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孙鹏
孙鹏 主任医师
承德市妇幼保健院 内科

解读《世界卫生组织人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》

 

   

本手册的出版由UNDP/UNFPA/WHO/世界银行人类生殖研究、发展和研究培训特别规划署及WHO人类生殖健康与研究部共同完成。

第1章  背景承德市妇幼保健院内科孙鹏

1.1  导言

鉴于人类精液检查标准化需求的日益增加,世界卫生组织于1980年首次出版了《世界卫生组织人类精液及精子-宫颈粘液相互作用实验室检验手册》。至今,该手册已改版三次,被译成多国语言。过去30年中,该手册作为全球范围内的标准被世界各地的临床及科研工作者广泛使用。

尽管前几版的发行很成功,但是随着新证据的出现,先前版本中的一些推荐指标需要被修正就变得更明显了。同时,对一些概念也需给出更多的解释和支持证据。出于上述考虑,WHO成立了编辑委员会,回顾手册中描述的各种方法,本版旨在修改、更新这些内容。由于按照先前版本中讲述的方法获取的数据不充分,某些情况下修正工作变得异常困难。有时,某些实验室可以获得的一致结果,在其他实验室却无法得以验证。鉴于这些情况,编辑委员会在对以往文献资料评估后,达成一致,统一标准。

由于需要对先前版本中讲述的方法进行更详细的描述,技术员和科学工作者们给出了补充推荐内容。因为前几版手册缺乏对细节的描述,一些实验室采用其它方法或是发展出自己的操作规程,然而他们却仍申称是按照WHO手册进行精液分析的。为了使全球范围内的比较更容易实现,第五版手册包含了更多的细节描述。当提出不同的分析方法时,手册中对原由做了解释。参照该手册在发表论文中报道实验结果时,我们推荐各个实验室要指明所采用的是哪一种方法。

1.2  第5版

第5版包含三部分内容:精液分析(第2-4章),精子制备(第5、6章)及质量评估(第7章)。第Ⅰ部分介绍精液分析,参照先前版本,但被分为三个小章节:标准化方法(介绍决定精液质量的常规操作流程);可供选择的试验(这些试验用于某些特定情况下或由实验人员选择);研究试验(这些试验目前不作为精液常规分析的方法)。由于通常在男科学实验室不能开展精液培养,因此这些内容仅在无菌化精液标本采集部分提及。精子制备章节的内容从射出精液扩展到对睾丸和附睾获得精子的制备。本手册中散在分布的方法学注释框有注解(方法学解释)、评论(结果解释)以及说明框(包括补充解释的物质)。

第5版手册的主要特点如下所列:

1精液分析章节包括涉及工作溶液的配制、操作流程、精子计数及对结果解释的详细描述,以使所有给出的方法学都非常完整,与手册中其它章节内容的重叠极少。

2 扩展了精子制备部分的内容,增加了关于精子冷冻保存的新章节。与宫颈粘液分析相关的操作规程被分到可供选择的试验章节及附录中粘液特征的检查部分。

3 与先前的版本相比,第五版的附录内容减少。这部分内容仅限于特殊的或者很少被用到的信息。

4 精子数目的评估。对于一份精液标本的检查,精液的稀释度和评估精子数目所需观察的计数池区域的大小均有所改变,每次需计数200条精子。新版手册中强调了抽样误差的重要性及计数结果的确定性。编辑委员会认为每次排精的总数目比精子密度能更准确的评估睾丸功能,但这要求对精液量的测定需准确无误。

5无精子症的评估。这尽管表面看起来简单,但很多因素会影响无精子症的诊断,包括计数太少数目精子导致的明显误差,观察显微镜视野的数目,以及检验布满碎片精子沉淀物的困难度。本手册推荐改为检验固定后、未离心的标本,以及指出所用计数方法的灵敏度。然而,当需收集足够数目的精子用于治疗时,离心方法仍是必需的。另外,手册中也介绍了通过检验未固定标本中的活动精子以评估输精管切除术疗效的方法。

6精子活力的评估。第五版与先前版本的主要不同在于对精子活力的分级。目前推荐精子活力被分为前向运动、非前向运动的不动精子(而不再分为a, b, c和d级)。

7精子形态的评估。一些实验室仅仅评估正常精子的比例,然而有些人认为形态异常的类型、部位及程度更加重要。

8 质控。此章第五版为重新编写。精液分析过程的健全对于精液分析严格质控至关重要。当质控结果不满意时,文中的提示和建议有助于增进实验室水平。

9参考范围和参考低值。本手册参考范围值来自12个月以内配偶获妊娠的男性的精液数据。原始数据为来自3大洲的8个国家的可生育男性的400-1900份精液样本。传统统计学方法为取双向参考区间的第2.5百分位作为阈值,低于此阈值则可认为来自不同的人群。但是,单向参考区间更适用于精液分析,因为任意参数的高值并不能对生育作出决定性的判断。第5百分位可作为最低参考值,每一参数的完全分布区间见附录1。

1.3 本手册的范围

本手册所载的方法可作为指南以增进精液的综合分析和可比性。但并非为地方、国家或全球性的实验室认证机构所必备。精液分析在临床和研究机构对男性生育功能的调节和追踪中,其对男性生育状态和精子发生的监控都是极为必要的。

缩写词

Ab  antibody  抗体

AI  artificial insemination 人工授精

AID  artificial insemination with donor semen  供精人工授精

AIH  artificial insemination with husband’s semen  夫精人工授精

ALH  amplitude of lateral head displacement 头侧摆振幅

ANOVA  analysis of variance 变量分析

APAAP  alkaline phosphatase: anti-alkaline phosphatase complex 碱性磷酸酶: 抗碱性磷酸酶复合物

AR   acrosome-reacted  顶体反应

ART  assisted reproductive technology  辅助生殖技术

ASA  anti-sperm antibody  抗精子抗体

BCF  beat-cross frequency (Hz) 交打频率

BSA  bovine serum albumin 牛血清白蛋白

BWW  Biggers, Whitten and Whittingham试液

CASA  computer-aided sperm analysis 计算机辅助精子分析

CASMA  computer aided sperm morphometric assessment 计算机辅助精子形态评估

CBAVD  congenital bilateral absence of the vas deferens 先天性双侧输精管缺失

CD  compact disk 压缩盘

CD  cytoplasmic droplet 胞质小滴

CD45  cluster of determination 45 (pan-leukocyte marker) 决定簇45 (全白细胞标记物)

CD46  cluster of determination 46 (acrosomal antigen) 决定簇46 (顶体抗原)

CI  confidence interval  可信区间

CL  confidence limits   可信界限

CO  carbon dioxide 二氧化碳

DMSO  dimethyl sulfoxide 二甲基亚砜

DNA  deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸

DPBS  Dulbecco’s phosphate-buffered saline  Dulbecco’s磷酸缓冲盐溶液

DVD  digital versatile disc 数字多用盘

EDTA  ethylenediamine tetra-acetic acid 乙二胺四乙酸(依地酸)

EQA  external quality assurance 外质量保险

EQC  external quality control 外质量控制

ERC  excess residual cytoplasm 残余胞质

FITC   fuorescein isothiocyanate

FMLP  formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸

GIFT  gamete intrafallopian transfer输卵管内配子移植术

GPC   glycerophosphocholine

H2O2  hydrogen peroxide 过氧化氢

HBSS  Hanks’ balanced salt solution  Hanks’平衡盐溶液

HBV  hepatitis B virus 乙肝病

hCG  human chorionic gonadotrophin 人绒毛膜促性腺激素

HCV  hepatitis C virus 丙肝病毒

HIV  human immunodefciency virus 人免疫缺陷病

HOP  hamster oocyte penetration 仓鼠卵穿透

HOS  hypo-osmotic swelling 低渗肿胀试验

HPF  high power field 高倍视野

HRP  horseradish peroxidase 辣根过氧化物酶

HSA  human serum albuminxiv 人血清白蛋白IV

HTF  human tubal fuid 人输卵管液

IB  immunobead 免疫珠

IBT  immunobead test免疫珠试验

ICSI  intracytoplasmic sperm injection 胞浆内精子注射

Ig  immunoglobulin 免疫球蛋白

IM  immotility 不动

IQC  internal quality control 内质量控制

IU  international unit 国际单位

IUI  intrauterine insemination 宫腔内人工授精

IVF  in vitro fertilization 体外受精

KRM  Krebs-Ringer Medium  Krebs-Ringer培养液

LIN  linearity 线性

LLQ  lower limit of quantifcation 定量下限

LPF  low power field 低倍视野

MAD  mean angular displacement 平均角位移

MAI  multiple anomalies index 复合异常指数

MAR  mixed antiglobulin reaction 混合抗球蛋白反应

NA  numerical aperture数值孔径

NP  non-progressive (motility) 非前向的(活力)

PBS  phosphate-buffered saline 磷酸缓冲盐溶液

PDCA  plan, do, check, act

PMA  phorbol 12-myristate 13-acetate  (12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐

PMSG  pregnant mare serum gonadotrophin 孕马血清

PNPG  p-nitrophenol glucopyranoside 对硝基苯酚吡喃葡萄糖苷

PR  progressive (motility) 前向的(活力)

PSA  Pisum sativum agglutinin 碗豆凝集素

QA  quality assurance质量保险

QC  quality control 质量控制

RCF  relative centrifugal force 相对离心力

RI  refractive index 屈光指数

RNA  ribonucleic acid 核糖核酸

ROS  reactive oxygen species 活性氧类物质

rpm  revolutions per minute 每分钟转速

SD  standard deviation 标准差

SDI  sperm deformity index 精子畸形指数

SDS  sodium dodecyl sulfate十二烷基硫酸钠

SE  standard error 标准误

SOP  standard operating procedure 标准操作流程

STR  straightness (VSL/VAP) 直向

TBS  Tris-buffered saline  Tris缓冲盐溶液

TGG  Tyrode’s glucose glycerol

TZI  teratozoospermia index 畸形精子症指数

VAP  average path velocity 平均轨道速率

VCL  curvilinear velocity 曲线速率

VSL  straight-line (rectilinear) velocity 直线速率

WHO  World Health Organization 世界卫生组织

WOB  wobble (VAP/VCL) 摆动

2.1 简介

正常精液是一种混合物,在射精时由睾丸和附睾的分泌液及悬浮其中的精子与前列腺、精囊腺和尿道球腺的分泌物混合而成。最终射出的混合物是一种粘稠的液体,即射出的精液以团块状连续数次射出,通过输精管切除术前后的比较显示,就体积而言有90%是自附属腺体的分泌物,其中主要是前列腺和精囊腺,少部分来自尿道球腺和附睾。

精液的两个主要量化指标:

1.精子总数,反应睾丸的生精状况和睾丸后管道系统的通畅程度。

2.体积反应腺体的分泌能力。

精子功能组要受精子自身的活力、运动、形态和精浆成份的影响。

在性交排精时,最初富含精子和前列腺液部分的精液可能和延续在阴道中宫颈粘液丝相互接触,而其余部分在形成而在实验留取标本时,全部精液留取在一个容器中,精子限在由精囊腺分泌蛋白导致的凝块中,随后在前列腺分泌的酶作用下而水解。

有证据表明精液样本质量的变化与取样方式和地点有关,通常在家里用性交法留取的质量较高,说明不同排精方式明显影响样本的检验结果。

在固定条件下精液样本质量主要受睾丸生精功能、附属腺体的分泌、近期患病情况尤其高热性疾病,以及其它如禁欲时间的长短,这些在解释监测结果时都应考虑进去。

精液质量分析结果主要受以下因素的影响:

1.样本收集是否完整。射精时前面富含精子部分的精液避免丢失,后面部分精液主要是由精囊腺的分泌物构成,所以,前面部分精液的丢失比后半部分丢失对精液分析结果影响更大。

2.在射精时,附属腺体分泌物冲淡含高度浓度精子的附睾液。精子浓度不能直接反应睾丸的精子产量,因为还受其他生殖器官功能的影响,而精子总数(精子密度X精液体积)精子密度对于年轻人和老年人没有区别,但精子总数可能存在差异,至少人群中有部分人存在随着年龄增大而精液体积和精子下降的现象。

3.精子的活力和染色体不受禁欲时间长短的影响,除非附睾功能受到影响。由于前次射精不彻底,附睾没完全排空,有部分精子残存,精子老化会影响精子质量,其程度很难确定,所以也很少做考虑。

4.睾丸体积的大小不仅能反应睾丸的生精水平还影响到每次射精的精子总数和精子形态。

 注释:精液质量的巨大生理变化是上述所列多种因素的反映(Castilla等., 2006),因而同精液相关的所有分析都要精确全面。

 这些多变的非可控因素解释了众所周知的个体精液成分的变化。 图2.1 显示了参与一个雄性激素避孕药研究的安慰剂组的5名年轻志愿者,根据WHO推荐的方法的精液评估结果,其精液成分是伴随时间发生变化的。这一变化表明要对精液分析进行如下说明:

1.仅凭一次精液检查不能确定精子质量。

2.检查两到三次有助于获得可靠的基本数据。

虽然对整个精液样本进行了分析,但其结果并不能确定那些少数到达受精部位精子的受精能力,精液分析能为临床提供有关患者个人状况的一些重要信息。

样本的采集和检查都按照规范化程序进行,其结果才有价值。本章所述操作流程被认定为进行精液评估的基本组成步骤。

精液分析包括以下几个步骤(在以后章节中详述):

【在最初五分钟】

将受精精液样本容器放置在温控台或水浴箱里(37)等待液化。

3060分钟期间

评估精液的液化情况和物理性状。

测量精液体积。

如有需要则检测精液的pH值。

准备湿片观察显微镜下精子的活动情况,计数时还需进行稀释。

如活动精子较少,需评估精子活动率。

制作精液涂片评估精子形态。

对精液进行稀释后做精子密度评估。

对精子进行计数。

如有需要可进行抗免疫珠混合反应检测。

如发现圆形细胞则可检测过氧化酶阳性细胞。

如有需要可对精子做免疫珠试验的准备。

如需检测精浆生化指标则对精液进行离心。

【在三小时内】

将精液样本送至微生物检验室(如有需要)。

【四小时后】

对精液涂片进行固定、染色以备精子形态学检查。

【在当日稍后(如冷冻样本则可在次日)】

检查附属腺体功能的指标。

进行间接免疫珠试验检测(如有需要)。

2.2 样本采集

2.2.1 准备

为了减少外界温度和样本收集到检测期间过长对精液检测结果的影响,样本采集应在靠近实验室比较私密的房间里进行。缩短样本从采集到检测的间隔时间,标本采集时间应为禁欲至少两天,最长不超过七天。如需复查每次禁欲的天数应尽可能恒定。

给患者一个明确的书面或口头有关采样指导说明,应该强调样本收集必须完整,如有样本丢失及时告诉医生。

在报告中应包括如下信息:患者姓名、出生日期、禁欲时间、采样日期、样本是否完整、采样是否困难及从采样到检测的间隔时间。

2.2.2 为了诊断和研究目的样本采集

应用手淫的方法取精液,并射入一干净的、广口的玻璃或塑料容器中。应通过实验证实容器对精子没有毒性作用(见框 2.1)。

盛有精液的容器应放置在20~37℃环境中,以免温差变化影响精子活力,容器必须标明受检者姓名(和/或身份证号码)以及标本采集的日期和时间。

将盛有精液样本的容器置于恒温台或水浴箱中,等待其液化。报告中应注明样本采集是否完整,尤其富含精子的射精最初部分。如有丢失应在禁欲2~7天后再次采集作进一步检测。

评述2.1 精液收集管兼容性的判定

选取若干精子浓度高且精子活力佳的精液样本。每份标本的一半置入已知无毒的容器(对照)内,另一半置入待测容器。室温37℃下,在4小时内每隔1小时重复评估精子活力(见2.5章)。如果每一时间点对照容器和待测容器间无差异(配对t检验P>0.05),则待测容器可以被认定为无精子毒性,因而符合精液收集器具的标准。

2.2.3 用于辅助受孕的精液样本的消毒

对于用来临床诊断,但收集样本容器、吸头及用来混匀的吸管同样要进行消毒。

2.2.4 对要进行微生物检测精液样本的采集

这时,必须要避免来自精液以外的污染(外周皮肤)收集样本容器、吸头及用来混匀的吸管同样要进行消毒。

患者需按下列步骤进行:

排尿;

用肥皂清洗手和阴茎;

冲去残留肥皂;

用一次性毛巾擦手和阴茎;

射入干净的容器中。

注:精液样本的收集和实验室显微生物操作开始的时间间隔不可超过3小时。

2.2.5 家中样本采集

对于除了在自家以外的环境下取精的确困难者,可以在家中进行样本采集。

给患者以明确的书面或口头形式的有关精液样本的采集和转运指导说明,应强调采集样本必须完整,如有部分丢失应在报告中加以说明。

对已标上姓名和身份证号的容器进行称重,然后交给患者。

患者应记录采集的时间,并在一小时内送至实验室。

在送至实验室途中样本应保持在20~37℃的环境中。

报告中应注明样本采集的地点是在家还是在其他实验室以外的地方。

 2.2.6 用避孕套采集样本

对通过手淫法采集精液困难的情况下,才采用避孕套通过性交法获取精液。

只能用经特殊设计对精子没有毒性的避孕套来采样,这种避孕套现已有售。

应告知患者使用避孕套方法以及如何将样本转运至实验室。

应记录样本采集的时间,并在一小时内送至实验室。

在送至实验室途中样本应保持在20~37℃的环境中。

报告应注明样本的采集是在利用避孕套通过性交法及采集地点。

注:一定不可使用普通避孕套收集精液,因为它们一般含有干扰精子活力的成分 (Jones 等, 1986).

注释 1: 体外射精不是精液收集的可靠手段,因为含有大量精子的精液初始部分可能遗失。而且,这可能造成样本的细菌性或真菌性污染,且阴道内的酸性环境会对精子活力造成不利影响。

注释2: 如果患者无法提供精液样本,性交后试验(见3.3.1节)可能会提供其精子情况的相关信息。

2.2.7 样本的安全处理

精液样本可能含有害的病原体(如乙肝病毒、HIV),应作为生物污染物处理,如是为了宫腔内人工授精、体外受精、单精子胞浆内注射、培养,注意消毒应严格按照附录2中安全处理指南进行,实验室试验应以安全为基础。

2.3  初步肉眼观察

精液液化后经简单观察应立即进行检查分析,最好在30分钟内完成,不要超过一个小时。以免水分丢失或温度的变化而影响精液质量。

2.3.1 液化

精液射入容器后立即形成典型的半透明凝块,室温下在数分钟内,精液通常开始液化(变稀),此时可以看到不均匀的凝块在液体中。随着继续液化,精液将变成均匀的水样物,最后只看到很小的凝块,室温下一般在15分钟内通常都能完全液化,很少超过60分钟。如在60分钟内没完全液化,应记录这种情况,在家或利用避孕套采集的样本通常在送达实验室时都已液化。正常精液可以含有不液化的胶冻状颗粒,这一现象似乎没有任何临床意义。粘液丝的出现可能干扰精液分析。

注1:液化可以通过宏观(如上所述)和微观两方面来断定。固化精子可通过精液液化而获得运动能力。如果在显微检测中观察到固化精子,则需更多时间以保证液化过程的完成。

注2:在液化过程中,持续轻柔的混匀或旋转样本容器可以降低精液密度测定过程中的误差。

注3:如果精液在30分钟内未液化,不要进行任何精液分析,而应再等待30分钟。如果在60分钟内精液仍未液化,则参照2.3.1.1节进行处理。

2.3.1.1 液化延迟

偶有精液不液化,需另行处理,机械混匀或用酶消化可能是必要的。

1.加入等量的培养液(如杜氏磷酸盐缓冲液, 详见附录4,A4.2节),然后重复用加样器吹打也可以使某些样本液化。

2.用带有规格为18或19号注射针头的注射器对精液进行反复抽吸6~10次。

3.用菠萝蛋白酶或糜蛋白酶(EC 3.4.22.32)的消化作用可以促进精液液化(见框2.2)。制备方法为10IU/l的菠萝蛋白酶置入杜氏磷酸盐缓冲液(见附录A4.2)

4.对液化确困难的精液,可以将样本与酶按比例(1:2)进行混匀置于37℃水浴箱内10分钟,即可液化,再做进一步检测。

注释:这些处理可能会影响到精浆的生化性质,精子活力以及精子外形,如有使用必须记录。用菠萝蛋白酶以1+1(1:2)的方式稀释精液必须在评估了精子浓度后以其结果作为说明。

2.3.2 精液粘稠度

液化后,用口径约1.5 mm的塑料吸管缓慢地将精液吸入,观察在重心作用下精液形成粘液丝的长度,正常时为液滴不间断落下,异常时粘液丝长超过2 cm,也可以观察用玻璃棒插入精液提起后形成粘液丝的长度,超过2 cm即为异常,这都应作记录。部分不液化样本,表现为精液粘稠度不随时间延长而改变,对于那些高度黏稠的样本减轻粘稠的方法同处理精液液化延长相同(见2.3.1.1节)。

注释:高粘稠度会干扰对就精子活力、密度的判定以及对覆盖在精子表面的抗体和生化标志物的检测。

 2.3.3 精液外观

正常精液液化后应呈均质、灰白色的外观。

如果精子密度非常低,精液可显得透明一些。如有红细胞,精液可呈红褐色;病人如有黄疸或服用某些维生素,精液可呈黄色。

2.3.4 精液体积

精液主要是由精囊腺和前列腺的分泌物和占小部分的尿道球腺和附睾分泌物构成,体积的精确测量对评估精液非常重要,他影响精液中精子总数和非精子细胞数的计算。最佳办法是采集样本容器的称重。

用事先称重的一次性清洁容器收集样本;

给装有样本的容器称重;

减去容器的重量;

根据样本重量计算体积,假定精液密度为1 g/ml 精液密度在 1.043 和 1.102 g/ml 之间。

注:空样本容器可能具有不同的重量,所以每一容器必须提前分别称重。用不退色标记笔在容器上标明或粘贴标签标识其重量。如粘贴标签标识其重量,应在称重前即粘贴标签。

此外,可以直接测量精液体积。

将精液直接射入广口带有刻度的锥形底量筒中,器材均可从市场上购得。

从量筒上直接读取数值(精确到0.1 ml)。

注:不推荐用移液器或是注射器从标本容器中吸取样本然后注入量筒中测量体积,因该方式无法保证不损失样本,而这会导致对体积的低估。该法导致的体积损失量在0.3到0.9ml之间(Brazil 等,2004a;Iwamoto等, 2006; Cooper 等, 2007)。

注释1:低精液体积是生殖道梗阻或先天性双侧输精管缺如(CBAVD)。 同时也可能是精囊发育不良的一个表现。

注释2:低精液体积也可能是在精液收集过程中产生了问题(如损失了部分精液),也可能为部分逆行射精或有男科缺陷。

注释3:高精液体积可以反映附属性腺分泌旺盛,可能存在活动炎症的情况。

2.3.4.1  参考值下限

精液体积的参考值下限为1.5 ml(95%置信区间(CI),1.4-1.7)。

2.3.5 精液pH值

精液pH值主要反映出由精囊腺分泌的碱性液体和由前列腺分泌的酸性液体之间的平衡情况。应在精液液化30分钟后进行,无论如何不要超过1个小时,以免因CO丢失而影响检测结果,正常情况下选用范围在6.0到10.0之间的试纸。

均匀搅拌样本(见框 2.3)。

将一滴精液在pH试纸上均匀展开。

等待浸湿区域的颜色均匀一致(等候时间<30秒)。

与标准带比色读出其pH值。

注:pH试纸的准确性应该按照已知标准进行检测。对于粘稠的样本,可取小份样本用专为测量粘稠溶液设计的pH量尺进行检测。(Haugen 和 Grotmol, 1998)。

2.3.5.1 参考值

对于生育男性精液pH值的参考值尚未确定,现保持原有下限值7.2。

注释1:如低体积低精子数目的精液样本的pH低于7.0,可能存在生殖道梗阻或先天性双侧输精管缺如(CBAVD)。同时也可能是精囊发育不良的一个表现。

注释2:精液的pH值如随时间推移而升高,可能是由于自然缓冲物减少,所以高pH值不能提供有价值的临床信息。

2.4 显微镜初检

建议使用相差显微镜对所有未染色的新鲜精液标本进行检查,初检的总放大倍数为100倍(即物镜10×和目镜10×),对标本进行一般观察包括:

粘液丝;

精子凝集;

非精子细胞包括:上皮细胞、圆形细胞(白细胞和未成熟精子细胞)及断裂的精子头部或尾部,这应在总放大倍数为200或400倍的条件下进行;

评估精子活力(见 2.5节);

根据精子计数要求决定稀释倍数(见2.8节)。

2.4.1 充分混匀精液和取样

充分均匀液化的精液本身就有利于解决化验取样是误差的问题,如样本不够均匀,观察同一份精液制备两份标本有关精子活动、活力、密度及形态等结果时可能出现明显偏差,为了给生育力的评估提供可靠资料,在检测前,精液样本必须充分混匀(见框2.3),两等份的数值必须相符才可接受测量结果。两份标本经泊松分类的精子数目(见框2.7和2.10,表2.4和2.5)和其百分率的二项分布(见框2.5和2.6,表2.1)需要一致。

框2.3 充分混匀精液:

在取微量样本进行检测前,样本必须在容器内充分混匀,力度要轻柔以免气泡产生,可通过向样本中插入一个宽孔(直径接近1.5mm)的一次性无菌塑料吸液管抽吸10次来达到混匀标本的目的。不可用高速涡旋器,以免对精子造成损伤。

2.4.2 湿片的制作

充分混匀精液样本(见框 2.3);

混匀后立即取样,以免精子在悬液中沉淀;

再次取样前还需进行混匀,进行分析检查时精液体积和盖玻片的尺寸必须标准化,以保持精子在固定厚度约20µm条件下自由游动将10µl的定量精液滴在干净载玻片上;

盖上22mm×22mm的盖玻片,形成近20µm厚度,盖玻片的重量使标本均匀展开;

应注意避免在盖玻片和载玻片之间产生气泡;

对新制成的湿片,等到玻片上界面不再晃动时应尽快进行检测。

框2.4 湿片的厚度:

涂片的厚度(Dµm)是样本的体积(V,µl=mm3)除以它的液面宽度(A,mm2):D=V/A。如,体积为10µl的精液置于一张洁净的载玻片上,加盖面积为22mm×22mm的盖玻片(面积为484 mm2),则其厚度应为20.7µm;若体积为6.5µl的样本上加盖一张18mm×18mm的盖玻片(面积为324 mm2),则其厚度为20.1µm;如体积为11µl的样本上加盖一张21mm×26mm的盖玻片(面积为546 mm2),则其厚度为20.1µm;偶尔会出现大厚度的情况,如40µl的样本上加盖一张24mm×50mm的盖玻片(面积为1200 mm2),则其厚度为33.3µm;

注1: 涂片的深度小于20µm会限制精子的旋转运动(Le Lannou 等, 1992; Kraemer 等, 1998)

注2:如厚度过大,则会因为精子在视野中来回运动而难以进行精子评估。

注3:如每一视野中精子的数目差异过大,则样本可能是不具有代表性的。如出现此种情况则应重新充分混匀精液标本(见框2.3)并按照上述步骤重新制备一张涂片。

注4:欠缺代表性也可能会导致粘稠度和液化的异常(见2.3.1节),精子的聚集(见2.4.3节)或精子的凝集(见2.4.4节)。

2.4.3 精子聚集

不活动精子之间、活动精子与粘液丝之间、非精子细胞成分或细胞碎片等粘在一起,为非特异性聚集(图2.2),这种情况应如实记录。

图2.2 精液中精子的非特异性聚集

图示为精子与上皮细胞(a),细胞残渣(b)及精子(c,d)的聚集现象。

2.4.4 精子凝集

精子凝集是指活动精子以不同方式,头对头、尾对尾或混合型,如头对尾,彼此粘在一起。剧烈震荡会使精子活力过度表现,但有时由于凝集会限制精子的活动力。任何精子的头部,尾部或中段有粘附现象都应如实记录。凝集的类型(反应其程度(1-4级))和吸附状态(A-E级)也应记录(Rose 等, 1976)(见图2.3)。

一级:轻度聚集指每个凝块中少于10条精子;

二级:中度聚集指每个凝块有10到50条精子,精子运动自如;

三级:大片聚集指每个凝块有多余50条精子,精子仍然运动自由;

四级:整个精子聚集,所有精子聚集在一起彼此相互连接。又可分根据程度又可分a b c d。

注:运动的精子粘附于细胞,细胞碎片或是非运动的精子(聚集)应该记为凝集。

图2.3精子聚集程度分类表

涉及部分

聚集等级

完全分离

聚集精子数<10个,

多数精子为游离状态

中等聚集

聚集精子数10~50个,

有游离精子

高度聚集

聚集精子数>50个,

部分精子游离

完全聚集

所有精子均聚集一团,无游离精子

 1.轻度聚集指每个凝块中 少于10条精子;

2.中度聚集指每个凝块有10到50条精子,精子运动自由;

3.大片聚集指每个凝块有多余50条精子,精子仍然运动自由;

4.整个精子聚集,所有精子聚集在一起彼此相互连接。

A.头对头

B.尾对尾

C.尾端对尾端

D.混合型

E.纠结型

2.4.5 其他非精子细胞成分

精液中常含有一定的非精子细胞成分,部分与临床关系密切。通常包括泌尿生殖道上皮细胞、前列腺细胞、生精细胞和白细胞,后两种统称为“圆细胞” (Johanisson 等, 2000)。这些细胞成分在染色后的涂片中(放大1000倍)难以区别(见 2.12节, 表 13 和 14,以及2.19节)。可以通过过氧化物酶技术和全白细胞单克隆抗原技术来进行鉴别。非精子细胞成分计数用与精子相同的方法进行,或根据染片(见2.18.1.5节)中生精细胞或白细胞与精子的比例来进行计算。

2.5 精子活力分析

精子活力程度与妊娠率有关,电脑辅助法评估精子的运动性见第3.5.2节。精子活力评估应在精液样本液化后尽快(最好在30分钟之内)进行,务必在射精后1个小时之内进行。防止时间过长,因脱水、pH值及温度的变化对评估结果产生的负面影响。

过程如下:

· 将精液样本混匀。

· 拌匀后立即(防止精子沉淀)取出一等份。

· 重新搅拌精液样本的剩下部分,取出另一等份。

· 将上面的两份样本分别滴大约20µm深的湿制剂(见2.4.2节)的载玻片上。

· 等到样本停止悬浮(1分钟以内)。

· 用200或者400倍率的相差显微镜观察载玻片。

· 每个标本大概评估200个精子左右,以便算出各自不同类型精子的百分比。

· 若标本的观察值在可接受的范围,记录下数据,否则重新制作标本。

注1:该过程应该在室温或者显微镜载物台预先加热至37℃的标准试验室内进行,如果在37℃下进行评估,精液样本需要放置在37℃环境中一段时间,并且制作标本的载玻片、盖玻片也应该预热至37℃。

注2:建议采用带有网格标线的目镜以便选择观察区域,先数积极运动型精子数量,然后数非积极运动型精子数量,最后评估完全不动型精子数量。(见2.5.1节)。

2.5.1 精子活力分类

建议采用一个简单的精液运动分类方法,该方法根据精子运动功能的不同分成以下几类:

· 运动活跃型(PR):精子运动活跃、线性运动或者在较大的范围内运动(不考虑运动的速度)。

· 非运动活跃型(NP):精子运动但不活跃,如精子在较小的范围内运动,精子头部轻微移位或尽有鞭毛摆动。

· 完全不动型(IM):精子完全不动。

注1:该手册之前的版本介绍的分类方法将积极活跃型根据精子运动速度的快慢进行细分,如将在37℃下精子运动速度大于25微米/秒的定义为A等,这种方法存在的不足之处是实验人员很难客观准确的判断观察到的精子运动到底该归到哪一等。

注2:当讨论精子活动率时,细分精子的总能动性(PR+NP)和活跃精子能动性(PR)非常重要。

2.5.2 精液样本的准备和评估

 如果在37的温度下评估,提前10分钟开启恒温箱,以确保温度恒定在37

· 准备20μm深的计数板(见2.4.2节)。

· 用200或者400倍率的相差显微镜观察载玻片。

· 等到样本停止悬浮。

· 在离盖玻片至少5μm的区域内观察精子的运动(盖玻片边缘的精子运动性受到干燥物质的影响)。

· 系统性地观察载玻片以防止重复观察同一个区域,不断改变观察区域,避免基于精子活动数量多少来选择观察区域(观察区域选择应该随机)。

· 计数开始时间的选择应该随机,计数要迅速,不要等到精子游到所选区域后才开始计数。

· 评估所选区域的所有精子的活动率,区域选择最好通过目镜标线来确定,选择区域的大小应根据精液的浓度,如当精液浓度较大时,选择最上面一排网格,浓度低时,选择全部的网格。

· 计数应该迅速,避免运动精子的数量估计值比实际值多,快速计数网格内的精子,避免因计数时间过长,将计数时游进网格的活动精子也计算入内而导致估计值多于实际值。

· 首先数所选区域内的运动活跃型精子(PR),然后是非运动活跃型精子(NP),最后是完全不动型精子(IM)。根据经验,也可以同时计数一个网格内的三种类型的精子然后再数另一网格内的三种类型的精子,直到将所选区域数完。

· 通过实验室计数器的辅助完成计数。

· 每个标本至少在5个不同的区域计数,所数的精子总数应该不低于200个以避免小样本错误。

· 分别计算两个标本的PR、NP和IM比例,然后计算各自的均值和差值。

· 将计算的结果对照表2.1(在95%的置信区间内,在某一均值下,两个比例差距可接受的最大值)。

· 参照表2.1若两个比例差值在可接受范围之内,记录PR、NP和IM比例的均值,若差值过大,超过可接受范围,重新制作2个精液标本。

· 通过四舍五入记录PR、NP和IM比例均值的整数值。

注1:仅计数完整的精子(有头部和尾部,见2.7.3节)不要计数只能看见小部分的精子。

注2:活性精子计数时往往会多数,要通过改变计数顺序(如先数NP精子数或IM精子数),尽可能知到潜在影响计数的偏见(见7.13.3节)并避免它们。

注3:有时,样本不均匀,即使三个标本都不能得到可接受的差值,这时,记录下两两的均值及差值。

图2.4目镜标线对活性精子计数很有帮助(图a),系统性地选择计数区域,计数范围应该至少距盖玻片5μm(图b)。

2.1

在某一均值下,两个比例差距可接受的最大值(每个标本计数200个精子的情况下)。

 2.6关于百分比的比例值和差值处理

百分比要四舍五入成整数,若尾数是0.5则将其转换至离两者均值较近的整数,如将32.5%写成32%,而将3.5%写成4%。这些四舍五入成的百分比全部加起来可能不等于100%

对照表2.1,若两个标本PRNPIM比例的差值刚好等于可接受的最大差值,则接受该值。

若差值大于可接受的最大值,一般认为是数错了、吸取错误或者精液样本没有搅拌均匀。

当差值大于可接受的最大值时,不要采纳之前的数据,而应重新制作标本重新计数。(千万不要再做一份相同的标本,计算三个标本的平均值,或者选择数据接近的两个计算平均值)。

2.5.3 示例

1:某两份精液标本(每个标本的精子数均大于200)的精子能动性分析如下,运动活跃型精子分别占30%50%;非运动活跃型精子分别占5%15%;完全不动型精子分别占65%35%。占比例最大的为完全不动型,它们的均值为50%。对照表2.1,在均值为50%的情况下,差值大于10%,认为仅是偶然发生事件。观察值大于10%65%-35%),因此需重新制作两份标本进行评估。

2:某两份精液标本(每个标本的精子数均大于200)的精子能动性分析如下:运动活跃型精子分别占37%28%;非运动活跃型精子分别占5%6%;完全不动型精子分别占60%66%,占比例最大的为完全不动型,它们的均值为63%。对照表2.1,在均值为63%的情况下,两者差距大于10%,认为仅是偶然发生事件。观察值小于10%66%-30%),因此,接受该观察值,并记录如下:运动型精子占32%,非运动型精子占4%,完全不动型精子占63%

2.5.4 参考下限

总运动精子(PR+NP)比例的参考下限为40%95%的可信度,38-42的可信区间);积极运动精子(PR)比例的参考下限为32%95%的可信度,31-34的可信区间)。

注:一次射精的精液中的运动活跃型精子总数具有生理上的意义,它的值等于精液中的总精子数乘以运动活跃型精子的比例。

本章所述的操作在常规的精液检测中是非必需的,但在某些情况下有助于诊断和科研。

3.1 精子多重缺陷的指标

精子形态学异常的情况常常表现为多方面的异常同时发生(头部、中部、尾部或上述异常同时发生。)详细评价各种异常发生的频率远比单纯计算正常精子的百分率更有意义;特别是当涉及研究人类生精功能损伤情况时(Jouannet et al., 1988; Auger et al., 2001)。记录形态正常精子的同时记录异常是发生在头部、颈部、尾部,用这种多元评价体系(multiple-entry system)可计算出平均每个精子的异常值。这种评价精子畸形发生详细位点(头部、颈部或尾部)的多元评价系统包括三种指标:

1.多重异常指数(the multiple anomalies index ,MAI) (Jouannet et al., 1988);

2. 畸形精子指数(the teratozoospermia index ,TZI) (Menkveld & Kruger, 1996; Menkveld et al., 2001);

3. 精子畸形指数(the sperm deformity index ,SDI) (Aziz et al., 1996, 2004);

其中MAI和TZI与体内受精有关(Jouannet et al., 1988; Slama et al., 2002; Menkveld et al., 2001)。SDI与体外受精有关(Aziz et al., 1996)。此外,这些指标在评价一些病理或有毒有害环境对生育力影响时也十分有用(Auger et al., 2001; Aziz et al., 2004)。

3.1.1 多重畸形指数的计算

从头部、颈部、尾部和是否有残留的过大的胞浆小滴(当它的体积超过精子头部的1/3时)几个方面来评价精子是否存在缺陷。使用细胞计数器进行计数。计数器所需要使用的键的数目应该根据需要评价的指标数而定。如果没有计数器,则可以使用评分表。

1. MAI是每个精子出现异常数的平均值。所有的头部、颈部和尾部的畸形都应计算在内。与本手册的其它评价体系不同(见2.15.1节和2.15.2节),该指数所使用的形态评价标准应采用由David等(1975)提出,经Auger和Eustache (2000)修正的评价体系。

2.TZI与MAI相似,二者的区别在于TZI只记录每个精子的四种缺陷:头部、颈部、尾部及是否含有过大的残留胞浆小滴,而不去记录是否还存在有其它方面的异常。该指数采用本手册所推荐的形态评价标准。

3.SDI由缺陷的数目除以总精子数(而非只是异常精子数)。该指数可记录多种精子头部异常的情况,但颈部和尾部的缺陷仅作一次记录。该指数采用本手册所推荐的形态评价标准。

表3.1各种精子畸形指数的计算

 

MAI

TZI*

SDI

最大值

 

4

3

分母

异常

精子

异常

精子

所有

精子

(A)计数的精子数目

200

200

200

正常精子(N)

46

46

真诚赞赏,手留余香
孙鹏
孙鹏 主任医师
承德市妇幼保健院 内科
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