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学术前沿

卡介苗免疫小鼠T淋巴细胞亚群表达穿孔素与抗结核发病

发表者:雷建平 1320人已读

 

雷建平  万引  周军  吴琼

见 中华结核和呼吸杂志2010,33(10): 771-774

 

【摘要】  目的  探讨卡介苗免疫小鼠抗结核发病和T细胞亚群表达穿孔素的相关性。方法  120只清洁级KM雄性小鼠分为2个对照组(各20只)、2个卡介苗组(各20只)、攻毒组(20只)和结核病组(20只)。2个卡介苗组与攻毒组小鼠腹部皮内接种卡介苗,接种3个月后攻毒组和结核病组小鼠接受MTB攻击,同时对照1组和卡介苗1组小鼠取血后处死。攻毒组和结核病组小鼠于接受MTB攻毒1个月后与对照2组和卡介苗2组小鼠取血后处死。观察所有小鼠的肺、肝和脾组织病理学改变,并经组织匀浆涂片查找抗酸杆菌和MTB培养。流式细胞仪检测分析血液标本中表达穿孔素的T细胞亚群计数及其占总淋巴细胞百分率。多组间免疫学指标的比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验。结果  结核病组小鼠的肺、肝和脾组织均有结核病表现,1个月内死亡11只,其他3组小鼠均未发现结核病表现,也无死亡鼠。卡介苗组小鼠表达穿孔素的CD8+ T细胞数[(5.9±0.9)×103]明显高于对照组[(4.8±0.8)×103],差异有统计学意义(F=42.24, P<0.01);结核病组小鼠表达穿孔素的CD8+百分率[(5.6±0.9)%]明显低于卡介苗组[(7.3±1.1)%],差异有统计学意义(F =35.51, P<0.05);攻毒组小鼠获得卡介苗免疫后,在致病量MTB攻击下表达穿孔素的CD3+、CD8+和CD4+CD8+ T细胞数[(20.1±5.5)×103、(8.7±0.4)×103和72±19]及其占总淋巴细胞百分率[(23.3±3.3)%、(10.7±1.6)%和(0.084±0.015)%]均明显高于对照组[(11.1±3.0)×103、(4.8±0.8)×103和30±7及(14.9±1.7)%、(6.7±0.9)%和(0.040±0.006)%]、卡介苗组[(13.0±3.2)×103、(5.9±0.9)×103和36±5及(15.5±1.7)%、(7.3±1.1)%和(0.044±0.007)%]及结核病组[(12.6±1.6)×103、(5.0±0.1)×103和31±3及(14.0±1.7)%、(5.6±0.9)%和(0.035±0.005)%],CD4+/CD8+比值(0.54±0.17)明显低于对照组(0.76±0.22),差异均有统计学意义(F=4.54~74.98, 均P<0.05或P<0.01)。结论  卡介苗免疫主要诱导表达穿孔素的CD8+ T细胞水平升高,在致病量MTB攻击下卡介苗免疫小鼠不发生结核病与表达穿孔素的CD3+、CD8+和CD4+ CD8+ T细胞水平升高相关;穿孔素表达水平高低可能是判断宿主抗结核免疫力强弱的重要标志之一。江西省胸科医院结核病临床诊断治疗中心雷建平

【关键词】 结核;  卡介苗;  T淋巴细胞亚群;  穿孔素

Correlation between the expression of perforin in T-lymphocyte subset and antituberculosis in mice vaccinated with bacillus calmette-guerin  LEI Jian-ping*, WAN Yin, ZHOU Jun, WU Qiong. *Chest Hospital of Jiangxi Province, Nanchang 330006, China

Abstract Objective  To investigate the relationship between the expression of perforin in T-lymphocyte subsets and antituberculosis in mice vaccinated with bacillus calmette-guerin (BCG). Methods  120 KM male mice were divided into a Control group (group C, n=40, 20 each in group C1 or C2), a BCG vaccinated group (group B, n=40, 20 each in group B1 or B2), a Tuberculosis group (TB group, n=20), and a BT group, in which the mice were attacked by Mycobacterium tuberculosis H37Rv (MTB) after acquired immunity by vaccination with BCG (n=20) .Initially, mice in group B1,B2 and BT were vaccinated with BCG synchronously. Three month later, mice in group BT and TB were attacked by MTB synchronously. Samples of blood, lung, liver and spleen of mice in group C1 and B1 were collected at the same time. One month later again, Samples of blood, lung, liver and spleen of mice in group C2, B2, BT and TB were collected at the same time. Samples of blood were assayed for T-lymphocyte subsets expressing perforin (PFN+). The positive numbers of PFN+ [(CD3+, CD4+, CD8+, CD4+CD8+ double positive (CD4+CD8+)] T lymphocytes and their percentages were assayed by flow cytometer. Specimens of lung, liver and spleen were examined for pathology and bacteriology. Results  All the mice   in the TB group acquired tuberculosis and the mortality was 55% (11/20) within 1 month. There were no tuberculosis and no death in mice of C, B and BT groups during the observation period. The amount of PFN+ CD8+ T lymphocytes in B group [(5.9±0.9)×103] was significantly higher than that in C group [(4.8±0.8)×103] (F=42.24, P<0.01). The PFN+ CD8+% in TB group [(5.6±0.9)%] was significantly less than that in B group [(7.3±1.1)%] (F=35.51, P<0.05). For Mice in the BT group, the amount of PFN+ (CD3+, CD8+, CD4+CD8+) T lymphocytes [(20.1±5.5)×103, (8.7±0.4)×103, 72±19] and their CD3+%, CD8+%, CD4+CD8+% [(23.3±3.3)%, (10.7±1.6)%, (0.084±0.015)%] were all higher than those in the B group [(13.0±3.2)×103, (5.9±0.9)×103, 36±5, (15.5±1.7)%, (7.3±1.1)%, (0.044±0.007)%] or the C group [(11.1±3.0)×103, (4.8±0.8)×103, 30±7, (14.9±1.7)%, (6.7±0.9)%, (0.040±0.006)%] or the TB group [(12.6±1.6)×103, (5.0±0.1)×103, 31±3, (14.0±1.7)%, (5.6±0.9)%, (0.035±0.005)%] (F=14.2374.98, P<0.01 or P<0.05),and the CD4+/CD8+ in BT group (0.54±0.17) was significantly lower than that in C group (0.76±0.22) (F=4.54, P<0.01). Conclusions  Pre-vaccination with BCG increased PFN+ CD8+ T lymphocytes in the host.  Acquired immunity by BCG vaccination can protect the host from attack by Mycobacterium tuberculosis. Increased PFN+ (CD3+, CD8+, CD4+CD8+) T lymphocytes may be involved. The expression level of PFN by T lymphocytes may be an important marker for antituberculosis immunity.

Key words Tuberculosis;   BCG vaccine;  T-lymphocyte subsets;  Perforin

 穿孔素(perforin)在结核病保护性免疫中的意义越来越受到重视[1-2]。以往的研究结果证实,卡介苗免疫可通过对T细胞亚群的调节作用防止结核病发病,提高初治肺结核患者的临床治愈率和减少耐多药结核病的形成[3-4]。我们在卡介苗免疫与T细胞亚群相关性研究的基础上,进一步从细胞因子水平分析卡介苗免疫的抗结核病与穿孔素表达的相关性。

材料与方法

    一、材料

1.  试验动物:清洁级KM健康雄性小鼠120只,PPD试验阴性,体重18~20 g,由江西中医学院实验动物科学部提供[许可证号:SCXK(赣)2005-0001];按随机数字表法分为对照组1组和2组(各20只)、卡介苗1组和2组(各20只)、攻毒组(20只)和结核病组(20只)。卡介苗组与攻毒组小鼠给予卡介苗10 μg腹部皮内注射,对照1组20只小鼠腹部皮内注射0.1 ml生理盐水。接种卡介苗3个月后,攻毒组和结核病组小鼠于尾静脉注射MTB悬液0.3 ml(湿菌含量约为0.1 mg/只),对照2组和卡介苗2组小鼠尾静脉注射生理盐水0.3 ml。

2. 主要设备及试剂:美国BD公司产FACSCaliur流式细胞仪。藻红蛋白标记的穿孔素单克隆抗体及相应的同型对照抗体、灭活胎牛血清和红细胞裂解液(美国eBioscience公司),多甲藻叶绿素蛋白标记抗CD3分子单克隆抗体(CD3PerCP)、异硫氰酸荧光素标记抗CD4分子单克隆抗体(CD4FITC)、别藻蓝蛋白标记抗CD8分子单克隆抗体(CD8APC)及相应的同型对照抗体、细胞固定和破膜加透化固定试剂盒(美国BD公司),无钙镁磷酸盐PBS、叠氮化钠(美国强生生物公司),PPD试剂(北京高科生命科学技术开发公司),卡介苗(上海生物制品研究所),人型MTB H37Rv(中国药品生物制品检定所)。

    二、方法

1.MTB悬液的制备:参照文献[1]的方法,取H37Rv在改良罗氏培养基上培养2周生长良好的菌落,研磨成10 mg/3 ml均匀菌悬液(含0.05%吐温80的灭菌生理盐水溶液),用生理盐水稀释成1 mg/3 ml菌悬液。

2.取血和处死动物:第3个月末对照1组和卡介苗1组小鼠内眦静脉取血并处死,攻毒组、结核病组于接受MTB攻毒1个月后与对照2组和卡介苗2组小鼠取血后处死,所有小鼠的血标本均进行T细胞亚群分析,均观察肺、肝和脾组织病理学改变,并经组织匀浆涂片查找抗酸杆菌和MTB培养。

3.  淋巴细胞分离和细胞因子标记:取200 μl肝素钠抗凝全血,加入CD3PerCP、CD4FTTC和CD8APC各20 μl,4 ℃避光孕育30 min。洗涤2次后重新悬浮细胞,加入2 ml红细胞裂解液,轻摇,室温避光孕育18 min。洗涤2次后重新悬浮细胞,加入250 μl的细胞固定和破膜加透化固定液,4 ℃避光通透20 min,加入1 ml破膜/洗涤缓冲液洗涤2次,250×g离心5 min。100 μl的破膜/洗涤缓冲液重悬细胞,分成2份,分别加入胞内特异性标记抗体穿孔素-藻红蛋白20 μl,避光4 ℃保存30 min。加入1 ml的破膜/洗涤缓冲液洗涤2次,悬浮细胞,待机检测。

4.  流式细胞仪分析:对小鼠外周血T细胞进行多种抗体染色,利用流式细胞仪分析表达穿孔素的CD4+、CD8+ 和CD4+CD8+细胞亚群。采用Cell Quest软件分析,记录上述T细胞亚群的细胞数及其占淋巴细胞百分率。

三、统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,对照组和卡介苗组组内免疫学参数比较采用t检验;多组间免疫学参数比较采用单因素方差分析,多重分析采用SNK检验。

   

1.结核病发生情况:结核病组小鼠全部发生结核病,肺、肝和脾组织均有结核病病理学改变,肺、肝和脾组织匀浆涂片均找到抗酸杆菌,组织培养均有MTB生长,小鼠死亡11只;其他3组小鼠均未发生结核病,肺、肝和脾组织均无结核病病理学改变,肺、肝和脾组织匀浆涂片均未找到抗酸杆菌,组织培养均无MTB生长,小鼠均无死亡。

2.免疫学指标比较:分别采用腹部皮内注射和尾静脉注射生理盐水的对照组小鼠各项免疫学参数无明显差别(表1);未行尾静脉注射生理盐水和尾静脉注射生理盐水的卡介苗组小鼠各项免疫学参数也无明显差别(表2);多重比较显示,卡介苗组小鼠表达穿孔素的CD8+ T细胞数明显高于对照组;结核病组小鼠表达穿孔素的T细胞数及其百分率与对照组无明显差别,但表达穿孔素的CD8+百分率明显低于卡介苗组;卡介苗免疫成功后,攻毒组小鼠表达穿孔素的CD3+、CD8+和CD4+CD8+ T细胞数及其百分率均明显高于对照组、卡介苗组和结核病组,CD4+/CD8+明显低于对照组(表3)。

 

1  对照组小鼠的各项免疫学指标比较(x±s

—————————————————————————————  ——

组别       鼠数 淋巴细胞数                   CD3+                                        CD4+                          

                           (×103个)          细胞数(×103个) 百分率(%)   细胞数(×103个) 百分率(%)  

对照1组  20       73±13                11.0±3.0              14.6±2.1              3.6±1.2             4.8±1.1

对照2  20       74±19                11.0±3.0              15.2±1.2               3.7±1.2            5.0±1.2

t值                       0.001                    0.033                 0.651                     0.016               0.152

P                     >0.05                    >0.05                 >0.05                     >0.05             >0.05    

组别     鼠数                 CD8+                                     CD4+CD8+                     CD4+/CD8+

                          细胞数(×103)百分率(%)    细胞数()      百分率(%)                    

对照1组   40            4.8±0.2           6.8±1.0             29±8            0.040±0.007     0.74±0.23

对照2   40            4.8±1.4           6.6±0.9             30±7            0.041±0.005     0.79±0.20

t值                              0.005               0.311              0.023                 0.312              0.234

P                             >0.05              >0.05              >0.05                >0.05              >0.05 

注:对照1组:腹部皮内注射生理盐水;对照2组:尾静脉注射生理盐水

 

2  卡介苗组小鼠的各项免疫学指标比较(x±s

                                                                                                                          

组别       鼠数 淋巴细胞数             CD3+                               CD4+                

                            (×103)          细胞数(×103) 百分率(%)     细胞数(×103) 百分率(%)

卡介苗1组 20     85±20         12.9±2.9      15.0±2.1       3.7±1.1      4.5±1.2

卡介苗2 20     85±22         13.1±3.5      15.3±1.3       3.7±1.2      4.3±1.0  

t值                     0.000             0.020            0.013           0.010         0.163

P                    >0.05             >0.05            >0.05          >0.05         >0.05    

组别          鼠数            CD8+                         CD4+CD8+               CD4+/CD8+

 细胞数(×103)百分率(%)    细胞数()      百分率(%)                                 

卡介苗1组 20     5.9±0.2      7.5±1.5       33±4     0.044±0.008     0.63±0.17

卡介苗2 20     6.0±1.5      7.1±0.7       36±7     0.044±0.005     0.61±0.13

t值                       0.021         0.567         0.077         0.020              0.058

P                      >0.05         >0.05        >0.05         >0.05              >0.05     

注:卡介苗1组:未行尾静脉注射生理盐水;卡介苗2组:尾静脉注射生理盐水

 

3  各组小鼠表达穿孔素的免疫学指标比较(x±s

————————————————————————————————

组别       鼠数 淋巴细胞数             CD3+                              CD4+               

                             (×103)             细胞数(×103)   百分率(%)      细胞数(×103)  百分率(%)   

对照组    40       74±16          11.1±3.0    14.9±1.7       3.6±1.2       4.9±1.2

卡介苗组40       85±21          13.0±3.2    15.5±1.7       3.7±1.2       4.4±1.1

结核病组  9       91±17          12.6±1.6    14.0±1.7       3.9±7.5       4.3±0.7

攻毒组    20       85±15     20.1±5.5abc  23.3±3.3abd    4.7±1.6       5.5±1.3  

F值                 2.46              14.23          42.98             1.79          2.42

P                >0.05            <0.01           <0.01            >0.05       >0.05   

组别       鼠数             CD8+                              CD4+CD8+                 CD4+/CD8+

                                细胞数(×103) 百分率(%)        细胞数          百分率(%)                    

对照组     40     4.8±0.8      6.7±0.9      30±7          0.040±0.006         0.76±0.22

卡介苗组 40     5.9±0.9a     7.3±1.1      36±5          0.044±0.007         0.62±0.15

结核病组   9     5.0±0.1      5.6±0.9e     31±3         0.035±0.005          0.77±0.14

攻毒组     20  8.7±0.4abd  10.7±1.6abd  72±19abd  0.084±0.015abd    0.54±0.17a

F值                 42.24          35.51       38.71             74.98                   4.54

P                 <0.01         <0.01        <0.01            <0.01                 <0.01  

注:经SNK检验, a 与对照组比较,P<0.01;与卡介苗组比较,b P<0.01;e P<0.05;与结核病组比较,c P<0.05;d P<0.01

 

   

本研究结果中,卡介苗免疫成功的小鼠受到致病量MTB攻毒后未发生结核病,其原因可能是有效的免疫保护机制使致病菌迅速减少,不足以致病。笔者认为,组织匀浆培养阴性的原因是由于未进行PCR检测MTB的DNA,故未能发现微量MTB及持留菌,MTB也可能被有效的免疫保护机制杀灭。

穿孔素是CD8 T细胞和自然杀伤细胞产生的细胞毒性分子,近期研究结果表明,T细胞各亚群均能不同程度地表达穿孔素[1]。CD4和CD8 T细胞是抗结核保护性免疫细胞[4-6]。本研究结果表明,卡介苗免疫小鼠表达穿孔素的CD8+ T细胞数明显升高,提示卡介苗免疫的抗结核保护作用与上述T细胞亚群的水平相关;研究结果还表明,结核病小鼠表达穿孔素的T细胞亚群与对照组比较无显著性变化,但其表达穿孔素的CD8+ T细胞百分率显著低于卡介苗组;卡介苗免疫小鼠在MTB攻毒后表达穿孔素的CD8+、CD4+CD8+ T细胞数明显升高,并伴有表达穿孔素的CD3+ T细胞数及各T细胞亚群百分率明显升高,更进一步提示表达穿孔素的CD3+、CD8+和CD4+CD8+T细胞在抗结核免疫中具有重要的免疫保护作用。以往的研究结果表明,穿孔素表达升高是抗结核病免疫力增强的标志[2,7],本研究结果支持此观点。因此,穿孔素表达作为评价抗结核免疫治疗效果的重要参数,可能具有重要意义[8]

参 考 文 献
[1] 雷建平,李剑,邓国防,等.结核病小鼠T淋巴细胞亚群及其表达的四项细胞因子分析.中华结核和呼吸杂志,2008,31:836-840.
[2] Klucar P, Barnes PF, Kong Y, et al. Characterization of effector functions of human peptide- specific CD4+ T-cell clones for an intracellular pathogen. Hum Immunol, 2008,69: 475-83. PMID: 18588932
[3] 雷建平,熊国亮,胡群芳,等.化疗加用卡介苗免疫治疗预防耐多药结核病的研究.中华预防医学杂志,2008,42:86-89.
[4] 雷建平. CD4+CD8+双阳T细胞与结核病及卡介苗治疗相关性研究.中国科技成果,2009,10:58.
[5] Elvang T, Christensen JP, Billeskov R, et al. CD4 and CD8 T cell responses to the M. tuberculosis Ag85B-TB10.4 promoted by adjuvanted subunit, adenovector or heterologous prime boost vaccination. PLoS One, 2009,4:e5139. PMID: 19357780
[6] Harari A, Enders FB, Cellerai C, et al. Distinct profiles of cytotoxic granules in memory CD8 T cells correlate with function, differentiation stage, and antigen exposure. J Virol, 2009,83: 2862-2871. PMID: 19176626
[7] 雷建平.耐多药结核病治疗研究现状及警示.中华临床医师杂志(电子版) 2009,3:1334-1341.
[8] 雷建平.重新审视结核病免疫治疗研究的方向和方法.中华临床医师杂志(电子版),2010,4:908-915.

 

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发表于:2011-11-13 07:52

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