斑蝥素干预急性髓细胞性白血病端粒酶逆转录酶（hTERT）甲基化的研究

研究目的

白血病是一组异质性恶性克隆性疾病，其主要表现为异常血细胞（即白血病细胞）在骨髓及其他造血组织中失控制地增生，浸润各种组织，而正常造血功能受到抑制，正常血细胞生成减少，产生相应的临床表现，周围血细胞有质和量的变化。DNA甲基化修饰异常是恶性血液病重要发病机制之一。因为DNA甲基化异常在白血病中存在，提示对基因甲基化的研究有望发现新的白血病治疗方法。研究发现DNA甲基化对端粒酶活性的调节具有重要的作用，而端粒酶活化是恶性肿瘤一个显著的生物学特征。因此，如何抑制端粒酶的活化以及DNA甲基化在端粒酶活化中起到什么样的作用就成了当前肿瘤研究中的一个热点问题。

中医将急性髓细胞性白血病归于“急劳”、“热劳”、“血证”等范畴。在白血病治疗中中药可减轻化疗过程中的毒副反应；预防复发，延长缓解期；止血，升高白细胞；抑制白血病细胞增殖、诱导凋亡，甚至杀伤白血病细胞。斑蝥为常用中药之一，具有攻坚蚀疮、破血散结的功能。斑蝥体内所含斑蝥素(cantharidin，CTD)已证明有抗肿瘤活性。具有诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤细胞的侵袭和转移、逆转多药耐药、直接作用于肿瘤干、祖细胞等作用。

本文的主要研究目的即观察斑蝥素对急性髓细胞性白血病是否存在去甲基化治疗作用，以期为中药在靶向治疗急性白血病方面提供思路。

研究方法与内容

一、实验方法及内容

（一）NOD/SCID小鼠

NOD/SCID小鼠购于中国医学科学院实验动物研究所，6-8周雌性小鼠，共26只。2只留作正常对比，另外24只用HL-60细胞株造模，并随机分为斑蝥素组和空白组，每组12只。所有小鼠均饲养于SPF级无菌层流环境中，饲料、饮用水、垫料及一切与小鼠接触物品均经灭菌处理。

（二）HL-60细胞培养

HL -60购自山东省医学科学院。以含10%胎牛血清的RPMI-1640于37℃、5%CO₂ 及饱和湿度的细胞培养箱中常规传代培养；

（三）细胞浓度调整

造模前应用血细胞计数板计数，计算对数生长期细胞含量，以PBS液将HL-60细胞浓度调整为1×10⁶/ml；

（四）斑蝥素的配制及应用

按照人每天所用CTD剂量为2mg，将人设定为体重60kg，按体重折算，小鼠约20g左右，每天可以用至约0. 0066 mg。所以将其剂量增加至0.01mg/d，生理盐水溶解，进行腹腔注射，总体积为0.2ml，连续5天。试验组小鼠出现萎靡、少动、反应减弱等情况时试验组开始应用斑蝥素。空白组注射等体积生理盐水。

（五）NOD/SCID小鼠预处理及造模

24只NOD/SCID小鼠予⁶⁰Co 200 cGy全身均匀照射，照射后24小时内经尾静脉各注射PBS缓冲液重悬的细胞，每只1×10⁵个细胞，体积0.2ml。

（六）一般情况记录

记录各组NOD/SCID小鼠的毛色、体重等一般情况变化及生存时间；并于第7天每组各处死1只小鼠行病理及骨髓涂片检测造模是否成功。

（七）骨髓涂片

采取颈椎脱臼法处死小鼠后取双侧股骨，用5mL医用注射器吸取PBS液反复将骨髓（BM）冲洗入15 mL离心管，直至股骨外观呈白色。将BM沉渣离心后涂片、瑞氏-姬姆萨染色后，在高倍油镜下镜检。

（八）病理

肝、脾、股骨病理：将濒死状态小鼠颈椎脱臼处死，解剖，取出肝、脾及股骨，经固定、脱水、脱钙等步骤处理后行病理检查。

（九）外周血常规

每周断尾取血，无菌1.5ml血常规管采集外周血20μl，加入500μl血常规稀释液中，混匀，血细胞计数仪进行计数。

（十）骨髓单个核细胞的收集

颈椎脱臼处死小鼠，75%的酒精浸泡消毒5分钟，取出一侧股骨，用6号针头以1ml生理盐水液冲出骨髓细胞，反复吹打，经4号针头过滤，用pH为7.4的PBS液洗涤2遍，每次1500转/分，离心10分钟，弃去上清。加进氯化铵溶液（NH₄Cl:8.99g/l，KHCO₃:1g/l，Na₄-EDTA:0.037g/l）裂解红细胞，按1ml细胞悬液，加入9ml氯化铵溶液的比例进行，混匀，冰上10分钟，1200转/分，离心10分钟，去上清，5ml PBS洗涤细胞2次。

（十一）RT-PCR

细胞总RNA的提取后按照TransScript^TM One-Step RT-PCR SuperMix试剂盒一步法进行。反应结束后进行电泳。

①制备琼脂糖凝胶：电泳缓冲液约1×TAE 50ml与琼脂糖1g配制成2％凝胶，置于微波炉内熔化，待其冷却至60 ℃左右，加入EB 3μl混匀，倒入预封好的电泳槽中，并插入梳子。

②待凝胶固化后，除去密封带，拔掉梳子，然后加入足量的电泳缓冲液，使液面超过凝胶平面1mm。

③上样：用适量的载样液和DNA混合后,加到胶上的样品孔中，同时在一个孔中加入DNA Marker用作分子标志。

（十二）细胞总DNA提取、修饰及电泳

依照EasyPure Genomic DNA Extraction Kit说明书操作，提取总DNA。按照CpGenome^TM DNA Modification Kit说明书操作，进行DNA修饰。参照2×Trans Taq-T PCR SuperMix试剂盒进行扩增，然后进行电泳。

二、统计方法

全部数据用 SPSS13.0 统计软件包进行统计分析。单变量两组资料之间的比较采用t检验，所有计量资料均以 ±s（均数±标准差）表示，P<0.05表示具有显著性差异，P<0.01表示具有非常显著性差异。

研究结果

一、一般情况

所有造模小鼠在照射后即出现皮毛蓬松，少动，进食量减少情况，第2-3天好转。造模小鼠在造模后第6天开始出现萎靡、少动，反应减弱、皮毛皱缩无光泽、消瘦等情况，空白组平均生存时间为10.4天。试验组平均生存时间为15.4天。两组小鼠生存时间比较P<0.01。

二、病理结果

HL-60小鼠骨髓以早幼及原始粒细胞为主，分叶核粒细胞少见。脾组织细胞核碎裂，消失，细胞排列疏松，未见脾小体，可见白血病细胞浸润。肝组织有少量恶性细胞浸润。骨髓涂片可见到带有空泡，核很大的恶性细胞。经病理检测造模成功。

三、外周血常规

造模后空白组和实验组小鼠外周血常规指标均呈进行性下降，同一指标用药前比较无明显差异。用药后两组小鼠外周血白细胞计数空白组和实验组相比具有显著性差异（P<0.01）。 红细胞、血红蛋白、血小板无明显差异。

四、RT-PCR及MSP结果

RT-PCR半定量检测各组hTERT基因 mRNA表达水平，实验组明显低于空白组（P<0.01），证实斑蝥素能够减低hTERT表达。MSP法检测甲基化状态结果发现空白组和实验组均出现甲基化条带，说明各组hTERT启动子均处于甲基化状态，定性MSP法未证实斑蝥素具有去甲基化治疗作用，尚需采用荧光定量MSP进一步研究。

结 论

为了观察斑蝥素治疗能否产生去甲基化治疗作用，我们设计了该实验。本实验研究结果显示：

1. 斑蝥素能够下调hTERT mRNA的表达，而对hTERT启动子甲基化不能产生明显的去甲基化治疗作用；

2. 斑蝥素能够延长模型鼠的生存时间，并影响外周血白细胞，而对血小板、血红蛋白等指标作用不明显。

3. 我们采用HL-60细胞株进行急性髓细胞性白血病造模实验获得了成功，而目前国内以白血病病人骨髓或外周血单个核细胞进行人急性髓细胞性白血病模型造模实验的报道尚不多见，我们在实验过程中收获的经验为下一步以白血病病人骨髓或外周血单个核细胞进行人急性髓细胞性白血病模型造模实验打下了坚实的基础。

4. 本研究为设计作用于新靶点的抗肿瘤中药，筛选有效去甲基化治疗的中药提供了新的思路和方法，为中医药调控干预白血病干细胞的靶向治疗提供了可靠依据。因为经费的关系，实验中的甲基化检测采用了定性MSP方法，未能证实斑蝥素具有去甲基化治疗作用，尚需采用实时荧光定量MSP进一步研究。