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山东地区肾综合征出血热患者病毒基因型分布及临床意义的研究*

辛崇尚 副主任医师 日照市人民医院 感染科
2009-06-30 1102人已读
辛崇尚 副主任医师
日照市人民医院

       辛崇尚1  潘兆随1  马立宪 2 邵丽华2

      摘要  目的  探讨山东地区肾综合征出血热患者病毒基因型分布及临床意义。方法  合成型特异性引物,采用逆转录–聚合酶链反应(RT–PCR),对山东地区150例肾综合征出血热(HFRS)患者的临床标本进行扩增,结合临床资料对病毒基因型分布及临床意义进行分析。结果  基因Ⅰ型29例(19.3%),Ⅱ型109例(72.7%),Ⅰ、Ⅱ型混合感染12例(8.0%);Ⅰ型患者主要分布于沿海地区及水域地带,病情较重,肾脏损害明显,部分预后较差;Ⅱ型患者多见于内陆丘陵地区,病情较轻,肾脏损害不明显,肝脏损害多见,预后较好。结论  山东地区流行的HFRS疫区是Ⅰ型和Ⅱ型同时存在,以Ⅱ型为主的混合疫区,Ⅰ型病毒感染者病情重于Ⅱ型病毒感染者。日照市人民医院感染科辛崇尚

       关键词 肾综合征出血热;聚合酶链反应;汉坦病毒;基因分型

 

Distribution of Genotypes for HFRS in Patients and Its Clinical Significance in Shandong

Xin Chongshang ,Li Mei,et al

Rizhao People\"s  Hospital,Shandong Rizhao, 276800

        ABSTRACT Objective  To understand the distribution of genotypes of Hantaviruses and its clinical significance for HFRS in patients in Shandong.Methods  4 different sets of typespecific primers based on the unique G1 sequence M genomic segments of HTNV and SEOV were designed.Total cellular RNA extracted from clinical sample of HFRS patients in Shandong district was RT to cDNA and amplified by type Ⅰ primer or/and type Ⅱ primer.Results  The prevalence of genotype Ⅰ was 19.3% in all samples and that of genotype Ⅱ was 72.7%,mixed genotype Ⅰ and Ⅱ was 8.0%.Genotype Ⅰ was mainly distributed along the region following the line of the sea,while genotype Ⅱ along the inland area.The patients\"condition whose samples were amplified by type Ⅰprimer  was more serious than that patients whose samples were amplified by type Ⅱ primer.Conclusion  It suggested that genotype Ⅰ and Ⅱ existed in Shandong, genotype Ⅱ was the major genotype in this area. The patients\"condition of genotype Ⅰ was more severe than that of genotype Ⅱ.

        KEY WORDS  Hemorrhagic fever with renal syndrome  Polymerase chain reaction  Hantaviruses  Genotypes

 

      肾综合征出血热(HFRS)病原体汉坦病毒(Hantaviruses,HV)目前至少存在Ⅰ

~Ⅳ型4个血清/基因型,我国至少存在Ⅰ型和Ⅱ型两种典型的血清型别。我省

是HFRS的高发省,我们在对山东地区HFRS患者基因诊断分型研究的基础上,

对我省各地区HV基因型分布及其临床意义进行了后续研究,以期为HFRS的诊治提供理论指导,现报告如下。

1   资料与方法

1.1  临床资料  HFRS患者150例均为山东省各市地发病4d内的发热期住院患者,全部病例的诊断及分型标准均符合1997年卫生部制订的《流行性出血热防治方案》有关标准,且HFRS特异性抗体(IgM)阳性。其中男108例,女42例;年龄14~69岁,平均35.6岁;轻、中、重及危重型患者分别为49例、52例、31例、18例。

1.2  标准病毒株及其培养  76–118株(Ⅰ型)和R22(Ⅱ型)及Vero–E6细胞均由中国预防科学院病毒研究所提供。两株病毒常规接种于Vero–E6细胞,接种7~10d后作IFA以鉴定血清型别。细胞消化洗涤后离心沉淀,-70℃保存,以备统一提取RNA。

1.3  引物设计与合成  参考文献[1],依据病毒株M片段序列,设计了1个合成两型病毒cDNA第一链的共同引物p1及2套4个分型引物。每一病毒株cDNA理论上只能用一对同型引物扩增。引物由中科院微生物研究所检索合成,其相应位置和序列,见表1。

寡核苷酸引物序列

血清型

位置

引物序列

大小

极性

两型公用

1–16(p1

CCGGATCCTAGTAGTAGACACCGC

24mer

+

HTN(Ⅰ型)  76–118

                 

            A9

            

30–49(a2)

648–631(a3)

168–188(a10)

1230–1210(a11)

CAATCAGCAACATGGGGATA

AATATCAAAGATCCCAGT

ATGTAGAATTACCCCCCGTGC

AAAATCCCGCCTTCAGAAAAG

20mer

18mer

21mer

21mer

+

-

+

-

SEO(Ⅱ型)   R22

 

                  R36

78–101(a5)

748–726(a6)

1–   20(a8)

313 –295(a9)

AATTGGCCAAGGCTTTGCATT

TTGCTGATGTGATGGCAGTCTCT

GTGAGGGGCAAGGCAGCCAG

GGACACTTTGGTCTGGACC

21mer

23mer

20mer

19mer

+

-

+

-

 

1.4  方法

1.4.1  RNA提取  采用RNA提取试剂盒(Promega公司),待检血清加变性液裂解细胞,用酚:氯仿:异戊醇抽提,异丙醇沉淀,真空抽干,溶于无酶水中,-70℃保存备检。

1.4.2  cDNA合成  取4μl(约5~10μg)全细胞RNA,加入20pmol/L cDNA第一链共用引物p1 1μl,94℃变性3min,置冰浴,混合物再加入4μl  5×反转录缓冲液(Promega公司),2μl  0 .1mol/L DTT,2μl 10mmol/L 4×dNTP,0.5μl RNasin(40U/μl,Promega公司),2μl AMV反转录酶(10 U/μl,Promega公司),用DEPC水补足至20μl,42℃水浴1h,置-20℃。

1.4.3  PCR扩增  PCR扩增试剂均由Promega公司提供。取4μl cDNA反应液,加5μl 10×PCR缓冲液,3μl Mgcl2,DEPC水补至50μl,94℃预变性3min,取出冷却至55℃后,加入0.5μl Taq酶(5U/μl),再加入50μl石蜡油,短时离心后分层,将反应管放入DNA循环扩增仪中(美国COY公司)进行30次循环:94℃50s-55℃50s-72℃90s。最后72℃终延伸5min。

1.4.4  PCR产物电泳分析  取1/4PCR产物进行琼脂糖微胶电泳(1.5%,0.5μg/ml EB,1×TBE)。以标准分子量为参考,在紫外透射仪下观察扩增结果。

结果

2.1  实验对照  接种Ⅰ、Ⅱ型毒株及未接种任何病毒的Vero–E6细胞标本及健康人标本RT–PCR结果,见表2。

实验对照RTPCR结果

组别

份数

Ⅰ型扩增阳性

Ⅱ型扩增阳性

阳性对照

    种76–118

    种R22

    未种HV

 

10

10

10

 

10

0

0

 

0

10

0

阴性对照

    健康人

 

10

 

0

 

0

2.2  基因型分布  150例HFRS患者中,基因Ⅰ型29例,占19.3%,基因Ⅱ型109例,占72.7%,Ⅰ、Ⅱ型混合感染12例,占8.0%,未发现其它基因型。结果发现Ⅰ型患者主要分布于沿海、江河流域等水边地带;Ⅱ型患者主要见于内陆、丘岭、干旱等地带。说明山东地区同时存在Ⅰ、Ⅱ型毒株混合感染,以Ⅱ型毒株占优势。

2.3  基因型与临床特征的关系  流行病学及临床资料分析发现,Ⅰ型患者多由野鼠(尤以黑线姬鼠为主)传播,病情多较重,临床分型以重型及危重型多见,全身毒血中毒症状、毛细血管损伤程度及肾脏损害程度均较明显,病程中多表现为发热、低血压/休克与少尿期3期重叠,病程较长,并发症多,部分患者预后较差;Ⅱ型患者多由家鼠传播,病情相对较轻,以轻型与中型多见,全身毒血中毒症状较轻,肾脏损害不明显,而多以消化道症状为主,肝脏损害常见,病程中大多出现越期经过,病程较短,并发症少,预后较好。两型患者的性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅰ、Ⅱ型患者临床特征比较见表3、4、5。

Ⅰ、Ⅱ型患者主要临床症状及体征消失时间(x±s,d

组别

例数

发热

充血与渗出

肝区叩痛

全身痛及肾区叩痛

Ⅰ型

Ⅱ型

t(t´)值

p值

29

109

5.75±0.86

3.64±0.57

(12.5020)

<0.05

6.53±1.67

3.88±1.49

8.2960

<0.001

3.58±1.09

6.79±1.23

12.7758

<0.001

6.84±1.79

4.12±1.64

7.7859

<0.001

 

 

4  Ⅰ、Ⅱ型患者越期及预后情况(n,%)

组别

例数

越低血压或休克期

越少尿期

双越期

并发征

死亡

Ⅰ型

Ⅱ型

x2

P值

29

109

18(62.1)

96(88.1)

10.7816

=0.001

9(31.0)

79(72.5)

17.0272

<0.001

13(44.8)

85(80.0)

12.231

<0.001

15(51.7)

23(21.1)

10.7652

=0.001

2(6.9)

0

7.6278

<0.05

 

Ⅰ、Ⅱ型患者主要临床检验值复常时间(x±s,d

组别

例数

白细胞

血小板

血尿素氮

血肌酐

尿蛋白

Ⅰ型

Ⅱ型

t(t´)值

p值

29

109

 

7.89±1.87

4.73±1.54

9.3734

<0.001

8.12±1.69

5.04±1.23

(9.1883)

<0.05

8.96±2.63

5.19±2.33

7.5342

<0.001

8.79±2.58

5.49±2.46

6.3552

<0.001

7.47±1.85

3.86±1.74

9.7989

<0.001

 

 

讨论

病毒的基因分型对HFRS的分子流行病学调查,尤其是对混合疫区内HFRS的诊断与治疗的研究以及疫苗的合理使用具有重要意义。传统的血清学分型方法,如免疫荧光试验(IFA)、空斑减少中和试验(PRNT)等,因存在人为偏差因素或操作严、繁等不足,难于达到简捷、准确的要求。近几年来迅速发展的PCR法为从核酸分子水平上检定和鉴别HFRS病毒提供了灵敏、特异和准确的方法。Grankvist等[2]首先将RT–PCR技术运用于流行性肾病的基因诊断,并取得了良好效果。我们在参考国内外类似报道的基础上,根据我国HFRS的流行型别特点,设计了针对Ⅰ型和Ⅱ型病毒RNA的引物,首先对实验标准病毒株进行RT–PCR检测,RT–PCR的分型结果与理论完全一致,其敏感性和特异性较高,在此基础上,我们将RT–PCR运用于临床标本的检测。

150例患者所有标本均呈Ⅰ型或/和Ⅱ型阳性,说明早期HFRS患者血清、淋巴细胞和尿中均可检出病毒RNA。从分型结果看,山东地区流行的HFRSⅠ型和Ⅱ型病毒株同时存在,以Ⅱ型毒株为主。结果中出现了部分病例的标本能同时被Ⅰ型和Ⅱ型引物扩增,可能是Ⅰ型、Ⅱ型病毒株混合感染,但不排除病毒株的变异,因为病毒株在宿主转换过程中,可能发生野鼠型向家鼠型变异,出现了介于Ⅰ型和Ⅱ型毒株之间的新型毒株[3]。本组资料显示,山东地区的HFRS疫区有其独特的地理分布特征,Ⅰ型疫区有沿水域分布的特点,多见于潮湿、低凹地带;Ⅱ型疫区多见于内陆干旱地区,尤以丘陵、山区多见。山东地区HFRS的疫区类型是以Ⅱ型病毒株为主的混合疫区。

临床资料分析显示,Ⅰ型病毒感染者病情明显重于Ⅱ型病毒感染者,这可能与病毒的毒力有关。分子流行病学研究认为,汉坦病毒的变异速率较慢,但有时可有很微小的变异(几个甚至1个氨基酸的变化),这都有可能引起病毒毒力即致病性的巨大变化[4]。本组被Ⅰ型引物扩增的患者病情较重,临床类型以重型及危重型多见,肾脏损害明显,病程长,预后差;而被Ⅱ型引物扩增的患者病情相对较轻,临床类型多以轻型及中型常见,肾脏损害较轻,氮质血症不明显,但胃肠道症状相对突出,肝脏损害多见,病程较短,预后较好。

HFRS发病急,病情复杂,早期诊断与治疗致关重要。由于RT–PCR基因分型简便、灵敏、准确,易于基层推广,因此HERS患者早期进行基因分型,对了解病情变化、指导诊疗、判断预后具有重要意义。

参考文献

1.Schmaljohn C S. Schmaljohn A L,Dalrymple J M.Hantaan virus M RNA:coding strategy,nucleotide sequence,and gene order,Virology,1987;157:31

2.Grankvist O,Juto P,Settergren B,et al.Detection of nephropathia epidemica vious RNA in patient samples using a nested primer-based polymerase chain reaction.J Infection Dis,1992;165:934~937

3.柯正,宋干,杭长寿,等. 汉坦病毒抗原性差异及其基因分型.病毒学报,1995;11:34~36.

4.宋干.中国媒介生物学及控制杂志,1997;8(专刊2):1~2

 

 

 

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辛崇尚 副主任医师

日照市人民医院 感染科

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