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鹿占鹏 三甲
鹿占鹏 主任医师
济宁市第一人民医院 泌尿外科

细菌基因检测在慢性前列腺炎诊断中应用的研究

 

 [摘要]  目的:建立基于16SrRNA基因的PCR细菌学检测方法,用于慢性前列腺炎患者EPS的细菌学检查,以指导临床诊断和治疗。材料方法:建立细菌PCR检测方法,并对实验组58例标本和对照组30例标本进行检测。结果:经过优化的PCR方法检测细菌的敏感性达到了103/mL。实验组标本PCR检测阳性率46.6%(27/58),其中包括培养法阳性的四例标本占实验组总数的7.0%(4/58)。对照组标本PCR检测阳性率为10%(3/30)。结论:基于16SrRNA基因的PCR方法具有快速、简便、稳定、不受干扰等优点,可用于检测慢性前列腺炎患者的EPS。济宁市第一人民医院泌尿外科鹿占鹏

 [关键词] PCR      慢性前列腺炎  16SrRNA基因  

The Study of the Application of PCR-Dot blot in the Diagnosis of the Chronic Prostatitis

Lu ZhanPeng,  Zhao Yan

Department of urology, JiNing First People Hospital. JiNing 272011, China

Abstract  Objective:In order to detect bacterial of EPS from the patients who suffering from chronic prostatitis ,we established PCR for 16SrRNA gene.Methods: In this study we established the PCR to detected the samples of the experiment group and the control group. Results: By optimizing the PCR reaction system, the sensitive concentration detected could be 103/mL.  The positive rate of the experiment group is 46.6%(27/58) with PCR, includes four positive samples with culture. In the control group, the positive rate is 7.0%(4/58) with culture.  Conclusion: PCR for 16SrRNA gene has many advantages, such as rapid, convenient, steady, uninfluenced, et al. It could be consider as one effective method in the diagnosis of bacterial and nonbacterial prostatitis.

Key word: PCR; chronic prostatitis; 16SrRNA gene.

慢性前列腺炎(chronic  prostatitis, CP)是影响青壮年男性生活质量的常见病,估计全球男性的发病率为9%~14%[1] ,约占泌尿外科患者量的25%,且近年有逐渐增加的趋势。目前争议最大的是致病微生物的感染问题,临床研究发现细菌培养阴性的CP患者40%对抗生素治疗有效[2]。因此推测慢性前列腺炎可能与常规方法难以培养的病原微生物感染前列腺有关。故此,我们设计了本实验,对慢性前列腺炎的病因及诊断进行探讨,以达到指导临床治疗的目的。

材料与方法

1.材料

1.1 标本

标准菌株、病毒株、白色念珠菌实验组患者共58例(符合美国国立卫生研究院慢性前列腺炎诊断标准)。对照组共30例(健康男性)。

1.2 试剂与仪器

双蒸水、10%SDS(十二烷基硫酸钠)、20mg/mL蛋白酶K、200bp DNA Ladder(华美生物工程公司)、Taq DNA Polymerase(华美生物工程公司)。自行合成的引物:引物1:5'AGA  GTT  TGA  TCC  TGG  CTC  AG   3' 引物2:5'CCG  TCA  ATT  CCT  TTG  AGT  TT    3'(上海生工生物工程公司)、5417R高速冷冻离心机和5415C高速离心机(德国Eppendorf公司);9600基因扩增仪(美国Perkin elmer公司);DYY-III-6B型稳压稳流电泳仪(北京六一仪器厂);Gel Doc l000紫外检测系统和配套的分子分析软件(Version2.3)(美国BIO-RAD 公司); SW-CJ-1F超净工作台(江苏苏净集团安泰公司)。

 2 方法

2.1  细菌培养:临床实验组标本EPS或VB3常规细菌培养, 并用白细胞计数池计数

2.2  细菌室分离鉴定的细菌和标准菌株经比浊法和计数法确定细菌含量107/mL。并用倍比稀释法稀释标本107/mL~101/mL。

2.3  细菌DNA提取: 取500µl标准菌株或前列腺液或VB3尿液标本置于EP管内,不足者用0.9%生理盐水补足、混匀。将标本12000×g离心5min,去上清。沉淀物加入高盐TE缓冲液190μL,用吸管反复吹打重悬。加入20mg/ml蛋白酶K1.5μL,混匀,于37℃温育1小时。加入10%SDS10μL煮沸10 min。

2.4  PCR方法反映体系为50μL :Primer(1+2) 0.8μL;dNTP 4.0μL;Taq polymerase 0.2μL;Mg2+(25Mm) 4.0μL;模板 5.0μL;PCR循环条件为:预变性95℃,3min;  95℃ ,40s; 56℃, 40s; 72℃ , 120s;循环40次。最后72℃ ,5min以使反应充分。每次提取DNA以及PCR扩增以双蒸水作为空白对照。

2.5 DNA提取和基因扩增敏感性的检测

为了验证改良法DNA提取和基因扩增敏感性,用0.9%的生理盐水按倍比稀释法,将大肠杆菌悬液稀释到以下浓度:5×107/ml、5×106/ml 、5×105/ml、5×104/ml、5×103/ml、2.5×103/ml。按上述DNA提取和PCR方法进行实验,扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳和紫外检测系统检测。

2.6  16SrRNA基因引物的特异性检测

为了验证本实验采用的基于16SrRNA基因通用引物的特异性,我们对不同种类的微生物按照上述2.3、2.4方法进行DNA提取及基因扩增。扩增产物经1%琼脂糖电泳和紫外线检测系统检测。实验中采用的微生物包括:Escherichia coli(大肠杆菌)、Staphylococcus aureaus(金黄葡萄球菌)、Salmonella typhi(伤寒杆菌) 、Nesseria gonorrhoeae(淋病奈瑟菌)、Klebsiella  pneumonia(克雷白杆菌)、β-hemolytic streptococcus(乙型溶血性链球菌)、Mycobacterium tuberculosis(结核分枝杆菌)、白色念珠菌、人类乳头瘤病毒,以双蒸水作为阴性对照。

2.7  统计方法:数据处理经过SPSS for Windows 10.0统计软件包行方差齐性分析,配对t检验,卡方检验等。

结      果

1. PCR的敏感性

按上述方法提取DNA和基因扩增,扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳。实验结果显示,在1500bp位置显示出明显扩增产物条带,大肠杆菌的最小检测量5×103/ml(图1)。

Marker  7   6   5   4   3   2   1

                 图1:基因扩增的敏感性

2. 通用引物扩增细菌16SrRNA基因的特异性

用上述方法检测细菌16SrRNA基因均获得扩增产物,经电泳在相当于1500bp区域均可见相应的DNA条带。扩增白色念珠菌及乳头瘤病毒和对照的双蒸水均未见特异性条带(图2)。

Marker 1  2  3  4  5  6  7  8  9  10

      图2:通用引物扩增细菌16SrRNA基因的特异性

注:(图2中数字所代表的微生物:1.Escherichia coli. 2.Staphylococcus aureaus. 3.Salmonella typhi. 4.Nesseria gonorrhoeae. 5 .Klebsiella  pneumonia. 6.β-hemolytic streptococcus. 7. Mycobacterium tuberculosis. 8.白色念珠菌. 9. 人类乳头瘤病毒10. 双蒸水)

4. 慢性前列腺炎细菌性病因研究

为了验证慢性前列腺炎是否由培养法难以检测出的细菌感染引起,我们对实验组58例标本和对照组30例标本进行PCR法检测。实验组58例标本,前列腺液细菌培养结果有4例阳性,而前列腺液或VB3行PCR法检测,扩增产物共27例显示出电泳条带,其中包括培养法阳性的4例标本。

表1:培养法和PCR法检测结果对比表(例数)

 

培养法+

培养法-

PCR+

4

23

PCR-

0

31

 

χ2=21.04

P<0.005

 

为了验证实验组前列腺液(或VB3)PCR检测到的阳性细菌信号是否为正常生殖道寄生菌,我们用PCR法30例对照组前列腺液标本进行PCR检测,经PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳,有3 例结果为阳性。其结果与病例组进行对照见表2。

表2:实验组与对照组结果对照表(例数)

 

PCR+

PCR-

实验组

27

31

对照组

3

27

 

χ2=11.75

P<0.005

 

综合上述结果,可以预见因培养法阴性而诊断为慢性非细菌性前列腺炎的患者,仍可能存在培养法检测不出的细菌致病的可能性。

讨       论

1. 16SrRNA基因的特点及其在病原菌检测中的应用

16SrRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列,存在于所有原核生物中,但不存在于非原核生物如病毒、真菌的体内。编码16SrRNA的基因约1500个核苷酸大小 ,每个细菌含5-10个拷贝。由于16SrRNA基因具有高度保守性,其核苷酸片段长度适宜[2],在16SrRNA基因保守区设计一对引物,成为通用引物,可用于对所有细菌进行检测,若再在中间的可变区中选择序列作探针,可对靶细菌做出鉴定,可检测各种特定的病原菌。

国内尚士强[3]等在细菌16SrRNA基因保守区设计了一对通用引物,其扩增产物为371bp。该引物对20种不同的细菌的标准菌株进行PCR扩增,均获得371 bp片段与病毒和人的基因组DNA无交叉反应。McCabe等[4]报道用一对细菌共同引物对12种不同的G-菌和G+菌进行PCR扩增,均获得了861bp长度的DNA片段,而对照组和人基因组DNA未被扩增。这与本实验结果相似。我们根据文献报道,自行合成的一对细菌通用引物,对7种细菌进行扩增,均获得了大约1500bp的DNA片段,而病毒及真菌DNA未被扩增,最小检出量达103/ml,而培养法需要最少105/ml细菌才能检测出来。实验结果显示该引物有较高的敏感性和较强的特异性,可以作为细菌检测的一种敏感方法。

2. 慢性前列腺炎的诊断

20世纪初期,由于对于细菌学及感染性疾病认识的深入,泌尿科医师和微生物学家开始将细菌视为该病的病因。淋球菌一度被认为是感染性前列腺炎的主要致病菌,其后发现革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌都可以导致前列腺炎。20世纪50年代,发现无细菌感染的前列腺炎[5];60年代后期,Meares等[6] 提出了下尿路感染定位诊断的“四杯法”,并被视为确定前列腺炎细菌感染的金标准。

多数学者对于慢性前列腺炎的细菌性病因探讨只是用细菌培养方法进行的。培养法阳性率较低,根据报道在5%~10%左右[5]。本研究中,实验组对慢性前列腺炎的EPS或VB3细菌培养阳性率为6.9%,与Collins [5]报告的结果相似。实验中培养法阴性的病例中有23例PCR法得到了阳性结果,占培养法阴性的42.6%,与Nikel[2]的实验结果相似。考虑这种变化与培养技术密切相关,因为不正确的细菌培养技术或潜在不易培养的微生物,常规方法不易检出[7-8],而基于16SrRNA基因的PCR法不受细菌变异及应用抗生素的影响。同时我们以30例非前列腺炎的前列腺液标本作为对照,检测其前列腺液标本只有3例PCR结果为阳性,结果显示实验组和对照组之间有显著性差异,可以推测实验组检测到的细菌大部分为慢性前列腺炎的致病菌,而非生殖道寄生菌。实验结果表明培养法作为临床区分慢性细菌性前列腺炎和慢性非细菌性前列腺炎的唯一标准,有失客观。

总之, PCR检测细菌16SrRNA基因可以推广发展成一种快速、高效诊断慢性前列腺炎的方法并指导临床用药,如能在实际操作中避免污染的问题,不断修正和完善,该方法可能会有更广泛的推广价值。

参考文献

1. Shoskes DA. Use of antibiotics in chronic prostatitis syndromes. Can J Urol 2001;8 Suppl 1:24-8.

2. Nickel JC,Downey J,Johnston B,et al. Predictors of patient response to antibiotic therapy for the chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome: a prospective multicenter clinical trial.J Urol 2001;165(5):1539-1544.

3. 尚士强,洪文澜,俞惠民,等. 16SrRNA基因PCR加反相杂交技术检测细菌DNA.中华传染病杂志.1999,17(1):30-32.

4. McCabe KM,Khan G, Yao-Hua Z, et al. Amplification of bacterial DNA using highly conserved sequences: automated analysis and potential for moleculovr triage of sepsis. Pediatrics,1995,95:165-169.

5. Collins MM, Stafford RS, O’Leary P, et al. How common is prostatitis? A national survey of physician visits . J rol , 1998, 159:1224-1228.

6. Meares EM, Stamey TA. Bacteriologic localization patterns in bacterial prostatitis and urethritis. Invest Urol,1986,5:492-518.

7. Nickel JC. Prostatitis: Lessons fron the 20th Century[J].BJU Int, 2000,85(2):179-185.

8.Keieger JN, Jacobs R, Ross SO. Does the chroni prostatitis/pelvic pain syndrome differ from nonbacterial prostatitis and prostatodynia[J].J Urol,2000,164(5):1554-1558.

鹿占鹏
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