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邱文娟 三甲
邱文娟 主任医师
上海新华医院 儿童内分泌遗传科

糖原累积病II型(pompe病)的酶学诊断新方法的建立

以下论文发表于《中华儿科杂志》2010年1月,48(1):55-59

 

 

糖原累积病II型(pompe病)诊断

酸性α-葡萄糖苷酶活性测定平台的建立及临床应用上海交通大学医学院附属新华医院儿童内分泌遗传科邱文娟

 

邱文娟 王霞 王瑜  叶军  韩连书 张惠文  顾学范

 

【摘要】 目的  建立干血滤纸片和白细胞酸性α-葡萄糖苷酶(GAA)活性测定方法及正常参考值,用于糖原累积病Ⅱ型(GSDⅡ)患者的酶学诊断。方法  利用GAA特异性水解荧光底物4-MUG的原理,采用阿卡波糖抑制其同功酶,建立干血滤纸片(DBS)和白细胞测定GAA活性方法。取700例DBS样本和100例白细胞样本作为正常对照建立DBS和白细胞测定GAA活性正常参考值,并对临床疑诊4例患者及其父母进行GAA活性测定。结果  DBS法具有良好的精密度,室温或低于室温保存至少4周对干血滤纸片GAA活性无明显影响。正常新生儿和儿童-成人DBS的GAA参考范围分别为8.92~60.03 pmol/(punch•h)和8.00 ~37.43 pmol/(punch•h);正常人白细胞GAA参考范围:12.56~50.26 nmol/(mg蛋白•h),共检出4例GSDⅡ型患者。结论  DBS法测定GAA活性具有敏感、快速、高通量等特点,适于GSDⅡ型高危人群筛查和诊断;白细胞法测定GAA活性也具有快速、特异性高等特点,适于患者的确诊。

【关键词】 糖原贮积症Ⅱ型;葡聚糖1,4-α葡萄糖苷酶;干血滤纸片;白细胞

糖原累积病Ⅱ型(glycogen storage disease typeⅡ, GSDⅡ,MIM 232300),又称Pompe’s disease, 由于溶酶体的酸性-α-葡萄糖苷酶(acid α-glucosidase, GAA, EC 3.2.1.3)先天性缺陷, 导致溶酶体中糖原分解障碍并过度贮积在肌肉等组织所致的一种溶酶体病。根据起病时间和疾病进展可分为2种亚型:婴儿型和迟发型。婴儿型生后数月内出现心肌肥厚和严重肌无力,进展迅速,常于1~2岁内死亡。迟发型常在青少年期或成年期出现进行性肌无力和呼吸困难[1]。GSDⅡ型患者临床表现不特异,酶学检测是其诊断重要依据。2004年后采用阿卡波糖消除同功酶-麦芽糖苷酶(MGA)的干扰,使测定GAA的准确性和特异性有了显著提高[2-3],2006年美国FDA正式批准基因重组的酸性-α-葡萄糖苷酶(MyozymeR)治疗婴儿型患者,显著延长了患儿生存时间,故早期诊断及干预是达到最佳疗效的关键[1]。国外提议将该病列入新生儿疾病筛查项目[3],中国台湾于2005年-2007年筛检了13万新生儿干血滤纸片GAA活性,诊断出4例GSD Ⅱ型[4]。2007年8月-20 09年3月,我们建立了阿卡波糖抑制剂作用下的干血滤纸片和白细胞测定GAA活性的方法及正常人参考范围,并检出4例GSDⅡ型患者,报告如下。

 

对象和方法

一、对象

为建立干血滤纸片测定GAA活性(简称DBS法)的正常人参考范围,收集DBS样本共700例(年龄范围):新生儿组200例(生后3 d),标本来自本院新生儿疾病筛查中心,存放于-20℃,常规新生儿疾病筛查四项:葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性,促甲状腺激素水平,苯丙氨酸浓度,17-羟孕酮水平均在正常范围,提示DBS标本质量好。儿童组270例(1~15岁)、成年人组230例(16~55岁);来自正常健康体检的儿童和成人,标本采集后阴干,立即存放于~80℃,由于检测费用关系,未作新生儿疾病筛查四项检测评定样本质量。

为建立白细胞测定GAA活性(简称白细胞法)的正常人参考范围,收集正常人外周血白细胞样本共100例:婴儿组(2个月~1岁)13例、儿童组(1~15岁)36例、成年人组(16~55岁)51例;该100例白细胞标本来自正常健康体检的儿童和成人,抽取静脉血后,4℃分离白细胞并-80℃冻存。为确认白细胞样本质量,所有样本首先进行溶酶体酶β-半乳糖苷酶活性测定并确认β-半乳糖苷酶活性在正常范围。

临床疑诊GSDⅡ型患者共4例:例1,生后4个月表现为肥厚性心肌病、呼吸困难和肌无力,肌酸激酶(CK) 674 U/L,肌酸激酶同工酶(CK-MB) 548 U/L,肌活检病理提示有糖原贮积。患儿同胞姐姐因呼吸衰竭1岁死亡。因患儿病重,仅采集患儿及父母DBS快递送至我单位,无白细胞标本。例2,生后5个月表现为心肌肥厚、呼吸困难和肌无力,CK 1203 U/L ,CK-MB 45 U/L,患儿同胞哥哥因心功能衰竭生后8月死亡。例3,15岁时出现肌无力,肌活检病理提示有糖原贮积,仅有外周血白细胞标本,无DBS标本。例4,30岁时因行走困难就诊,CK 834 U/L 、CK-MB 37 U/L,肌电图提示肌源性损害,肌活检病理提示有糖原贮积,患者两个同胞哥哥分别于39岁和27岁因呼吸衰竭伴肌无力死亡。GAA基因检测发现例2携带突变为E579K和 W738X;例3携带突变为M408L 和W746X,2个错义突变为已报道致病突变[5-6]。例1,2,4父母作为杂合子进行GAA活性测定。

本研究经本院伦理委员会同意,所有检查均经患者和父母知情同意。

二、  GAA活性测定方法

1. DBS法GAA活性测定 :参照Chamoles和Zhang的方法[2,7],打孔器取直径3 mm血片,置于深孔板内,加入360 μl超纯水,震板仪(Wallac ,芬兰)上震荡洗脱1 h,取50 μl DBS洗脱液,加入10 μl 80 μmlo/L阿卡波糖(pH 3.8, 40 mmol/L醋酸钠缓冲液配制,终浓度8 μmol/L)、40 μl 70 mmol/L 4-甲基伞型酮-α-D-吡喃葡萄糖苷液(4MUG, Sigma #9720),37℃反应20 h后, 加入200 μl EDTA缓冲液(pH 11.3,0.15 mol/L)终止反应,时间分辨免疫荧光检测仪(Wallac,芬兰)在激发波长355 nm,发射波长420 nm条件下扫描荧光强度。每组均加入空白对照。

2.DBS法精密度实验:取5例正常成人干血滤纸片,每天对每例样本的6个血片进行测定,连续测定8d,计算批内变异系数和批间变异系数。

3.DBS标本GAA酶稳定性实验:取5组(n=15)正常成人DBS样本,分别置于-80℃、-20℃、4℃、室温、37℃,在保存的第0、3、7、14、21、28 d分别测定5组GAA活性,观察GAA活性变化。

4.白细胞法GAA活性测定 :采用细胞超声粉碎仪冰浴中粉碎白细胞,60 w 3次,每次10 s,制备白细胞匀浆。参照文献[3,8],在EP管内加入50 μl白细胞匀浆、10 μl 100 μmol/L阿卡波糖(pH 4.3、0.2 mol/L柠檬酸盐缓冲液配制,终浓度9 μmol/L)、50 μl 6 mmol/L 4-MUG (10% 2-甲氧乙醇/0.2 mol/L柠檬酸缓冲液配制),37℃水浴反应1h后,加入1.25 ml甘氨酸碳酸钠缓冲液(pH 10.3、0.17 mol/L)终止反应,测定荧光强度。BCA试剂盒(Pierce,美国)测定样本蛋白浓度。每组均加入空白对照。

5.β-半乳糖苷酶活性测定[9]:EP管内加入10 μl上述白细胞匀浆、20 μl 1 mmol/L 4-MU-β-D-半乳糖苷(0.1 mol/L NaAC/0.1 mol/L NaCl缓冲液配制 PH 4.3),37℃水浴反应1h后,加入200μl Na2CO3 /NaHCO3缓冲液(pH 10.7,0.5mol/L)终止反应,测定荧光强度。每组均加入空白对照。

6.阿卡波糖对GAA活性测定的影响:

按上述方法取同一正常人白细胞匀浆,分别加入终浓度为5、10、20、40、60、80、100μmol/L的阿卡波糖,观察不同浓度阿卡波糖对GAA活性测定的影响,对照样本取超纯水代替阿卡波糖。

7.GAA活性计算公式和统计学分析:

GAA活性(DBS法,pmol/(punch•h))=荧光浓度X反应体积X7.2/20

GAA活性(白细胞法,nmol/(mg蛋白•h))=荧光浓度X反应体积/蛋白量

采用SPSS16.0软件进行统计分析,首先对实验数据进行正态性分布检验,符合正态分布的数据用±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用Student Newman Keuls(SNK)检验;偏态分布资料用百分位数表示,多组间比较采用Kruskal-Wallis(K-W)检验分析,两两比较Mann-Whitny U(M-W U)检验。取P2.5、P97.5做正常参考范围上下限(95%可信区间)。

 

       一、阿卡波糖对GAA活性测定的影响 

观察不同浓度阿卡波糖对其GAA活性测定的影响,当阿卡波糖终浓度为5~10 μmol/L时,对GAA活性影响甚微,而对MGA抑制效应最大。故后续实验的DBS法和白细胞法中阿卡波糖终浓度分别选用8 μmol/L和9 μmol/L。

2. DBS法精密度实验:DBS法测定GAA活性的批内变异系数7.80%、批间变异系数9.20%,提示该方法具有较高的精密度。

3.DBS法稳定性实验:保存于-80℃、-20℃、4℃、室温、37℃的5组DBS样本6个时间点GAA活性结果,见表1,单因素方差分析发现前4组样本在不同时点的GAA活性的差异无统计学意义;SNK检验发现保存在37℃样本,自第14天起其GAA活性与第0、3、7天的差异有统计学意义,并且GAA活性随时间延长逐渐下降。

表1  不同保存温度和时间DBS的GAA活性(pmol/(punch•h))(n=15,±s

 

第0天

第3天

第7天

第14天

第21天

第28天

F

P

-80℃组

17.99±5.90

17.45±5.32

18.58±5.94

21.55±6.22

20.94±6.27

21.53±6.95

1.31

0.27

-20℃组

17.99±5.90

17.26±4.99

18.85±5.40

21.30±6.09

20.30±6.59

20.71±5.87

1.07

0.39

4℃组

17.99±5.90

18.73±6.16

16.47±4.98

20.38±6.00

21.08±5.41

19.66±6.35

1.17

0.33

室温组

17.99±5.90

18.82±4.45

17.05±3.14

16.98±4.95

18.50±4.95

17.37±5.05

0.36

0.87

37℃组

17.99±5.90

17.60±4.13

15.50±5.16

13.41±3.87

10.35±3.52

7.05±2.36

13.94

0

F

 

0.3

1.11

5.62

9.63

15.91

 

 

P

 

0.88

0.36

0.01

0

0

 

 

 

4. DBS法正常人参考值范围 :M-W U检验发现新生儿组和儿童组、成年人组的差异有统计学意义,儿童组和成年组间的差异无统计学意义,故分成新生儿组和儿童-成年人组分别建立其参考值范围,新生儿组的P2.5、P50、P97.5值分别为8.91、27.09、60.04 pmol/(punch•h),采用P2.5 和P97..5作为其正常参考范围上下限,即为8.92 ~ 60.03 pmol/(punch•h);儿童-成年人组的P2.5、P50、P97.5值分别为6.67、16.05、37.39 pmol/(punch•h),正常参考范围为8.00 ~37.43 pmol/(punch•h)。

5.白细胞法正常人参考值范围:测定100例白细胞样本的溶酶体β-半乳糖苷酶活性为144.53~262.12 nmol/(mg蛋白•h),均在正常参考范围内(118~413 nmol/(mg蛋白•h))[9],提示白细胞样本质量良好。K-W检验发现3组白细胞样本GAA活性差异无统计学意义,故合并计算。白细胞法GAA活性的P2.5、P50、P97..5分别为12.56、21.86、50.26 nmol/(mg蛋白•h),其正常人参考范围为12.56~50.26 nmol/(mg蛋白•h)。

6.GSDⅡ型患者及杂合子GAA活性 :DBS法测定结果显示,3例患者GAA活性均低于检测限,与正常对照组之间无交叉;6例患者父母即杂合子的GAA活性能测得出,但位于正常对照P5以内,提示DBS法可明确区分患者和正常人,但不能区分杂合子和正常人。白细胞法测定结果显示,3例患者GAA活性显著低于正常对照组,其中患儿2的GAA活性最低,结合起病时间和临床症状,诊断患儿2为婴儿型GSD Ⅱ型,患儿3和患者4是迟发型GSD Ⅱ型。

 

 

 

GSD Ⅱ型是一种进行性致死性的代谢性肌病,肌肉组织、皮肤成纤维细胞、外周血淋巴细胞亦可准确检测GAA活性,但均具一定局限性,肌肉活检为有创性检测,不易为患者接受;皮肤成纤维细胞测定GAA活性被认为是GSDⅡ型酶学诊断的金标准[8],但从皮肤活检、细胞培养到酶活性测定至少需要数周时间;淋巴细胞分离纯度不高将导致检测的假阴性。采用阿卡波糖抑制剂下的DBS和白细胞法测定GAA活性,具有无创、准确和快速的特点,对早期确诊GSDⅡ型患者具有重要意义。

本研究所建立的DBS法测定GAA活性,批内变异在8%以内,批间变异在10%以内,可见该法具有较好的精密度。干血滤纸片存放在室温或低于室温环境4周对GAA活性无明显影响,37℃存放2周内GAA活性也基本稳定。DBS法采血和保存运输方便,对外地疑诊患者送检GAA测定提供了极大的便利性和可行性。而且从方法的精密度、标本保存条件以及其高通量检测的特点,DBS法可较好地满足新生儿疾病筛查的要求。GSDⅡ型发病率随人群和地理分布的不同有很大差异 [1,3]。由于该病临床表现不特异以及国内临床医生对其认识程度有限,迄今中国大陆对GSD Ⅱ的报道迄今仅有31例[10-14],中国大陆地区的GSD Ⅱ发病率等流行病学资料尚待开展新生儿疾病筛查后进一步明确。

本研究所建立了DBS法的正常新生儿组和儿童-成年组GAA活性的中位数分别为27.09和16.36pmol/(punch•h),新生儿组明显高于儿童-成年组。Meikle等[14]采用免疫定量法检测的澳大利牙和丹麦正常新生儿组的中位数为46.8 和45.7pmol/(punch•h),而澳大利亚成年组中位数为24.4pmol/(punch•h),Zhang等[7]报道正常成人DBS法GAA中位数为20 pmol/(punch•h),与我们的研究结果类似。由于上述研究中所涉及GSD Ⅱ型患者GAA酶活性均低于明显低于检测限,故新生儿组和儿童-成年组的正常值的差异并不影响患者的诊断与筛出。

本研究对临床疑诊的4例GSDⅡ型患者进行GAA活性测定明确了诊断。DBS法发现患者GAA酶活性均低于检测限,提示DBS法能准确区分患者和杂合子。6例杂合子酶活性与正常对照低值区有交叉,故DBS法无法区分杂合子和正常人。白细胞法测定3例患者的GAA活性,发现患者较正常人显著降低。结合进行性肌无力的临床症状和心肌肥厚、肌活检病理的检查结果,患儿2诊断为GSDⅡ型婴儿型,患者3、4诊断为GSDⅡ型迟发型。

综上所述, DBS法测定GAA活性具有敏感、快速、高通量、样本便于运输和保存等优点,适用于GSDⅡ型的新生儿和高危人群筛查和诊断;白细胞法测定GAA活性具有准确、快速、特异性高等优点,适用于可疑患者的确诊。

 

参考文献

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