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论文精选

山东地区乙型肝炎病毒基因分型及临床意义的研究

发表者:辛崇尚 3857人已读

辛崇尚 潘兆随 马立宪

[摘要] 目的:探讨山东地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布及临床意义。方法:采用套式聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法: 对山东地区150例HBV-DNA阳性乙肝病人进行基因分型,采用基因芯片检测技术对服用拉米夫定患者的多位点变异进行检测,结合相关临床资料进行分析。日照市人民医院感染科辛崇尚

结果: 基因B型53例(35.33%),C型83例(55.33%),B、C混合型11例(7.33%),D型3(2.00%);基因型B在慢性无症状HBV携带者及低年龄组原发性肝癌中占优势(62.16%),基因型C在慢性重型肝炎(包括肝硬化)及高龄组原发性肝癌中占优势,构成比分别为49/63(77.78%)、9/12(75.00%);与基因型B相比,基因型C感染者HBeAg阳性率、肝损害程度(ALT水平)、垂直传播方面均明显增高(P<0.01),而基因型B较基因型C感染者HBeAb阳性率明显增高(P<0.01)。基因芯片检测变异显示,服用拉米夫定患者HBV基因前C区nt1896位终止突变主要见于基因型B,核心基因启动子双突变(nt1762和nt1764位点突变)常见于基因型C。结论: 聚合酶链反应-限制性片段多态性分析(PCR-RFLP)是一种比较灵敏、准确、操作简便的HBV基因分型方法;山东地区HBV基因型分布以基因型C占优势,同时存在基因型B及B、C混合感染,个别地区存在基因型D;基因型B与慢性HBV携带及低年龄组原发性肝癌的进展有关,基因型C与肝脏疾病的活动性相关,且与母婴垂直传播有关;拉米夫定引起的HBV变异与HBV基因型密切相关,不同HBV基因型对拉米夫定的治疗反应不同。

[关键词] 肝炎病毒,乙型;基因型;聚合酶链反应;多态性,限制性片段长度;基因芯片

Distribution of hepatitis B virus genotypes and its clinical significance in Shandong

XIN Chong-shang,LI Mei,PAN Zhao-sui etal.Rizhao People,s Hospital,Shandong Rizhao276800

[Abstract] Objective To understand the distribution of hepatitis B virus genotypes in Shandong and its clinical significance. Methods Nested polymerase chain reaction(nPCR)was used for amplification of HBV-DNA in 150 patients with hepatitis B from Shandong. HBV genotype was determined by using restriction fragment length polymorphism (RFLP)analysis. Detection and identification of HBV DNA YMDD motif mutation during lamivudine treatment using oligonucleotide array.Results The prevalence of genotype B was 35.33% in all samples and that of genotype C was 55.33%,mixed genotype B and C was 7.33%,while genotype D was 2.00%.The prevalence of genotype B showed an increasing trend in asymptomatic HBV carriers(ASC),in contrast ,the prevalence of genotype C showed an increasing trend in fulminant hepatic failure (FHF),including liver cirrhosis, and hepatocellular carcinoma(HCC).Vertical transmission and HBeAg positivity were higher in genotype C than in genotype B (p<0.01).The ALT value was significantly higher in genotype C than in genotype B(p<0.01). Conclusions Genotype B and C existed in Shandong ,genotype C is the major genotype in this area and associated with development of severe liver diseases and vertical transmission.The treatment effect of lamivudine is associated with the genotype of HBV.

 [Key words] Hepatitis B virus;Genotype;Polymerase chain reaction; Polymorphism,Restriction fragment length;Gene chip

    乙型肝炎已成为全球性感染的严重传染病,近年来国内外对乙肝病毒(HBV)基因亚型进行的研究显示各地病毒株有差异,根据其核苷酸序列的差异分为A-H 8个基因型[1]。人类感染不同基因型HBV可能与感染途径、疾病的感染谱及疾病的进展有一定的相关[2]。尽管HBV基因型存在一定的地理区域分布[3],但由于分析的标本有限,其结果并不完全一致。本研究应用套式PCR-RFLP技术,调查了山东地区HBV基因型的分布及其临床意义,现报告如下。

资料与方法

1.临床资料: 150例HBV感染者均为山东省各市地的门诊或住院患者,诊断标准符合1995年全国肝炎防治会议制定的标准。其中男113例,女37例,年龄8~69岁(平均37.5±14岁);HBV携带者(ASC)37例,慢性肝炎(CH)38例,慢性重型肝炎(FHF)63例(33例伴肝硬化),原发性肝癌(HCC)12例。采清晨空腹肘静脉血6ml,分离血清,于-20℃保存备检。

2.引物设计与合成:参考Naito等研究[4],由中国科学院微生物研究所检索合成,其相应序列见表1。 表1 各引物核苷酸序列引物 位置 引物序列 大小 极性外引物 2820-2837(S1) GGGACACCATATTCTTGG 18mer + 842-822(S2) TTAGGGTTTAAATGTATACCCA 22mer _ 内引物 203-221(P1) GCGGGGTTTTTCTTGTTGA 19mer + 788-768(P2) GGGACTCAAGATGTTGTACAG 21mer _

3.方法:⑴血清HBV-DNA的提取:取20ul血清加40ulDNA裂解液(Promega公司提供),在沸水中煮10min,离心后吸取上清液,-20℃保存待检。⑵nPCR:两轮nPCR按常规进行,所用试剂均由Promega公司提供。第1轮PCR反应系统组成为:待检上清液4ul,10xPCR Buffer 5ul,dNTP4ul,S1/S2引物各1.5ul,Taq酶2U,加无离子水至50ul。扩增条件:94℃预变性5min,94℃30S-55℃30S-72℃60S,循环35次。第2轮PCR反应系统组成为:取第一轮反应产物4ul,10XPCR Buffer 5ul,dNTp 4ul,p1/p2引物各1.5ul,Taq酶2U,加无离子水至50ul,扩增条件及循环次数同第1轮PCR。扩增产物经琼脂糖电泳初步鉴定粗纯后置于-20℃保存待检。⑶PCR扩增产物酶切分析:将上述扩增产物按产品说明选择限制性内切酶StyI、BsrI、HpaII、DpnI分别或组合进行酶切[5],37℃水浴2h,然后取消化产物10ul,加入20g/L琼脂糖凝胶上进行电泳,以标准分子量为参考,根据不同的电泳图谱进行RFLP分析确定HBV基因型。⑷HBV变异的检测:采用基因芯片检测[6]。

结果

1.基因型分布:150例HBV-DNA阳性乙肝患者中,基因型B53例,占35.33%,基因型C83例,占55.33%,基因型B、C混合感染11例,占7.33%,基因型D3例,占2.00%,未发现A、E、F、H等其它基因型。说明山东地区同时存在B、C型混合感染,以C型占优势。

 2.基因型与临床特征的关系:基因型B在慢性无症状HBV携带者中占优势,构成比为23/37(62.16%),基因型C在慢性重型肝炎(包括肝硬化)及高年龄组原发性肝癌中占优势,构成比分别为49/63(77.78%)、9/12(75.00%),基因型C感染者肝损害程度(ALT水平)较基因型B者为重(P<0.01);在母婴垂直传播中基因型C感染者较基因型B多见(P<0.01),性别、年龄在不同基因型患者中无显著性差异(P>0.5),见表2。表2 不同基因型的临床特征基因型 例数 性别(男/女) 年龄(岁) ALT(U/L) 传播途径(垂直/其它) 临床类型 ASC CH FHF HCC B 53 41/12 36±14 115±110 8/45 23 18 11 1 C 83 62/21 39±15 282±246 54/29 11 14 49 9 B、C 11 8/3 38±14 134±127 2/9 3 4 2 2 D 3 2/1 37±13 120±114 1/2 0 2 1 0 总计 150 113/37 37.5±14 195±183 65/85 37 38 63 12

3.基因型与HBV-M的关系:HBeAg阳性患者与HBeAb(Anti-HBe)阳性患者的基因分型构成比有显著差异(P<0.05)。基因型C感染者与基因型B感染者相比,HBeAg阳性率显著升高(P<0.01),而HBeAb阳性率在基因型B患者比基因型C患者中明显升高(P<0.05),见表3。表3 HBV基因型与HBV-M的关系(%) HBV-M 例数 B型 C型 B、C型 D型 HBeAg阳性 87 15(28.30) 63(75.90) 7(63.64) 2(66.67) HBeAb阳性 63 38 (71.70) 20(24.10) 4(36.36) 1(33.33)

4.基因型与抗病毒的治疗反应 :基因芯片检测变异显示,服用拉米夫定患者HBV基因前C区nt1896位终止突变主要见于基因型B,核心基因启动子双突变(nt1762和nt1764位点突变)常见于基因型C。

讨论

随着分子生物学水平的发展,传统的建立在蛋白质水平上的4种HBV血清分型已证实与HBV基因型不一定相符,自1988年Okamoto 等首先根据组间全基因序列差异≥8%,而对HBV进行基因分型以来,现已表明,迄今HBV已被分为至少有从A到H共8个基因型[1],不同的HBV基因型株有相对明显的地理分布,在东亚地区慢性HBV感染者中以基因B、C型为主,但各地报道其优势基因型存在一定的差异[7]。我国HBV基因南方以B型为主,北方以C型为主,D型仅见于西藏和新疆[8,9]。目前HBV基因分型的方法主要有4种,而聚合酶链反应-限制性片段多态性分析(PCR-RFLP)法是一种比较准确,操作简便的HBV基因分型方法[9]。我们采用该技术对山东地区HBV基因分型发现:山东地区以基因型C为主,其次为B型以及B、C混合型,并发现个别D型,未发现其他基因型存在,这与文献报道中国北方地区主要以C型为主结果一致。不同的HBV基因型与患者的肝脏发生不同的病变有关,乙肝病毒感染后既可表现为无症状携带者或急慢性肝炎,也可表现为暴发性肝炎肝硬化或肝细胞癌,本研究发现基因型B在慢性无症状HBV携带者及低年龄组原发性肝癌中占优势,基因型C在慢性重型肝炎肝硬化及高年龄组原发性肝癌中占优势,基因型C患者中肝损害较B型患者为重,同时发现HBeAg阳性率在基因型C患者中明显增高,而抗HBe阳性率在基因型B患者中明显升高;在母婴垂直传播方面,基因型C较基因型B患者多见。以上结果提示HBV基因型B在慢性感染者血清中由HBeAg向抗HBe的自然较换率较高,表明其预后比较好,因HBeAg的早期消失有利于阻止HBV感染者的病情向慢性肝炎肝硬化、肝细胞癌的转变,从而可以有效地降低严重肝病患者的发生率与死亡率[10]。而HBV基因型C患者的病情演变则与基因型B者相反,易于使病情加重。提示基因型C与肝脏病的活动性密切相关。不同的HBV基因型对抗HBV的治疗反应不同[11]。本研究发现服用拉米夫定患者HBV基因前C区nt1896 位终止突变主要见于B基因型,而核心基因启动子双突变(nt1762和 nt1764位点突变)更常见于C基因型。Takahashi等[12]发现nt 1653 C→T和nt1753 T→V (C/A/G)两点变异多发生于C型,意义类似于nt1762A→T 和 nt1764G→A双突变,但在HBeAg阳性病人中,nt1653 C→T 和nt1753 T→V(C/A/G)在与慢性肝炎发展为肝硬化的进展的关系比nt1762 A→T 和 nt1764 G→A更密切,可推测基因C型与慢性乙肝发展为肝硬化肝癌密切相关。本研究中高年龄组原发性肝癌大都见于C型基因患者,并且慢性重型肝炎肝硬化中C型基因患者发病率明显增高,可能与C型基因易于发生核心基因启动子双突变有关。

参考文献

1 Okamoto H,Tsuda F, Sakugawa H, et al .Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence :comparison of surface antigen subtypes.J Gen Virol,1988,69:2575-2583. 2 Mayerat C,Mantegani A,Frei PC.Does hepatitis B virus genotype influence the clinical outcome of HBV infection ? J Viral Hepatitis, 1999,6(4):299-304. 3 Mizokami M, Nakano T,Orito E,et al .Hepatitis B virus genotype assignment using restriction fragment length polymorphism patterns .FEBS Lett,1999,450:66-71 4 Naito H ,Hayashi S ,and Abe K. Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers.J Clin Microbiol ,2001 ,39:362-364 5 Yan L,Hou JL,Gou YB ,et al.Establish a new method of genotypeing of hepatitis B virus by restriction pattern analysis of S ampicon .Chin J infect Dis,2001,19(4):224-228 6 赵伟,刘伟,刘全俊,等.基因芯片检测拉米夫定治疗后乙型肝炎病毒变异.中华肝脏病杂志,2003,11(3):178-179 7 Orito E,Ichida T, Sakugawa H,et al.Geographic distribution of hepatitis B virus (HBV) genotype in patients with chronic HBV infection in Japan.Hepatology,2001,34:590—594 8 范金水,庄辉,李远贵,等.我国8城市HBsAg阳性和阴性乙肝患者的病毒血清型和基因型分析.中华微生物和免疫学杂志,1998,18:88—92 9 阎丽,候金林,郭亚兵,等.乙型肝炎病毒基因型S基因PCR—RFLP分型方法的建立.中华传染病杂志,2001,19:224-228。 10 Lindh M,Hannoun C, Dhillon AP,et al. Core promoter mutations and genotypes in relation to viral replication and liver damage in East Asian hepatitis B virus carriers .J Infect Dis,1999,179:775-782. 11 Kao JH,Chen PJ, Lai MY, et al.Hepatitis B gentypes correlate with clinical outcomes in patients with chronic hepatitis B . Gastroenterology, 2000,118:554-559. 12 Takahashi K, Ohta Y,Kanai K, et al.Clinical implications of mutations C-to-T 1653 and T-to-C/A/G 1753 of hepatitis B virus genotype C genome in chronic liver disease .Arch Virol ,1999,144:1299-1308.

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发表于:2009-06-30 22:14

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