倍

    金属酶特点:主要由嗜麦芽产生,与应用广谱抗生素,特别是亚胺培南大量使用有关;它以天然的外膜通透性差而广泛耐药,对亚胺培南天然耐药推荐药物:特美汀(替卡西林拉维酸)+SMZ/TMP、特美汀+环丙沙星、舒普深。

 (4)泵出机制即药物主动外排系统:主动外排系统有三种蛋白质组成,包括位于细菌质膜起泵作用的内膜转运子(Mex),位于G-菌外膜或G+菌细胞壁的类似于孔蛋白的外膜通道(Opr)及位于运输子和外膜蛋白间起桥梁作用的周质辅助蛋白,共同构成三联外排系统。使抗菌药物外排,降低细菌细胞内的药物浓度而耐药,而且是导致多重耐药的重要机制。目前研究表明主要有两大类外排系统:特异性(单一性)外排系统和多种药物耐药性(multidrug resistance,MDR)外排系统。一般来说,两个外排系统的作用都各不相同,其中特异性外排系统一般只作用于单一的底物(药物),常常是某一类的抗生素,如四环素、氯霉素、链霉素等。而多种药物耐药性外排系统可以作用于多种抗菌药或者一些结构和功能不相关的复合物。多重耐药系统。主动泵出活动增强和外排药物通透性下降的协同作用。例如:铜绿假单胞菌MexA-MexB-OprM表达增强和OprD2的缺失,对亚胺培南耐药。特点:结构上无关的多重抗生素耐药,但是对氨基糖苷类敏感,多见于大肠埃希菌,铜绿假单胞菌。

(5) 改变靶位蛋白:由于抗菌药作用的靶位发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法结合或亲和力下降,这种耐药机制在细菌耐药中普遍存在。主要有两种方式:①改变细菌靶蛋白,抗生素结合位点的蛋白质结构发生改变或被修饰,均可导致亲和力的降低

②产生新的靶位,细菌遗传物质变异产生新的低亲和力蛋白酶,替代原先途径,拮抗抗菌药物作用。目前的研究表明,β-内酰胺类抗菌药物的作用靶位为青霉素结合蛋白(PBP),氨基糖苷类和四环素抗菌药物的作用靶位为核糖体的50S亚基,大环内酯类和氯霉素以及克林霉素的作用靶位为核糖体的30S亚基,利福霉素类的作用靶位为依赖于DNA的RNA聚合酶,哇诺酮类的作用靶位为DNA促旋酶,磺胺类的作用靶位为二氢碟酸合成酶和二氢叶酸还原酶,万古霉素的作用靶位为细胞壁五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸末端的游离羧基。这些作用靶位结构的细微变化都有可能产生很高的耐药性。

 (6)细菌生物被膜的形成: 细菌生物被膜是指细菌粘附于固体或有机腔道表面,形成微菌落,并分泌细胞外多糖蛋白复合物将自身包裹其中而形成的膜状物。当细菌以生物被膜形式存在时耐药性明显增强(ro-1000倍),抗生素应用不能有效清除BF,还可诱导耐药性产生。生物被膜中的大量胞外多糖形成分子屏障和电荷屏障,可阻止或延缓抗生素的渗入,而且被膜中细菌分泌的一些水解酶类浓度较高,可促使进入被膜的抗生素灭活,此为渗透限制。生物被膜流动性较低,被膜深部氧气,营养物质等浓度较低,细菌处于这种状态下生长代谢缓慢,而绝大多数抗生素对此状态细菌不敏感,当使用抗生素时仅杀死表层细菌,而不能彻底治愈感染,停药后迅速复发,此为营养限制。

(三)慢性感染性前列腺炎常见耐药微生物分析:

       过去认为慢性细菌性前列腺炎(CBP)在临床上只占5%左右,但随着抗菌药物的大量使用及不合理应用,以及男性性活动的需求大量增加,多重性伴侣的广泛存在,CBP 的发病率逐年上升,细菌种类及分布也发生了很大的变化。

    由于抗生素广泛滥用已经发展到多重耐药(MDR),即临床上对使用三类或三类以上的抗菌药物同时呈现耐药现象[如(耐甲氧西林金葡菌(MRSA))、 耐甲氧西林表皮葡萄球菌(MRSE)、抗万古霉素肠球菌(VRE),产ESBL细菌,铜绿假单胞菌、多重耐药结核分支杆菌、耐碳青霉烯的肠杆菌科,耐碳青霉烯的饱满不动杆菌],以及对目前应用的抗生素都耐药的泛耐药菌株(PDR)。目前全球范围内ESKAPE[屎肠球菌(Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、肺炎克雷伯菌 (Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)、肠杆菌(Enterobacter species(肠杆菌)]耐药已成为各种感染导致患者发病及死亡的重要原因。扩展开来就是:如革兰氏阳性菌之耐万古霉素肠球菌(VRE),耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、难辨梭状芽孢杆菌(c-diff)、耐青霉素和多重耐药的肺炎链球菌(PRSP);革兰氏阴性菌包括超广谱(ESBLs)的细菌如大肠艾希氏菌、肺炎克雷伯氏菌,产AmpCβ内酰胺酶的阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、枸橼酸杆菌。总的趋势就是产ESBLs,Amp-C的细菌种类数量在不断上升、耐万古霉素肠球菌(VRE)日益增多,耐万古霉素金黄色葡萄球菌(VRSA)出现,可以看出上述所列举菌种都是慢性细菌前列腺炎,泌尿生殖系统感染之主要致病菌,这就是慢性前列腺炎治疗难度越来越大的根本原因之一。事实上,CBP主要病原菌是革兰阳性菌,并以金黄色葡萄球菌为主,其耐药性较为严重,并呈多重耐药性。

(1)凝固酶阴性葡萄球菌的耐药研究:凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)包括以表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌为代表的众多菌种菌株。研究发现随着抗生素特别是头孢类抗生素的滥用,已经出现针对抗生素的广泛大面积耐药性,许多研究结果呈现具有较强的耐药性,诸多报道表明CNS对甲氧西林呈现具有较强的耐药性,达到了56.2%。多数研究发现耐甲氧西林固酶阴性葡萄球(MRS)对除万古霉素敏感度较高以外,对复方磺胺新诺明(复方SMZ,内含三甲氧苄胺嘧啶-TMP,TMP对前列腺腺管上皮细胞具有较高的渗透力)、呋喃妥因、利福平(研究表明体外实验中利福平与阿米卡星对CNS的体外抗菌活性较高)等也有较高的敏感性,除此以外的抗生素,MRS均有不同程度的耐药,耐药性均较高;研究表明MRCNS对目前所有的头孢类和β内酰胺类,包括含酶抑制剂的复合剂和碳青霉烯类抗菌药物耐药[根据美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,NCCLS)药敏规则,耐甲氧西林葡萄球菌对所有β-内酰眩类包括含酶抑制剂的复合制剂和碳青霉烯类药物的临床治疗无效,故临床用药时不宜选用]。由于MRS菌常常同时携带氨基甙类或喹诺酮类抗生素耐药质粒,所以不仅对β内酰胺类药物耐药而且对喹诺酮和氨基糖甙类也耐药,因而治疗MRS感染可供选择的抗生素十分有限,尤其是近年来头孢菌素和喹诺酮类抗生素的大量应用致使MRS对其耐药性有规重趋势,为临床治疗带来了更大的困难。目前万古霉素常常成为唯一治疗MRSE(耐药表皮葡萄球菌)感染的药物,但由于氨基甙类抗生素对于肾脏的毒性作用,因而限制了以万古霉素为代表的氨基甙类抗生素应用于治疗细菌性前列腺炎,由于利福平对与人体副作用与万古霉素不同,因此慢性前列腺炎合并肾脏疾病的患者感染MRSE菌,使用利福平比以万古霉素为代表的氨基甙类抗生素更为适宜。而且,随着万古霉素越来越多地应用于临床,已报道有耐万古霉素的CNS出现.

       凝固酶阴性葡萄球菌可通过产生水解酶,致变膜结构,产生细菌L型等,使大多数抗生素(包括β内酰胺类,喹诺酮类,大环内酯类)对之耐药。CNS对甲氧西林耐药是源于mecA基因编码产生青霉素结合蛋白2a(PBP2a),PBP2a与β内酰胺类抗生素亲和力极低,且具有正常青霉素结合蛋白参与细胞壁合成的功能,从而导致对β内酰胺类抗生素的耐药。且发现表皮葡萄球菌日益产生大量耐药菌株,其主要耐药机制是mecA基因表达和gyrA突变.MRCNS耐药的机制在于大量耐甲氧西林与耐大环内酯类耐药基因的大量存在.此外CNS染色体上的编码可通过传导、转化、结合等多种方式来改变,易造成耐药菌的流行。包括凝固酶阴性葡萄球菌在内的革兰氏阳性菌的耐药与反复感染是这一类细菌感染所致的细菌性慢性前列腺炎反复发作难以治愈的一个显著特点。

(2)金黄色葡萄球菌耐药机制研究:目前已有李裕民等人报道MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)对万古霉素的耐药率竟高达57%,李志江等人报道金黄色葡萄球菌对青霉素G的耐药率达94.12%。研究表明金黄色葡萄球菌产生以质粒介导的青霉素酶(属2a群),可有效地水解天然的和半合成的青霉素类抗生素,此酶为胞外酶,通过水解胞外青霉素,降低产酶株和邻近非产酶株胞内药物浓度而耐药。当前,金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌感染的病例中,MRSA和MRSE的发生率迅速增多。包括MRSA造成的全身感染在内的治疗可单独应用万古霉素,或与磷霉素或利福平合用。在骨、关节感染、心内膜炎或脑膜炎等病例中,万古霉素的组织浓度可能较低,前列腺由于解剖组织学的极端特异性,因此非耐药金黄色葡萄球菌或MRSA也可能存在类似的药物渗透困难性,因而极其难治。

表一、慢性前列腺炎综合征患者三种主要常见菌株对23种抗生素敏感性试验结果统计表(from:《中国抗生素杂志》38卷2期张丽等人之《875例慢性细菌性前列腺炎患者前列腺液的病原菌分布及耐药特征》)R(耐药), I(中敏), S(敏感)

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表二、慢性前列腺炎综合征患者主要致病的革兰阳性球菌对抗菌药物的耐药率(from:《中华医院感染学杂志》2014年24卷2期李志江等人之《86例慢性前列腺炎患者病原体感染分析》)

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表三、慢性前列腺炎综合征患者27种抗生素对葡萄球菌属敏感率览表(from:《中国男科学杂志》2014年28卷1期杨彦磊等人之《249例前列腺液细菌培养及药敏结果分析》)

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表4 慢性前列腺炎综合征患者革兰氏阴性菌对抗菌药物的耐药率(%)(from.《育龄期慢性前列腺炎患者精液病原体分布与耐药分析》中华医院感染学杂志2014年第24卷第8期)

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