骨肉瘤血行转移与CXCR4、VEGF相关性研究

200233 上海 上海交通大学附属第六人民医院肿瘤内科

林峰 汤丽娜 沈旭东 姚阳

（发表于2009年5月《中德肿瘤临床志》）

摘要 目的 探讨趋化因子受体CXCR4和血管内皮细胞生长因子（VEGF）在骨肉瘤组织中的表达及其与血行转移的相关性。方法 应用组织芯片技术检测56例骨肉瘤组织中CXCR4和VEGF表达并随访其术后2年内远处血行转移的情况。结果 56例骨肉瘤组织中CXCR4和VEGF表达彼此相关。单因素分析显示年龄、性别与CXCR4、VEGF表达不相关，而临床分期、ALP水平升高与CXCR4、VEGF的表达均相关。结论 VEGF是骨肉瘤血管生成过程中最重要的正向调节因子，并且可能通过调节CXCR4的表达，促进肿瘤细胞向特异性靶器官迁移；CXCR4和VEGF表达可作为骨肉瘤预测血行转移的指标。

[关键词]骨肉瘤;CXCR4;VEGF;转移

血行转移是骨肉瘤的主要转移途径，肺部是骨肉瘤转移的主要靶器官。原发部位骨肉瘤细胞增殖过程中，侵袭并突破基底膜，肿瘤性血管生长，瘤细胞穿入血管，在循环系统中存活并运行，滞留于靶器官的微小血管中，再穿出血管形成微小转移灶，逐渐增大增多，形成临床影像学上可显示的转移灶。本研究旨在探讨血管生成相关因子VEGF和趋化因子CXCR4与骨肉瘤血行转移的相关性。

资料和方法

1．研究对象：全部病例选自2002年1月至2006年6月间在上海交通大学附属第六人民医院住院治疗的骨肉瘤患者，符合筛选条件的共56例。56例患者中，男性30例，女性26例。发病年龄7～67岁，平均22.04岁，中位年龄18岁。随访时间为8～58个月，平均随访时间23.50个月，中位随访时间20个月。复发11例，转移31例，死亡19例。组织学类型：普通型51例（骨母细胞型35例，软骨母细胞型9例，纤维母细胞型5例，硬化型2例），特殊类型5例（血管扩张型2例、髓内高分化型2例，皮质旁型1例）。按Enneking 临床分期：Ⅱb期44例， III期12例。HE切片由两位资深病理学医生诊断核实。

2．组织芯片检测：所选病例蜡块作3～4nm的连续切片，采用组织芯片技术检测CXCR4和VEGF蛋白表达，多克隆抗体CXCR4为武汉博士得公司产品，工作浓度1：400，鼠抗人单抗VEGF（即用型）试剂及SP试剂盒购自福州近新公司，实验室操作按试剂盒说明书进行，CXCR4、VEGF经高温、高压修复抗原。磷酸盐缓冲剂（PBS）代替一抗作阴性对照，用已知阳性组织切片作阳性对照。

3．结果判定标准：（1）CXCR4以骨肉瘤细胞核或胞浆内出现橘黄色颗粒为阳性，高倍镜（×400）对每张切片随即选择5个视野，计数100个细胞，共500个，没有染色或核染色阳性细胞数<1％为阴性，核染色1%~10%和/或较弱的胞浆染色为弱阳性，核染色11％～50％和/或明显的胞浆染色为强阳性。本研究中弱阳性～强阳性均为阳性表达。（2）VEGF蛋白胞浆内出现橘黄色颗粒为阳性。高倍镜（×400）对每张切片随即选择5个视野，计数100个细胞，共500个，阳性细胞数<10％为阴性，10%~20%为弱阳性，20％～50％为中度阳性，>50％为强阳性。本研究中弱阳性～强阳性均为阳性表达。

4．随访：入选病例随访2年，观察2年内远处转移情况。

5． 统计学方法：所有数据统计均在SPSS10.0软件上进行非参数X² 检验。

结 果

1．56例骨肉瘤组织中CXCR4阳性表达21例，表达率37.5%;VEGF阳性表达36例，阳性表达率64.3％。CXCR4和VEGF在骨肉瘤中表达存在正相关关系（r：P：）见表1

表1 CXCR4和VEGF表达相关性

CXCR4 例数	VEGF
	阳性 阴性
阳性 21 13 8 阴性 35 8 27
P值

2．单因素分析提示CXCR4和VEGF的表达与患者年龄、性别无关，而与肿瘤分期、血ALP水平升高相关。II期阳性率低于III期，ALP水平升高者其CXCR4、VEGF表达率高。见表2。

表2 56例骨肉瘤组织中CXCR4、VEGF表达和分期、ALP水平等的相关性

临床特征 分组 n	CXCR4	P值	VEGF	P值
	阳性 阴性		阳性 阴性
年龄 <15 18 7 11 8 10 ≥15 38 14 24 28 10 性别 男 31 12 19 20 11 女 25 9 16 16 9 分期 II 46 13 33 27 19 III 10 8 2 9 1 ALP >130 21 13 8 16 5 <130 35 8 27 20 15

3．56例均成功随访2年，随访率100％。随访时间8～58个月。平均23.5个月。全组2年内发生远处转移共31例,其中确诊时已有转移的12例，2年内新发生远处转移者19例。31例远处转移患者中，肺转移30例，合并骨转移4例，合并肝、脾转移1例，1例合并淋巴结转移，单纯骨转移1例。56例随访病例的CXCR4、VEGF的表达与远处转移相关。见表3

表3 56例骨肉瘤CXCR4、VEGF表达与血行转移相关性

远处转移 例数	CXCR4		VEGF
	阳性 阴性		阳性 阴性
有 31 15 16 24 7 无 25 6 19 12 13
P值

讨 论

CXCR4广泛存在于许多正常组织中，功能性CXCR4蛋白在外周血淋巴细胞、T细胞、内皮细胞和肝脏干细胞上均有表达^[1]。近来不少研究报道，趋化因子CXCL12及其特异性受体CXCR4在多种肿瘤的播散和器官的特异性转移中发挥着重要的作用。包括控制白细胞浸润至肿瘤、调节肿瘤相关的血管生成、激活宿主对肿瘤细胞增殖、控制肿瘤细胞运动^[2]。不同的肿瘤细胞高表达特异性的趋化因子受体，肿瘤细胞借助趋化因子与受体的特异性结合力，最终向远处器官特异性的转移。该过程中，趋化因子通过与G蛋白偶联受体的相互作用，引起靶细胞支链重构，牢固的粘附与内皮细胞和定向迁移。高表达CXCR4的肿瘤细胞，可能在CXCL12趋化、牵引下，逆浓度梯度转移至作为配体产生源的某些器官，形成器官特异性的转移^[3]。值得一提的是，通常一种受体可与多种趋化因子结合，唯一例外的是CXCL12,因为CXCR4是CXCL12的唯一受体^[4]。CXCL12/CXCR4生物学轴在肿瘤转移中的作用已在多种肿瘤的研究中得到证实。

VEGF是骨肉瘤血管生成过程中最重要的正向调节因子，它可促进血管内皮细胞的有丝分裂，扩张血管，增加血管内皮细胞的通透性，诱导内皮细胞表达纤维蛋白酶原激活因子（PA），金属蛋白激酶和间质性胶原酶，促进血管基底膜的降解，为内皮细胞迁移、生长创造条件^[5、6]。VEGF还可通过瘤细胞自分泌途径诱导CXCR4大量表达，促进肿瘤细胞向特异性趋化因子迁移^[7]。Bachelder等^[8]研究表明在乳腺癌细胞中VEGF调节CXCR4的表达，而高表达的乳腺癌细胞在趋化因子CXCL12牵引下迁移至某些器官。这种迁移有赖于乳腺癌细胞自分泌的VEGF。Yoshinao Oda^[9]等将30例骨肉瘤患者原发灶和转移灶的CXCR4及VEGF免疫组化表达情况作比较，结果提示转移灶中CXCR4的表达高于原发灶，但VEGF在两处的表达无明显差异。同时研究还表明CXCR4的表达和VEGF有明显相关性（P＝0.0269），VEGF表达阳性患者预后差。

本研究运用组织芯片技术检测56例骨肉瘤组织中CXCR4和VEGF的表达情况。其中CXCR4阳性表达21例，表达率37.5%,VEGF阳性表达36例，阳性表达率64.3％。结果与有关文献报道较接近。统计学分析表明，CXCR4与VEGF表达相关，相关系数r＝。在单因素分析中，年龄、性别与CXCR4、VEGF表达均不相关，而分期、ALP水平与两者相关，提示这两者影响骨肉瘤的发生、发展。本研究还表明，VEGF阳性表达患者2年转移率为66.7％，CXCR4阳性表达患者2年转移率为71.4％，分别高于两者阴性表达者（35.0%和45.7％），提示CXCR4和VEGF的表达增高与骨肉瘤血行转移有关。

鉴于骨肉瘤血行转移的机制，在骨肉瘤患者中，术后可结合VEGF表达情况，筛选出具有血行转移潜质的患者，给与个体化治疗，如使用血管生成抑制剂，在提高治愈率的基础上，减少不必要的药物和/或放射性损伤。而CXCL12/CXCR4作为一种与肿瘤侵袭、转移密切相关的因子，可视为一种新的肿瘤标记物和肿瘤治疗的新靶点，在肿瘤侵袭转移的判断和治疗方面有着重要的临床意义。

参考文献

1． Balkwill F. The significance of cancer cell expression of the chemokine receptor CXCR4[J].Semin Cancer Biol,2004,14(3):171-179

2． Balkwill F. Semin Immunol,2003,15(1):49-55

3． Matteucci E et al. Exp Cell Res,2005,310(1):176-185

4． 蒋玉萍，吴小华。趋化因子CXCL12及其受体与肿瘤转移的关系。癌症，2007，26（2）：220－224

5． Saaristo A. Mechanism of angiogenesis and their usee in the inhibition of tumor growth and metasasis.Oncogene,2000,19:6122-6129

6． George W.Sledge JR. Vascular endothelial growth factor in breast cancer:biologic and therapeutic aspects.Semin-Oncol,2002,29:104-110

7． Ceradini DJ ,Kulkarni AR, Callaghan MJ,et al.Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxicgradients cell through HIF-1 induction of SDF-1[J]. Nat Med,2004,10(8):858-864

8． Caroline Laverdieve,Bang H .Hoang,Rui Yang et al.Messenger RNA Expression Levels of CXCR4 Correlate with Metastatic Behavior and Outcome in patients with osteosarcoma.Clin cancer Res 2005,11(7):2561-2567

9． Yoshinao Oda,Hidetake Y amamoto,Sadafumi Tamiya,et al.CXCR4 and VEGFexpression in the primary site and the metastatic site of human Osteosarcoma:analysis within a group of patients,all of whom develop lung metastasis.Modern Pathology,2006,19:738-745