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徐庆怀
徐庆怀 主任医师
北京清华长庚医院 神经外科

探讨亚低温对缺血性脑损伤的保护作用。

 

徐庆怀1  王治星1  张斌1  杨孝灿1    王宁2     吴浩2

(1. 张家口市宣化区医院神经外科    河北宣化    075100 ;2. 首都医科大学宣武医院神经外科      北京    100053) 北京清华长庚医院神经外科徐庆怀

 

 [摘 要] 目的:观察亚低温对大鼠全脑缺血再灌注操作损伤海马CAI区神经细胞凋亡的形态影响,探讨亚低温对缺血性脑损伤的保护作用。方法:SD大鼠30只随机分为对照组(n=10),常温缺血组(n=10),亚低温组(n=10),采用改良的Pulsinelli-Brierley4血管法建立全脑缺血再灌注动物模型,缺血30min后再灌注72h,尼氏体染色观察海马区存活锥体细胞数,TUNEL法检测缺血后海马CAI区神经元凋亡情况,光、电镜下观察神经细胞形态学改变。结果:与对照组比较,常温缺血组的海马CAI区存活的锥体细胞数目减少(P<0.01);与常温缺血组比较,亚低温组海马CAI存活的锥体细胞数目明显增多(P<0.01)。对照组、亚低温组的海马CAI区神经元凋亡数目和凋亡指数明显低于常温缺血组。在光、电镜下观察亚低温能明显减轻缺血后脑组织病理形态学的损害程度。结论:亚低温可以抑制脑缺血后神经细胞凋亡,对神经细胞有明显的保护作用。

关键词:全脑缺血再灌注   亚低温   神经元   细胞凋亡

To Study The Neuroprotection With Mild Hypothermia  On The Cerebral Ischemia In Rats.

 [Abstract] Objective:To observe the morphological effect of moderate hypothermia on nervous cell apoptosis in rat hippcampal CAI after global cerebral ischemia and reperfusion injury,and explore moderate hypothermia protective effects on nervous cell apoptosis after cerebral ischemia.Methods:Thirty SD rats were randomly divided into control group(n=10),ischemic group(n=10),and hypothemic group(n=10).Using the global cerebral ischemia and reperfusion model in rat according to the modified procedure of pulsinelli et al,four arteries in rats were prepared by half an hour occlusion followed by 72 hours of reperfusive,the live neurons were observed by Nissel dyeing,the apoptic neurons in rat hippcampal CAI assessed by TUNELdyeing.Using light microscepe and electron microscopy to observe the morphological change.Results:The hippocampus CAI neurons in ischemic group were remarkably losed compared with control group.The hippocampus CAI lived neurons in mild hypothermic group were more than those of ischemic group.The quantity and rate of apoptosis neurons in hippcampal CAI in moderate hypothemic and control groups were remarkably decreased compared with those of ischemic group.Mild hypothmeria can markedly reduce the pathological changes of postischemic brain structures by using light microscope and eletron miscroscope. Conclusion: Mild hypothmeria may restrain  apoptosis after brain ischemiaand has an obvious protection to neuron

Keyword:global cerebral ischemia reperfusion injury, moderate hypothemia, neuron, apoptosis.

脑缺血所致的神经元损害机制复杂多样,近年来国内、外许多研究表明[1-4]细胞凋亡也是脑缺血过程中神经元损伤的一种形式,且可能在缺血性脑损伤的病理过程中起重要作用。由于亚低温(28 C~35 C)对缺血动物脑有显著保护作用,且无严重并发症[5],脑缺血前、缺血过程中或缺血后早期开始亚低温治疗能明显减轻缺血后脑组织病理形态学的损害程序,同时对神经功能的恢复起促进作用[6],有报道[7]认为抑制神经元凋亡可能是亚低温发挥脑保护作用的一个途径。本实验在脑缺血即刻给予亚低温处理,观察海马CAI区神经元凋亡情况及光、电镜下的形态学变化,与对照组、常温缺血组进行比较,为亚低温在脑缺血损害中发挥脑保护作用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

采用改良Pulsinelli-Brierley4血管阻塞法[8]:10%水合氯醛给大鼠进行腹腔麻醉(300mg/kg),分离双侧颈总动脉,枕部切口暴露第1颈椎翼小孔电凝双侧椎动脉造成永久性闭塞。24h后在清醒状态下阻断双侧颈总动脉血流30min为全脑缺血,去除颈总动脉套为再灌注期,假手术组不做颈总动脉断流和椎动脉电凝。取健康SD雄性大鼠30只,体重200~250g。随机分为三组。(1)对照组(假手术组)10只大鼠,只健康血管,不阻断血管。(2)常温缺血组10只大鼠,缺血30min再灌注3d,不给予任何治疗。(3)亚低温缺血组10只大鼠,缺血30min再灌注3d,并在脑缺血后立即开始诱导亚低温持续3h。

通过向动物身体喷洒酒精并用电扇吹拂方法降温,采用灯泡照射动物身体升温。使常温缺血组大鼠肛温稳定在36 C~37 C,亚低温组于再灌注后0.5h内使肛温降至32 C~33 C,并持续3h,然后使其体温回升至正常(肛温36 C~37 C)。术中及缺血期采用数显温度计监测肛温。

光镜观察缺血再灌注3d大鼠,腹腔内注射10%水合氯醛深度麻醉后(300mg/kg),迅速打开胸腔,由左心耳灌注生理盐水100ml迅速冲洗,再用4%多聚甲醛进行灌注固定后断头取脑,标本浸于10%中性福尔马林中外固定24h,常规脱水,透明,石蜡包埋,切片5um厚。

神经元尼氏染色:石蜡切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精脱,焦油紫染色时间30-40min,80%酒精分化,经梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

TUNEL法原位细胞凋亡检测:采用博士德生物工程有限公司In Situ Cell Detection Kit POD试剂盒染色,附着于APES处理过的载玻片上,新鲜配制0.3%H2O2室温处理保持10min;蛋白酶K消化37 ºC10min,TBS洗2min×3次;滴加标记缓冲液(TdT、DIG-d-UTP,标记缓冲液)20ul/片,4 ºC过夜,TBS洗2min×3次;滴加封闭液,室温30min;滴加生物素化抗地高辛抗体50ul/片,37 C30min,TBS洗2min×3次;滴加SABC,37 ºC60min,TBS洗5min×4次;DAB显色,DW冲洗,苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。

电镜观察冰块上取新鲜脑海马标本,取材1mm3,2.5%戊二醛预固定4小时后,0.01MPBS冲洗5min×3,再用1%锇酸固定1.5h后,PBS液冲洗5min×3,酒精梯度脱水,Epon812环氧树脂包裹,超薄切片,后醋酸双氧铀一枸橼酸铅双重染色后,JEM-1200EX电镜下观察。

统计学处理

光镜下(400倍)分别计数海马CAI区尼氏体染色阳性的存活神经元数目和TUNEL染色阳性细胞(镜下细胞核染色呈棕黄色)数,选择10个具有代表性视野,计数阳性细胞数和阴性细胞数,并计算凋亡指数(Apoptosis index,AI)[凋亡指数=阳性细胞数/(阳性细胞数+阴性细胞数)×100%][9]。数据均以均数±标准差(X±S)表示,采用SPSS10.0软件进行统计分析,两两组间比较采用方差分析。

2、结果

2.1 神经元尼氏体染色结果

常温缺血组72h海马CAI区存活的锥体细胞数目减少,亚低温缺血组存活锥体细胞数目远较常温缺血组多,但较对照组少。(见表1)

表1脑缺血再灌注后海马CAI区尼氏体染色阳性神经元数值(X±S)

组别               只数           CAI区阳性神经元(个/400倍视野)

对照组/假手术组     10             58.0±19.5

常温缺血组          10            6.6±1.4△

亚低温缺血组        10            50.2±19.7※

与对照组比较P<0.01;与常温缺血组比较P<0.01

海马CAI区神经元尼氏染色的形态学变化(照片)

尼氏染色光镜下对照组(图1)细胞形态正常,细胞核清楚,胞质可见多个紫兰色尼氏小体。常温缺血组(图2)细胞肿胀,体积增大,染色质紊乱,核仁消失,严重细胞正常结构与核仁可消失,核浆溶解,大部分细胞无尼氏小体,少数细胞可见紫兰色尼氏小体。亚低温组(图3)细胞形态尚可,核仁明显,染色质疏松,胞质中可见紫兰色尼氏小体。

2.2 TUNEL法染色结果

2.2.1 海马CAI区TUNEL法染色阳性神经元凋亡细胞数目及凋亡指数

缺血再灌注72h,常温缺血组CAI区可见大量阳性细胞,亚低温缺血组阳性细胞数少于常温缺血组,在对照组可见个别阳性细胞。各组TUNEL染色情况见II

表II脑缺血再灌注海马CAI区神经元TUNEL染色阳性率(X±S, %)

组别               只数        阳性神经元(个/400倍视野)凋亡指数

对照组/假手术组     10             0.00±0.00            0.00±0.00

常温缺血组          10            0.91±0.02△           56±7△

亚低温缺血组        10            50.2±19.7※           23±3※

与对照组比较P<0.01;与常温缺血组比较P<0.01

2.2.2 海马CAI区神经元TUNEL法染色的形态学变化(照片)

TUNEL法染色光简易下对照组细胞形态正常,细胞核清楚,未见明显TUNEL阳性细胞。常温缺血组(图1)细胞体积缩小,TUNEL阳性细胞数目较多,可见凋亡小体。亚低温组(图2)细胞形态基本正常,TUNEL阳性细胞数目较缺血组明显减少。

海马CAI区神经元TUNEL法染色的形态学变化

A  细胞形态完好,阳性神经元无缺失,    B 常温缺血组,阳性神经元显著减少,大量细胞变性(照片)

 

常温缺血组(图1)细胞体积缩小,TUNEL阳性细胞数目较多,可见凋亡小体。亚低温组(图2)细胞形态基本正常,TUNEL阳性细胞数目较缺血组明显减少

2.3 电镜下(照片)

对照组(图7)可见神经细胞核膜完整,核仁清楚,细胞器结构形态清楚,线粒体呈圆形、椭圆形,内嵴清晰可见,基质均匀。常温缺血组(图8)可见线粒体肿胀,变形,线粒体内嵴断裂、溶解,消失,甚至形成空泡化,核染色质聚集,出现致密的团块。亚低温组(图9)线粒体肿胀较前明显减轻,线粒体内少数嵴断裂、溶解,较缺血组减轻。

图7

 

图8

 

图9

3、讨论

3.1 缺血性脑操作导致海马CAI区神经细胞的凋亡

1990年,Shigeo等[10]首先提出全脑缺血的神经细胞死亡与凋亡有关。但近年来大量研究表明,缺血性脑操作有坏死和凋亡两种形式。与细胞坏死不同,凋亡或细胞程序性死亡(programmed cell death,PCD)是细胞一种生理性、主动性的死亡过程,伴随基因转录和蛋白质合成,具有特异性的形态学和生化表现[11]。主要特点是细胞质膜的发泡,核的固缩,细胞器紧缩,DNA链被核酸内切酶切成DNA片段,凋亡小体形成。20世纪90年代以来,从形态学、生化和基因等多种角度证明凋亡或PCD存在于脑缺血再灌注操作中[12、13]。随着对神经元细胞凋亡在缺血再灌注操作中的发生规律及机制的研究深入,神经元细胞凋亡与坏死一样在脑损害中占据重要位置,而细胞凋亡机制对处于不完全缺血状态或再灌注的缺血区细胞损害可能起主要作用。目前认为发生凋亡的机制主要有营养理论学说、基因学说以及钙超载、自由基、NO和兴奋性氨基酸毒性作用有关[14]。中枢神经系统的神经元对缺血有不同的敏感性,其中海马对缺血特别敏感,它的各段对缺血敏感性有以下顺序:CAI>CA2>CA3>齿状回。CAI区操作的典型特点是选择性神经元坏死,即只有神经元敏感于缺血,而星形细胞和血管细胞保留[15]。本实验根据上述原理设计脑缺血再灌注动物模型,采用先进的凋亡细胞检测技术TUNEL法即脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP—生物素切口末端标记法,对缺血敏感的海马CAI区巨锥体细胞受损发现,大鼠脑缺血再灌注操作后脑组织凋亡指数显著高于对照组,而亚低温处理组大鼠脑缺血再灌注操作后凋亡指数较常温缺血组下降,这与以往的文献报道相符[16],并经电镜证实存在缺血性神经元凋亡,为缺血性损害导致神经元凋亡提供了依据,脑缺血性操作导致海马CAI区N细胞的凋亡。[19]

大鼠全脑缺血再灌注操作损伤海马CAI区神经细胞凋亡的形态,染色质固缩成块,核膜完整,细胞器未见明显改变  *3600

3.2 亚低温抑制神经细胞凋亡的作用。

1987年Busto[17]首次提出全身亚低温的概念,即采用物理手段将全身体温下降至30 C~33 C(肛温),在避免了深低温副作用的同时,同样具有保护脑神经功能的作用。大量对亚低温深入研究的结果表明,亚低温治疗能明显减轻缺血后脑组织病理形态学的损害程度,同时对神经功能的恢复起促进作用。Markarian[18]等在研究中发现,亚低温治疗时间窗必须在脑缺血后30min内,并且至少维持3h以上才能发挥脑保护作用。虽然很多实验都证实了亚低温确有脑保护作用,但其机制尚未完全阐明。本实验于缺血发生后3d对存活神经元进行观察,常温缺血组海马CAI区存活的锥体细胞数目减少,而对照组、亚低温组存活锥体细胞数目明显增多,说明脑缺血后实行亚低温,可明显减轻脑缺血对大鼠海马CAI区神经元凋亡的数目,间接支持抑制缺血性神经元凋亡可能是亚低温在脑缺血中发挥一定的脑保护作用。亚低温脑保护作用的机制是降低了脑的能量代谢及兴奋性神经介质的释放,提高了神经细胞对缺氧的耐受力,控制离子的异常流出,降低血液凝聚力,减轻脑水肿,抑制内源性毒性产物对脑细胞的损害作用,促进即早基因的表达等[18],使IEGS表达增加,激活其他基因如凋亡抑制基因(Bcl-2),从而阻止细胞凋亡的早期环节,对缺血性脑操作有保护作用。

综上所述,亚低温通过抑制N细胞的凋亡对缺血性脑操作具有保护作用。[20],且具有安全、操作简便、无严重并发症、易于临床推广应用等优点。

参考文献

[1] Marcia B.Stroke-damaged neurons may commit cellular suicide [J].science,1998;281:1301-1 303

[2] Nitatori T.sato N,waguri S,et al.Delayed neuronal death in the CALphramidal cell layer of the gerbil Hippocampus following transient ischemia is apoptosis[J].J Neuroscl,1995p;15:1 001-1 001

[3] Namura,Zhu J,Fink K,et al.Activation and cleavage of caspase-3 in a apoptosis induced by experimental cerebral ischmia[J].J Neurosci,1998;18:3659-668

[4] Schmiat-Kastner R,Fliss H,Harim AM.Subtle neuronal derth in striatum after short forebrain is chemia in rats detected by in situend-labeling for DNAdamage[J].Stroke,1997;28(1):1 63-1 70

[5] Busto R,et al.J Cereb Blood Flow Metab,1987;7:729-738

[6] Coimbra C,Wieloch T.Moderate hypothermia mitigates neuronal damage in the rat brain when initated several hours following transient cerebral ischemia.Acta Neuropathol(Berl),1994;87(4):325-326

[7] Edwards AD,Yue X,Squire MV,et al.Specific inhibition of apoptosis after cerbral hypoxia-ischemia by moderate post-insult hypothermia[J] Biocher

m Mioph res Co,1995;217:1 193-199

[8] Pulsinelli WA.Brierley.A new model of bilateral himisphere ischemia in the unanes-thetized rat,Storch,1979;10:267-268

[9] 陈斌,等。亚低温对大鼠脑缺血再灌注操作后HSP70mRNA表达及损伤神经细胞凋亡的影响。卒中与神经疾病杂志,2001;8(6):333-334

[10] Shigeno T,Yamaski Y,Kato G, et al.Reduction of delayed neuronal death by inhibition protein synthesis[J].Neurosci Cell,1990;120:117-123

[11] Charriant-MarlangueC,Aggoun-ZouaouiD,RepresaA,etal.Apoptoti c features of selective neuronal death in ischemia,epilepsy and gp 120 toxicity.Trends Neurosci,1996;19:109-114

[12] Johnson EN JR,LT Greenlund,A kins PT,et al.Neuronal apoptosis:current understanding of molecular mechanisms and potential role in ischemic brain injury.J Neurotrauma,1995,12:843-852

[13] Charriaut MC,Ben AY,Cerebral ischemia:is cell death a type of apoptosis?Arch Pediatr,1996,3(suppl 1):245s-247s

[14] Jacobson MD.Reative oxygenspecies and programmed cell death.TIBS,1996,21:83-84

[15] Jack D.Free radical pathology.Stroke,1978,9:443-443

[16] 贾健平,等。鼠缺血再灌流动物模型和病理学研究进展。中风与神经疾病杂志,1992(9):1 61-64

[17] Busto R.Dietrich WD,Globws MY,et al.Small differences in intraischemic brain temperature critically determine the extent of ischemic neurocal injury.J Cereb Blood Flow Metab,1987,7:729-738

[18] Markarian GZ,LeeJH,SteinDJ,et al.Mild hypothermia:therapeutic after experimental cerebral ischemia.Neurosurgery,1996,38:542-543

[19] 张洪,童萼塘。低温治疗脑缺血的研究进展。中国神经免疫学和神经病学杂志,1996,6:198-199

[20] 江基尧,主编。亚低温脑保护基础与临床。第1版。上海:第二军医大学出版社,1998,54-57   

 

(寄书地痔址:被京市宣武区牛街西里2区8号楼2209   

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徐庆怀 主任医师
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