通过分子生物学实现肿瘤影像诊断与放射治疗的融合

发表者：孙昌进人已读

摘要：论述肿瘤放射学中分子靶确认的概念。阐明分子影像学、分子生物学、放射治疗学等多学科的融合是实现这一理念的关键，指出实现这一理念过程中应贯彻“3DS”原则。

关键词：诊断显像；方法；分子生物学；肿瘤；放射疗法、聚焦生物学

分子生物学为疾病的诊断、治疗和干预开拓了崭新视野。影像医学与放射肿瘤学在技术发展领域正面临巨大机遇和挑战。Robert W和 Richard K提出“分子靶确认”（molecule target credentialing）的概念：对肿瘤特异的分子靶点成像，定义肿瘤细胞的这一分子标记并给出治疗方案，治疗效果在影像上被发现、标记、评估。这一崭新的肿瘤治疗理念已被用于肿瘤治疗和干预中某些特定分子靶点的验证，这将为实现肿瘤的个体化治疗提供可能[1]。这一理念被美国国家癌症研究中心（national cancer institute , NCI）认为是“研究领域的非凡机遇”。在此基础上美国放射肿瘤学教授Coleman CN提出了“通过分子生物学实现肿瘤影像诊断与放射治疗的融合”这一思想[1]。本文旨在阐述这一思想及肿瘤放射学中的一些最新概念。同时阐明实现这一理念过程中应贯彻的“3DS”原则。

一放射肿瘤学进展

（一）、肿瘤放射治疗的分子生物学基础

肿瘤放射治疗中射线剂量分布不受药理学屏障限制，其首要靶点是细胞DNA。细胞死亡主要由于射线引起细胞DNA双螺旋不可修复性破坏所致。但放射治疗靶点并不仅局限于细胞DNA。更多研究表明由于射线作用引起的细胞靶点改变还包括信号传导通路改变、细胞膜改变、线粒体改变、程序性细胞死亡和

细胞周期改变。尽管其中有些靶点改变是对DNA受不可修复性破坏后的反应。进一步研究表明有些非DNA靶点如细胞膜、线粒体可能也是细胞死亡的关键因素甚至可能是射线作用的首要靶点。

在近距离放疗中还会出现旁观者效应：射线照射细胞的分子可经细胞膜连接间隙或细胞外微环境转送至周围未被照射细胞，从而影响周围未被照射细胞。最近研究表明很低剂量射线照射（低至2―10cGy，仅有标准单次照射剂量―20cGy的1%―5%）可引起持续的分子压力反应或氧生产增高。这些改变将引起大量潜在效应：1、可能对决定电离辐射的细胞组织命运十分重要。2、可能会成为分子放疗的重要靶点。3、可能有助于具有实质意义新的放疗技术的发展，从而设计优化的可诱导靶点。

（二）、肿瘤放射聚焦生物学（focused biology）

聚焦生物学是指通过不同射线外照射、近距离放疗、全身注射靶向放射同位素的方式实施照射使产生的分子事件最优化的过程[1]。在肿瘤治疗中，射线的生物学聚焦不仅包括直接的细胞杀伤，还包括联合细胞毒性或细胞抑制性因子作为免疫治疗的辅助治疗，并且诱导细胞发生生物学改变，使其成为分子治疗的靶点。Kanazawa等在人NKO-1肿瘤细胞研究表明，γ射线照射能增加以重组腺相关病毒（rAAV）为载体的单纯疱疹病毒-胸苷激酶（HSV-tk）/ganciclovir治疗系统的效能[2]。Hiliman等报道[3]鼠前列腺癌（RM-9）基因治疗前一天予射线照射可提高基因治疗疗效。基因治疗用肿瘤疫苗为γ干扰素主导的组织相容性DNA质粒载体复合体（MHC）Ⅱ型转移启动子和为Li蛋白设计的反义反基因结构（RUC）。结果表明57天时，治疗前一天射线照射组有43.8%肿瘤消退；仅用基因治疗组无一例肿瘤消退。最后治疗前一天射线照射组有50%肿瘤消退，而仅用MHC治疗组为37.5%，仅用Li -RUC治疗组则为14%。Hiliman等认为基因治疗前一天射线照射有助于1、射线照射诱导瘤周出现的炎性细胞参加了基因治疗诱发的免疫反应。2、射线诱导的凋亡导致肿瘤蛋白和肽类(peptides)产生。3、治疗前一天射线照射使MHC组瘤细胞在发生凋亡前有充分的时间产生肿瘤相关抗原（TAA），该抗原能使RM-9肿瘤表现出特异的CD8+T-细胞毒性活性。4、射线照射提高了基因的转导效率和质粒投递后表达的持久性。但射线照射改善基因治疗效果的机制和优化疗效改善的射线照射条件尚需进一步研究。

对临床和药物开发来说，射线将可能成为一个新的至关紧要的分子靶点治疗工具——通过其不是杀灭细胞而是仅仅改变其生化途径和细胞内环境。放疗剂量的概念将被重新定义——放疗剂量根据需要产生的生物学改变来确定。这同时将对放疗总投照剂量的决定和放疗质量保证产生潜在影响。另外通过射线照射调节正常组织在治疗中或治疗后的反应也正在研究中。

（三）肿瘤放疗过程中的相关分子靶点

肿瘤放射治疗中有许多分子靶点可供确认。许多新的分子治疗因子可作为放射治疗的敏感子和保护子作用于这些分子靶点。Shi等报道[4]通过重组腺相关病毒(rAAV)载体给予endostatin（一种抗血管生成因子）能提高人直肠结肠癌模型（HT29）的放疗疗效。单纯放疗组肿瘤从200mm3生长到1000 mm3需34天，endostatin加放疗组则需50天（P<0.05）。以rAAV载体给予的endostatin在体内和体外表达均具生物学活性。除血管生成外，细胞周期、生长因子受体、凋亡、蛋白降解、信号传导通路、应急反应同样可作为放疗敏感子的分子通路确认。进一步认识细胞损伤和组织纤维化的分子通路，还将有助于急慢性放射损伤的修复治疗。但如何对这些相关靶点成像，通过影像进行评估尚需进一步研究。

（四）分子靶点射线精确投照技术

分子靶点射线精确投递技术主要包括三维适形放疗、调强放疗、断层放疗、质子放疗、近距离放疗、各种立体放疗技术及放射免疫治疗。放射免疫治疗方法包括单纯应用放射同位素和将同位素附着于分子上进行系统性放射治疗两种，用于同位素转运的分子可以是分子，也可能是非抗体的其他结构如抗体片段、受体配体和微脂体。技术的进步已使射线在体内任意位置投照成为可能[1]。放疗剂量投照的精确性还要求了解每天治疗的靶点在哪里，这需要每天通过固定和（或）实时成像来收集信息。例如在对前列腺癌三维适形放疗和调强放疗的研究表明，放疗不同靶区间或同一靶区内部常会出现不同程度的移位。带有基准标记的在线照射野成像和实时CT扫描有助于消除这一误区，实现放疗剂量的精确投递[1]。

（五）肿瘤乏氧区的确定

目前认为，肿瘤内细胞的氧合状态能影响肿瘤对治疗的反应性。肿瘤乏氧细胞的存在是影响肿瘤对射线反应性的主要因素。如果能确定肿瘤内乏氧区，则可对其标记给予高剂量照射。许多技术用于乏氧区的标定，如血氧水平依赖性MR、流量氧依赖性MR、PET、动态增强MR以及电子顺磁MR、overhauser增强MR。后两种技术正在迅速发展，有潜在非侵入性确定活体乏氧区的能力。但现有的方法无论哪种均有其局限性[1]。目前放射肿瘤科学计划（ROSP）的专家们已将寻

找肿瘤富氧和乏氧分子标记作为研究启动点。

目前认为乏氧诱导因子（HIF-1）是肿瘤乏氧的主要调节因子，参与受不同水平乏氧调节的生理学途径，并控制着多种靶基因。该类基因通过不同的“开关”模式产生不同的基因产物，准确分析基因转录和转录蛋白的分子标记可以确定肿瘤的乏氧状态[1]。Loncaster等报道[5]在已知乏氧调控基因产物中以碳酸酐酶（carbonic anhydrase，CAⅨ）与肿瘤乏氧状态最密切相关。与Eppendorf 氧分压测量法对照，在宫颈癌中， CAⅨ的表达与细胞乏氧呈正相关，相关系数为0.5。Loncaster等认为CAⅨ表达与细胞乏氧相关系数为0.5的原因之一是CAⅨ反映的是肿瘤慢性乏氧（由于氧弥散受限引起），而Eppendorf 氧分压测量法反映的是肿瘤急性乏氧（由于氧探针插入，使氧灌注受限引起）。并且由于该基因产物广泛存在于各种类型肿瘤细胞中，而不在正常细胞中出现，故有希望成为肿瘤乏氧的分子标记。但同时也应看到要寻找恰当的乏氧分子标记的复杂性。如HIF-1在肿瘤乏氧、非乏氧的环境均可出现，在非乏氧环境里该因子大部分处于失调（misregulated）状态，但在某些恶性转移中可处于异常的“开启”状态[1]。

二、通过分子影像学确认分子靶点

目前肿瘤放疗技术如三维适形放射治疗已能克服二维放疗的大部分缺点，使放疗高剂量分布的立体形态和靶区相适应，有效地减少了肿瘤周围正常组织的放射剂量。其主要是以对肿瘤和正常组织解剖知识为基础。但肿瘤放疗不仅需要射线投照的精确性，尚需要射线投照的准确性[1]。影像学的发展为实现肿瘤放射治疗射线投递的准确性带来巨大机遇。

分子影像学(molecular imaging)是随着影像医学与分子生物学等学科发展和相互融合形成的新兴研究领域。可广义地定义为在细胞和分子水平上生物进程的体内描述和测量。与一般的临床影像比较，它探测的是疾病基础上的分子异常，即从生理、生化水平认识疾病，阐明病变组织生物过程的变化、病变细胞基因表达、代谢活性高低、病变细胞是否存活以及细胞内生物活动的状态等，并以图像的形式从分子水平描绘正常及病变组织结构与功能变化信息的医学影像学。目前分子成像方法包括CT、单光子发射体层成像（SPECT）、、MR、MR波谱、正电子体层发射成像（PET）、使用新型对比剂的超声（US）、和其他新的成像方式如：光学成像、电子顺磁成像、[U1] 增强MR [1]。其中以PET、MR成像研究最多，也最有前途。

（一）PET分子成像：PET分子成像是把有明确生物学效应的示踪剂送入人体内，让它参加体内生物活动，再加以探测和显示，由此反映体内特定的生物活动，了解体内的生理、生化状态及其改变。例如上文提及的HSV-tk，其结构与胸苷类似的核苷酸磷酸化，经核素标记后，可通过主动转运通过细胞膜进入靶细胞中滞留，靶细胞内滞留的放射性活性物质可用来指示HSV-tk的存在，并能被PET探测到，从而可证明外源基因的转染和表达[6]。Wells等报道利用2-[11C] 胸腺嘧啶PET在活体测得的胸腺嘧啶摄取分数(FRT)与在体外利用Ki-67测得的细胞增殖指数明显相关。表明2-[11C] 胸腺嘧啶PET可用于测量活体细胞增殖。Bos等利用18F脱氧葡萄糖PET扫描了解乳腺癌中乏氧诱导因子1α、己糖激酶、葡萄糖转运子的生化途径，认识到其影像表现及生化、分子生物学机制之间异常复杂的联系。

由于PET空间分辩率低，对组织结构显示有局限性，而CT能提供卓越的解剖图像，故采用图像融合技术——CT-PET可对PET显示出的生理、生化信息进行精确定位，为临床医生提供更加全面和准确的信息。

（二）MR分子成像：MR分子成像因能同时提供优异的解剖图像和分子生物学信息，不需采用图像融合技术，而成为影像医学研究的又一热点。目前，[U2] [U3] 。。典型的对比剂包括GDDTPA和氧化铁微粒。Artemov等报道其发明一种包含两种成分的钆基抗生素-生物素复合体用于HER-2/ neu受体MR成像，由于该对比剂是由两个独立的小分子组成，故较单独的大分子成像更加容易。实验材料采用乳腺癌HER-2/ neu受体转基因鼠，结果表明无论是实验动物体内肿瘤还是HER-2/ neu表达的肿瘤细胞系（lines）T1MR均表现为信号增高。目前认为HER-2/ neu受体表达与乳腺癌及其他肿瘤预后相关，是免疫治疗的重要靶点。故这一研究将为相关“分子靶确认”研究奠定基础[7]。Alfke等报道在四环素反应因子的控制下通过MR成像鉴别同源细胞酪氨酸酶报告基因的表达取得成功，作者成功建立起两组转染细胞克隆。在四环素反应因子的控制下，相对于报告基因关闭组，报告基因表达组由于基因表达产生的酪氨酸酶蛋白和黑色素可被MR探测而在T1WI表现为较高信号。这一研究进一步证明了利用MR对基因靶点成像的可行性[8]。另外Frank等报道采用超顺磁氧化铁（SPIO）MR标记人间叶组织干细胞、子宫癌细胞、鼠淋巴细胞、少突神经胶质细胞、CG-4细胞取得成功，由于SPIO已得到FDA批准，故该研究将有助于尽早在人体进行MR分子成像和靶点标记[9]。

21世纪影像医学的发展将从解剖学或病理学的影像时代，逐步走向分子影像时期。分子影像学将对肿瘤放射治疗产生长期深远的影响。

三分子靶区概念

放疗靶区体积包括大体靶区、临床靶区（包括显微病灶）和计划靶区。Ling 等建议增加生物靶区体积的概念以包括对肿瘤内部乏氧、增殖、PH值改变和其他特性的认识。 Coleman CN等建议增加分子靶点靶区体积(molecular-targted target volume)的概念以定义成像标记、治疗和实时评估的分子过程[1]。在这一过程中分子标记的确定至关重要——因为其有助于理解为何不同的成像方式在不同患者会有不同的分子标记，一种标记在相同的部位一位患者是正常的而另一患者则为异常。

四相关分子生物学技术

分子生物学技术的发展为认识肿瘤分子影像表现及生化、分子生物学机制之间的联系提供有力武器。如传统的基因表达、序列测定、突变和多态性分析等研究方法只适用于少量样品的测定，操作步骤多且费力。最新发展的微阵列技术由特异序列的基因连接在固相载体的特异位点上而成，能同时测量许多基因、蛋白，评估其生化状态，从而认识肿瘤恶变的动力或诸如氧化压力之类生物学反应的基本过程，具有高通量、微型化和自动化的特点。由于肿瘤异质性的存在，有时需要对活检样本中的某个单个典型细胞进行研究，一种称为激光捕获显微分离技术可满足这一要求。RNA 敲除技术则可通过人为抑制某个基因，观察这个基因及其产物缺失后所发生的异常，以了解正常基因的功能。故在放射肿瘤学“分子靶确认” 研究中不仅是放射肿瘤学、影像学和核医学的参与，更需要多学科研究

小组的配合。

五 “分子靶确认”研究中的“三Ds”原则

“分子靶确认”为肿瘤的抑制与治疗带来巨大机遇。其关键在于确认作为治疗靶点所需的特异的分子途径。为优化治疗因子，必须理解该分子途径的生物学机制。为指导靶向治疗，必须对分子靶点成像。利用影像学发现进行诊断，评估局部或系统性治疗疗效，为将影像学发现与治疗联系起来，还必须以对组织、肿瘤生物学机制的理解为基础。

这一概念使肿瘤治疗摆脱了传统治疗模式中存在的或多或少的经验主义，让治疗变得更加客观。NCI中心主任Eschenbach指出在进行该项研究时需要遵循“三Ds”原则：发现（discovery）、发掘(development)、实施(delivery)。用于放射肿瘤学的“分子靶确认”研究，则分子靶点标记类似于发现，分子成像类似于发掘，分子治疗类似于实施，三者循环往复[1]。

六结语

为在放射肿瘤学领域尽早实现这一治疗理念，Coleman提出放射肿瘤医师需要了解分子影像及其影像表现的生物学机制，影像诊断和核医学医师需要懂得怎样使影像为放射肿瘤医师所用。所有参加者均需要有坚实的生物学基础和先进的分子生物学技术[1]。如Coleman所指出“目前放射学领域肿瘤诊断和治疗是分离的，现在已是将两者重新合二为一的时候了！” [1]

参考文献：

1. Coleman CN. Linking radiation oncology and imaging through molecular biology (or now that therapy and diagnosis have separated , it’s time to get together again!). Radiology, 2003, 228（1）: 29-35.

2. Kanazawa T, Urabe M, Mizukami H, et al. Gamma-rays enhance rAAV- mediated transgene expression and cytocidal effect of HSV-tk/gancicloviron cancer cells. Cancer gene therapy , 2001, 8（1）: 99-106.

3. Hiliman GG, Xu MI, Wang Y, et al. Radiation improves intratumoral gene therapy for induction of cancer vaccine in murine prostate carcinoma. Human Gene Therapy , 2003, 14（3）: 763-775.

4. Shi W, Feschendorf C, Muzyczka N, et al. Gene therapy delivery of endostain enhances the treatment efficacy of radiation. Radiother Oncol, 2003, 66（1）:1-9.

5. Loncaster JA, Harris AL, Davidson SE, et al. Carbonic anhydrase A(CAⅨ) expression,a potential new intrinsic marker of hypoxia: correlations with tumor oxygen measurements and prognosis in locally advanced carcinoma of the cervix. Cancer reaseach, 2001, 61（21）: 6394-6399..

6. Jacobs A, Voges J, Reszka R, et al. Positron-emission tomography of vector-mediated gene expression in gene therapy for gliomas. Lancet, 2001, 358(9283): 727-729.

7. Artemov D, Mori N, Ravi R, et al. Magnetic resonance molecular imaging of the HER-2/neu receptor. Cancer reaseach, 2003, 63（11）: 2723-2727..

8. Alfke H, Stoppler H, Nocken F, et al. In vitro MR imaging of regulated gene expression. Radiology, 2003, 228（2）: 488-492.

9. Frank JA, Miller BR, Arbab HZ, et al. Clinically applicable labeling of mammalian and stem cells by combing superparamagnetic iron oxides and transfection agents. Radiology, 2003, 228(2): 480-487.