循环肿瘤DNA在胃肠间质瘤诊治中的应用及意义

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）包括肿瘤细胞凋亡和坏死释放到细胞外的DNA小片段和肿瘤细胞外渗到外周血中并发生裂解释放出的DNA。ctDNA携带一定特征信息（包括突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常和甲基化等）在人体血液循环系统中不断流动，包含肿瘤细胞特有的体细胞突变信息［1］。ctDNA是一种内在特异性和高度敏感的生物学标记物，在不同类型癌症病人的诊断和预后中［2］，可以被定性、定量和追踪，其在血液中的半衰期，可实时反映肿瘤的动态变化［3］。检测外周血ctDNA，被称为“液体活检”，是一种充满前景的人类恶性肿瘤早期诊断和预后评估的方法［4］。与组织活检相比，检测ctDNA具有创伤小、可重复性、可克服肿瘤异质性等优点，并且很大程度上接近病理学诊断的敏感度和特异度［5］。通过检测ctDNA中肿瘤基因组变异特征，能帮助实时动态监测肿瘤原发灶及转移复发灶基因组信息，协助早期诊断、基因分型靶向治疗、疗效监测和预后判断。近年来，ctDNA检测正逐步改变肺癌、乳腺癌、胰腺癌和黑色素瘤的临床诊断模式，给病人带来了较大的临床获益。

随着新一代测序（the next-generation sequencing，NGS）的发展（该技术能同时测序数百万个DNA片段），ctDNA突变检测阳性率增加［6］。NGS因为具有可靠性高和成本低的优势已经广泛用于各种肿瘤［包括胃肠间质瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）］病人的遗传分析［6-7］。

GIST是最常见的消化道肉瘤。大部分GIST包含癌基因KIT（约85%）和PDGFRA（约5%～10%）的功能突变。以伊马替尼为代表的小分子酪氨酸激酶受体抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）的应用使GIST的治疗发生很大变化。在当今的“精准医学”的时代背景下，GIST治疗已成为靶向药应用于实体瘤的成功范例，早期诊断和准确的治疗效果评估对于合理选择治疗方案至关重要。传统上，肿瘤诊断和治疗效果评估均采用活检和RECIST标准（基于传统影像学如CT、MRI图像中肿瘤大小和病灶数量变化的评价方法），但临床实践中，有时活检标本难以获取，影像学检查对病情变化不敏感，无法对疗效进行实时检测且缺乏预测价值。因此，临床上亟需一些能更有效地指导GIST治疗的新的标记物。液体活检技术的出现及其在临床上的应用，对指导肿瘤的治疗具有潜在价值。本文旨在总结作为液体活检的ctDNA检测在GIST诊疗中的应用价值。

1检测ctDNA用于GIST的诊断

目前，诊断GIST主要依赖于病理学诊断检查，通过手术和穿刺获取标本并检测肿瘤的特异分子和基因。然而，上述方法获取的肿瘤组织标本有限（如其有创性导致反复取样受限，存在一定的假阴性率且存在一定的风险），仅获得疾病的静态分子特征，缺乏表征GIST病人的转移灶内部和不同转移灶之间分子异质性特征，缺少一系列标本进行分析。相比而言，ctDNA由病人血液中获取，理论上可以克服组织活检的限制并能提供相同甚至更多的分子和基因信息，且血液检查创伤小，又可在疾病过程中的任何时间检查，更允许动态评估肿瘤分子随时间变化的特征。ctDNA检测利用新鲜血检标本通过全基因组和外显子组分析诊断GIST，可提高早期GIST的诊断率。对于ctDNA的可靠性，Reichardt等［8］在Ⅲ期GRID试验中分析了GIST一个亚组病人的激酶基因型，发现检测KIT基因在原发突变血浆和组织的一致率为84％，且在血浆中比组织中更容易检测到继发性突变，分别为47%和12%。另一项研究回顾性分析32例进展期GIST病人的ctDNA和组织活检数据发现，当GIST长径＞10 cm、Ki-67＞5%时，ctDNA阳性率高，与组织活检一致率高［9］。因此，对于临床中无法获取组织或获取困难者，ctDNA是一个很好的选择。

2检测ctDNA基因分型指导靶向治疗

美国国家综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）临床实践指南推荐根据基因分型指导GIST病人的靶向治疗。TKI如伊马替尼、舒尼替尼，分别用于GIST新辅助治疗、辅助治疗和姑息治疗。不同的基因型对靶向药的敏感程度存在差异，研究发现KIT基因外显子11突变是最为常见的基因突变类型且对伊马替尼敏感；KIT基因外显子9突变对伊马替尼相对不敏感，需增加伊马替尼剂量；PDGFRA基因外显子18的Asp842Val突变是最常见的PDGFRA基因突变，对伊马替尼、舒尼替尼原发耐药［10］。

在GIST进展病人中，有50%的病人采用伊马替尼治疗可达部分缓解，少数达到完全反应，然而更多的病人发生疾病进展［11］。目前GIST病人治疗效果反应通过影像学进行评估的敏感度和特异度有限，且尚无用于检测GIST治疗成功与否的生物学标记物。突变的基因组片段对于肿瘤而言具有高特异性，很好地了解GIST的基因突变对选择更适合的靶向药物治疗十分重要。应用敏感、可靠的生物学标记物来检测和量化疾病的活动性，对GIST病人的管理将非常有意义。

基因分析一直以来通过福尔马林和石蜡包埋切片提取DNA，最近研究显示在GIST病人的血浆样本中KIT、PDGFRA基因特异性的突变能在ctDNA中被检测和量化［12］，且ctDNA水平与肿瘤负荷相关。因此，将血浆中肿瘤特异的ctDNA作为GIST病人血液中高特异的生物学标记物应用于GIST病人的基因分型，将有利于指导靶向治疗［13］。ctDNA检测是一种可能替代传统高风险组织活检用于GIST病人的基因分型的安全方法。

3检测ctDNA早期识别继发性突变

GIST主要由于KIT和PDGFRA基因突变所致［14］。伊马替尼治疗是不可手术切除和进展期GIST的标准一线治疗方案［15］。约有70%～80%的初发GIST对伊马替尼治疗敏感［16］，能显著提高GIST病人的存活率，尽管伊马替尼有如此高的有效率，但仍有约50%的病人在2年内发生肿瘤进展，其原因主要为在KIT基因外显子13、14、17、18发生了继发性突变［17］。继发性突变可预测后续相关TKI治疗临床反应。目前多重激酶抑制剂（舒尼替尼和瑞戈非尼）可用于治疗伊马替尼耐药的病人［18］。研究报道舒尼替尼和瑞戈非尼抗肿瘤效果与继发性突变的类型有关。舒尼替尼对于继发KIT基因外显子13、14突变的肿瘤具有抑制作用，而瑞戈非尼对于继发KIT基因外显子17、18突变的肿瘤和KIT基因外显子14中T670I突变的肿瘤具有显著抑瘤效果［19］。因此，早期识别继发性突变对于选择靶向药物和预测抗肿瘤效果具有重要临床指导价值。然而，继发性突变的肿瘤标本很难获取，因此，ctDNA的突变分析可用于鉴定继发性突变以指导个体化的治疗。

Wada等［20］研究KIT基因继发性突变在伊马替尼耐药的GIST病人组织和血样中的一致性，结果显示在组织中证实存在继发性KIT基因突变的伊马替尼耐药的GIST病人也能被检测到在外周血ctDNA中同时存在突变，且ctDNA突变百分比随着肿瘤状态发生变化。因此，对伊马替尼耐药的GIST病人进行外周血继发性KIT基因突变检测有助于临床医生选择多靶点激酶抑制剂和预测抗肿瘤效果。但也有研究显示，对GIST病人行KIT和PDGFRA基因继发性突变检测时，发现ctDNA检测出的突变却在肿瘤组织活检中未被检出［21］。

来自韩国的一项研究发现，在GIST病人接受伊马替尼治疗过程中，外周血基因突变检测可在临床影像学检查发现肿瘤耐药前提前5 个月发现继发突变基因，这一现象提示，外周血动态检测KIT 和PDGFRA基因可提前预警继发耐药现象，有助于即时调整治疗决策［21］。

在GIST病人血液ctDNA中易于检测到原发突变和继发突变，这些突变可被用于预测治疗反应。而且，血浆DNA耐药突变的检测允许早期改用其他的TKI或增加伊马替尼剂量从而实现GIST病人最佳管理［20］。

4检测ctDNA动态评估治疗效果，监测复发、转移

ctDNA的检测采用外周血，采样方便，可多次重复，尤其适用于治疗过程中的随访。ctDNA突变作为一个潜在的高特异性的生物学标记物，理论上包括GIST病人体内多肿瘤细胞亚群的基因组片段，ctDNA测序可更加宏观全面地了解个体内肿瘤细胞的基因组变异情况，比其他生物学标记物具有更高的肿瘤特异性。ctDNA提供在疾病过程中分子的动态变化，可以作为肿瘤早期生物学标记物检测肿瘤对TKI的反应。ctDNA可用来评估原发肿瘤根治性切除后的小残余灶，从而准确识别高复发风险病人，并对其进行辅助治疗。

4.1 疾病状态评估 Maier等［12］回顾性分析38例GIST病人的291份血浆样品的KIT和PDGFRA基因突变检测结果表明，突变ctDNA和疾病状态（疾病活动期和完全缓解）具有相关性。与完全缓解病人相比，疾病活动期病人的突变ctDNA检测呈阳性结果，疾病进展的病人突变ctDNA检测反复呈阳性结果且突变数量增加，阴性结果转阳性结果的病人出现疾病复发，阳性结果转阴性结果的病人对TKI重新有反应［12］。这些结果表明，突变ctDNA可以在GIST病人的血浆中进行检测和定量，且突变ctDNA的量与肿瘤负荷相关，因此将ctDNA作为替代性生物学标记物预测GIST的治疗反应和复发是可行的。

4.2 TKI疗效评估 大部分GIST病人在KIT或PDGFRA基因突变所致的蛋白表达异常时会引起持续的酪氨酸激酶活性。由于上述基因特定区域的突变与TKI药物反应相关，因此TKI治疗前应当行基因突变分析［22］。了解GIST基因突变状态有利于临床医生对不可手术切除或转移的GIST病人选择特定的TKI［10］。TKI治疗效果评估一直以来采用组织活检和RECIST标准（基于传统影像学如CT、MRI图像中肿瘤大小和病灶数量变化的评价方法），但临床实践中，有时活检标本难以获取，且反复取活检标本缺乏安全性与可行性，影像学检查对病情变化也不敏感，无法对疗效进行实时检测且缺乏预测价值。分析血浆ctDNA是很好的替代方法。ctDNA检测允许连续采样和分析；检测已知分子和新发生的分子变化，提供疾病动态的分子变化；监测继发性耐药的发生和识别异质性亚克隆肿瘤细胞发展；早期发现肿瘤细胞分子亚型和抗性改变。将允许治疗个性化，使用特定TKI药物或联合其他药物，以根除抗药性克隆或延缓抗药性发生进展。

一项日本的研究也发现，外周ctDNA的丰度变化与伊马替尼、舒尼替尼临床治疗的疗效变化是一致的，尤其是在术后接受伊马替尼辅助治疗而影像学检查无肿瘤征象的病人［20］。原发KIT或PDGFRA基因突变的类型在原发性肿瘤中具有预后价值［22］，也对TKI治疗效果具有预测性［23-24］。ctDNA检测可有效监测病情变化和准确评估辅助治疗疗效，也可早期预测肿瘤复发的可能。

众所周知的激酶基因型肿瘤对TKI的反应关系已使GIST治疗成为分子生物学应用在固体肿瘤治疗中的典范，并为GIST诊疗应用液体活检提供了一个很强的理由。特别是连续采集血样能实时评估在治疗过程中的分子修饰变化，监测肿瘤对TKI治疗的敏感性，能识别异质性耐药克隆的发生，从而优化了治疗策略变化的时间。这种非侵入性的方法不仅能预见治疗的变化，还可指导临床医生根据轮换战略再次挑战使用该药物。

4.3 手术疗效评估 GIST主要的治疗目标是手术完整切除肿瘤，ctDNA突变是潜在的高特异性的生物学标记物，根治性手术后检出ctDNA提示病人存在小残留病灶，且可以因此识别出即将经历复发的肿瘤病人。ctDNA水平能反应全身肿瘤负荷，病人术前检测ctDNA，其一系列血液采样显示ctDNA水平变化和手术切除的程度相关。当手术切除完整时，ctDNA水平降低；当影像学检查出现新的病灶时ctDNA水平升高。术后采血检出ctDNA，病人通常在1年内复发。术后ctDNA持续出现，提示病人术后预后不良［3］。

研究表明，局部GIST病人术前可在血浆中检测到原发KIT基因突变［25］，将有助于临床医生在手术前做出正确的诊断和合适的治疗决策。在切除GIST病人原发肿瘤之前，可以ctDNA检测替代组织活检来鉴定可能存在的突变，ctDNA检测也可作为当组织活检检测原发突变的样本过小或不适合标准突变分析时的替代方法。ctDNA可以进一步用于评估术后微小残留病灶导致复发的可能，术后检测出现ctDNA突变阳性结果可以提示使用辅助治疗。

5检测ctDNA评估进展期GIST病人预后

微创“液体活检”尤其对以分子异质性为特征的晚期癌症具有临床优势［4，6］。有研究显示，血清来源的ctDNA继发性KIT基因突变的存在与病人总生存期的减少显著相关［26］。一项研究显示，ctDNA突变是进展期GIST病人的独立预后因子，DNA 异倍体是GIST预后的负性影响因素，KIT基因突变的检测有助于评价预后［7］。因此，ctDNA突变检测可能是评估TKI耐药GIST病人预后的一个有前景的工具，也可能是未来进行针对TKI耐药GIST继发突变的新药临床试验的一个有用策略。

6其他应用

对于分子生物学异质性较大的GIST，特别是未发现存在KIT、PDGFRA基因突变或BRAF、RAS、NF1或SDH突变的GIST（称为WT GIST），ctDNA可通过使用高通量技术的全基因组分析获得广泛的GIST分子特征，且可能是最好的检查工具。

ctDNA可以克服获取新鲜组织的局限，识别染色体新的变化如重排和易位，将有助于对GIST进行更详细的分子分型，阐明新的诊断和预后，并最终发现新的潜在靶点，从而对GIST的亚型进行个体化治疗。此外，ctDNA检测也可以用于根据病人的分子概况选择临床试验的对象，而非仅依靠目前采用的临床标准和病理特征进行选择。

总之，虽然迄今为止积累的数据很少，但包括ctDNA检测在内的液体活检技术是穿刺活检很好的补充，正在成为最具挑战性和最有前景的肿瘤学应用工具，未来甚至有可能取代穿刺活检，提供广泛的临床应用。GIST治疗作为分子生物学技术应用于固体肿瘤治疗的典范，被认为是液体活检应用领域的最佳代表。