卡托普利晚期预处理对缺氧复氧损伤诱导血管内皮细胞凋亡时Caspase蛋白表达的抑制作用

文献综述

卡托普利干预细胞凋亡作用研究进展

卡托普利是第一个口服有效的血管紧张素转化酶抑制剂，自从1981年由美国FDA批准用于治疗高血压以来，卡托普利在治疗充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重构和糖尿病肾病中取得了良好的疗效。它在血管紧张素转化酶抑制剂中应用范围最广^[1]。随着相关基础科学的迅猛发展和对卡托普利药理作用研究的深入，近来人们在大量的动物和临床实验中发现卡托普利具有抑制和诱导细胞凋亡的双重作用^[2-7]，本文采用文献回顾的方法对卡托普利干预细胞凋亡的作用及相关机制作一综述。

1卡托普利的药理作用

卡托普利是含有巯基（SH）的血管紧张素转化酶抑制剂,它不但具有其他的血管紧张素转化酶抑制剂药理作用：（1）阻止血管紧张素II(AngII)的生成和作用；（2）保存缓激肽的活性；（3）保护血管内皮细胞与抗动脉粥洋硬化作用；（4）抗心肌缺血和心肌保护作用；（5）增加糖尿病病人对胰岛素的敏感性；（6）阻止心血管病理性重构，而且能通过所含有的巯基清除氧自由基，抑制脂质过氧化反应，起到稳定线粒体膜的作用^[8]，此外卡托普利还具有抑制单核巨噬细胞产生肿瘤坏死因子，白细胞介素等细胞因子的免疫学效应^[9]。

2: 细胞凋亡

2.1 细胞凋亡的概念及其基因调控

细胞凋亡是指在一定的生理和病理条件下,遵循自身的程序通过启动内部机制,主要是内源性DNA内切酶的激活,从而结束其生命的过程.目前的研究表明，细胞凋亡是基因调控的一种细胞死亡的特殊形式，其调控基因可分为促凋亡基因，包括野生型P53.c-myc，c-fas，c-jun，bcl-bax，ras，IC等基因；抑凋亡基因主要包括Bcl-2和突变型P53。自1972年Kerr^[10]等首次提出细胞凋亡概念以来, 细胞凋亡一直是近年来医学界的研究热点.

2.2细胞凋亡的通路

细胞凋亡的通路主要有两条,一条是死亡受体途径^[11]：死亡受体属于肿瘤因子受体(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞内部分含有一个死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配体是一个同源三聚体，每个三聚体分子结合3个Fas分子。一旦与三聚体的配体相结合，Fas通过胞内段的DD和FADD羧基端的DD之间的相互作用，募集胞质中的衔接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas区域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡诱导信号复合体（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增强，而自我剪切活化 。活化的Caspase-8释放到细胞质中即激活Caspase—3，引起细胞凋亡；另一条是线粒体途径^[12]：线粒体通路^[2]：各种促凋亡信号如DNA损伤、生长因子去除等诱导线粒体释放细胞色素C，在ATP/dATP存在的情况下，细胞色素C结合到Apaf-1的WD40重复区域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-细胞上色素C多聚复合体。此复合体通过Apaf-1的氨基端的CARD与Caspase-9原域的CARD之间的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞质的Caspase—9。Caspase—9酶原之间因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作为起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3促使细胞凋亡。

3卡托普利抑制细胞凋亡

3.1卡托普利抑制AngII诱导的细胞凋亡

AngII对细胞凋亡有重要的影响，但作用机制较复杂，不同的细胞表现出不同的作用：既可以引起细胞凋亡，也可以引起细胞增生^[13]，这主要与AngII和其相应的受体AT₁，AT₂结合所发挥的生物学效应有关。Goldenberg I^[14]等实验发现AngII与其相应的受体AT₁，AT₂结合并共同作用，在增加AT₁，AT₂受体蛋白的表达的同时并明显上调促凋亡基因的表达，进而激活caspase-3导致细胞凋亡。但亦有研究表明：AT₁受体和AT₂受体与AngII结合而发挥的作用相反：即AT₁受体与AngII结合具有促进细胞增生的作用；AT₂受体与AngII结合具有诱导的细胞凋亡作用^[15]。这与Liangxuguo^[16]等应用卡托普利和氯沙坦干预由AngII所诱导的血管内皮细胞凋亡的实验内结果相一致：氯沙坦作为AT₁受体拮抗剂，虽然阻断了AngII与AT₁的结合,但对AngII所诱导的细胞调亡无影响，从而说明AT₁受体在AngII所诱导的细胞凋亡过程中无明显作用；而使用卡托普利能部分抑制AngII诱导的血管内皮细胞凋亡，其可能机制为卡托普利通过抑制血管紧张素转化酶的活性，阻止了AngI转换为AngII，从而不但使AngII所产生的氧自由基和炎性介质减少，而且部分阻断AngII与其相应受体结合所至的细胞凋亡作用。同时，还能降低促凋亡基因表达，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从分子水平发挥抗细胞凋亡的作用^[17]。此外还与卡托普利能减少缓激肽的降解，增加NO的分泌有关^[18]。

3.2卡托普利抑制氧自由基诱导的细胞凋亡

氧自由基可以通过直接损伤DNA，攻击含有酶活性的蛋白质，影响核基因转录，引发脂质过氧化反应等多种途径诱导细胞凋亡。这已经在大量的实验中得以证实。同时，亦有实验证明用抗氧化剂或氧自由基清除剂干预氧自由基诱导的细胞凋亡，能通过阻止P53的激活。下调.BAX的表达和降低Caspase-3的活性而抑制细胞凋亡^[19]。而卡托普利本身含有巯基（SH），不但具有抑制微粒体脂质过氧化反应及白细胞产生氧自自由基的作用，而且本身是强有力的氧自由基清除剂 ^[20]。Tambd^[21]等研究发现卡托普利对缺血再灌注过程中产生氧自由基所至的细胞凋亡具有明显的抑制作用，这与我国学者胡青松等^[22-23]等研究发现卡托普利具有抑制羟自由基诱导血管内皮细胞、心肌凋亡的结论相一致。由此可见，卡托普利通过抑制和清除氧自由基的双重作用来阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇而激发PT孔开放，同时，卡托普利所含有巯基（SH）可使PT孔处于关闭状态^[24]，稳定了线粒体膜电位，阻止Cyt-C及凋亡诱导因子（AIF）从线粒体中释放，阻断细胞凋亡的线粒体途径，从而抑制细胞凋亡。同时卡托普利对线粒体复合体II-III质子泵出速度和电子传递速度升高有调节作用，使质子偶联更紧密，从而保护线粒体的呼吸功能，改善细胞的能量代谢^[25]，有效阻止氧自由基所造成的细胞内钙超载。

3.3卡托普利阻止缓激肽降解而抑制细胞凋亡

实验证明卡托普利能通过减少缓激肽的降解，使增加的缓激肽通过与其β2受体结合,进而激活磷酸酯酶C(PLC),产生的IP3使细胞内Ca²⁺释放而一氧化氮合酶（NOS）和上调ecNOS，从而增加一氧化氮（NO）的产生^[26]。NO对细胞具有双重作用，即在通过产生氧自由基介导细胞凋亡的同时，可以通过抑制Caspase酶活性而产生抗细胞凋亡作用，作用结果与细胞类型和NO的量有关^[27]。Dimmelers^[18]等实验证明NO能通过抑制Caspase酶活性而阻断AngII所致的细胞凋亡作用，但Fukuok ^[28]等实验发现NO能通过上调Fas及Bax的表达而介导细胞凋亡。因此我们可以认为卡托普利可能一方面通过适当增加NO水平，另一方面通过其所含有巯基（SH）而清除过量的NO产生的氧自由基而共同发挥抗细胞凋亡的作用。此外，通过缓激肽-NO 途径可以激活蛋白激酶C，降低细胞代谢水平，降低ATP及氧的需求，改善细胞的能量代谢，阻止细胞凋亡^[29]。

3.4 其他

最近研究发现卡托普利能阻断由Fas受体介导细胞凋亡：UhalBD^[4]等研究发现卡托普利通过降低肺泡上皮细胞表面的Fas和其配体（Fasl）的表达而抑制凋亡。此外Odakac Mizuochi T^[30]等证实卡托普利通过干扰外周T细胞表面的Fas和Fasl之间的相互作用，并能降低凋亡过程中产生的Caspase-3类似物的活性而抑制凋亡。这为我们研究卡托普利在自身免疫病的应用开辟了新的道路。

4卡托普利诱导细胞凋亡

已有实验证明卡托普利具有促进细胞凋亡的作用，Buemi M^[5]等发现在实验中卡托普利0.23mg可以引起血管平滑肌细胞凋亡数目增加，同样Anne Mette^[6]等动物模型中发现卡托普利通过诱导血管平滑肌细胞凋亡而抑制受损伤后血管内膜的增生狭窄。这其中的具体机制还不清楚，可能是卡托普利能降低心肌梗死后血管内膜AngII的AT₁受体的mRNA的表达^[31]，从而引起AngII与AT₁结和所致的细胞增生及抗凋亡作用减弱，而与AT₂ 受体结合所致的细胞凋亡作用增强的结果^[32-33]。此外Ohwada T^[34]等研究发现对大鼠血管拉伤后给予血管紧张素转化酶抑制剂治疗，不但可以明显增加新生内膜ecNOS的表达,同时也可上调iNOS的表达，导致NO产生过多，而过多NO能通过上调Fas及Bax的表达，下调Bcl-2的表达诱导平滑肌细胞凋亡^[28]。近来Glzzerman I^[7]等在临床上应用ACEI治疗肾移植术后病人发生的红细胞增多症取得了成功，并阐明其作用机制为ACEI能诱导肾移植术后病人Fas及其接头蛋白FADD的mRNA表达增加,上调其蛋白表达，但对BCL-2.Bcl-xl.Bax,caspase-8.caspase-3的表达无影响，从而通过激活死亡受体途径诱导祖红细胞凋亡。由此可见，卡托普利对细胞凋亡所具有促进的作用无疑有利于治疗冠状动脉手术后的内膜增生和再狭窄，同时也为其治疗IgA肾病及糖尿病肾病提供了新的理论基础。

问题和展望

综上所述，卡托普利具有抑制和诱导细胞凋亡的双重作用。但目前的问题是卡托普利为什么会产生两种截然不同的药理作用。我们推测这主要取决于细胞类型，卡托普利的剂量以及机体所处病理状态等因素，但具体的机制有待进一步研究。总之，卡托普利干预细胞凋亡的作用已经得到了共识：卡托普利通过阻断AngII与其受体之间的作用，减少氧自由基的产生，调控NO的合成，干扰Fas和Fasl之间的相互作用来激活或阻断细胞凋亡程序，从而抑制或促进细胞凋亡。我们有理由相信：通过对卡托普利抗细胞凋亡作用深入研究，无疑为探讨充血性心力衰竭，缺血再灌注损伤以及冠状动脉粥样硬化及手术后的再狭窄等带来突破，并可推动心血管疾病诊断及治疗的发展。

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立题依据

缺血再灌注损伤不但是心血管疾病中一种常见的病理现象，而且也是导致血管内皮细胞过度凋亡的主要原因之一；而细胞凋亡是缺血再灌注损伤的特征之一，细胞凋亡的多少决定了缺血再灌注损伤的轻重。故研究内皮细胞细胞在缺血再灌注损伤时凋亡的发生机制和利用药物来抑制VEC在缺血再灌注损伤所致的凋亡成为心血管研究领域中的重点课题。

缺血预处理（ischemic preconditionging，IPC）是体内最强大的保护机制，是一种多元性细胞防御现象^[1]：即预先反复短暂缺血可延缓或减轻组织后续缺血再灌注损伤的现象。而IPC的保护作用之一便是通过抑制缺血再灌注损伤后缺血区存活的心肌和血管内皮细胞发生可逆或不可逆坏死或凋亡来体现的^[2]。诱导预处理的因素从早期的缺血、缺氧、快速起搏和热应激到现在的药物预处理。但由于缺血本身是一种损伤，实施损伤性预处理由于伦理观念临床上还难以接受，故诱导预处理的研究已从缺血、生物、物理、化学源性扩展到药物性预处理（pharmacologic preconditioning）即通过药物激发或模拟机体内源性物质呈现的心脏保护作用。血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）具有药物预处理作用。目前研究表明， IPC对心脏的保护作用具有双时相性，即：心脏保护作用在2-3个小时后消失的早期或经典预处理；和反复短暂缺血后20-24小时缓慢出现的晚期预处理或延迟性保护作用或第二保护窗口。预处理的早期保护作用时间窗较窄，必须在缺血再灌注损伤前给予，故临床可操作性不强，相反，晚期预处理作用时间跨度大，在临床运用时更有可行性和便利性，因此，更具实用价值和开发意义。而且ACEI通过诱导或增强预处理早期心脏保护作用已有较多研究，而诱导预处理的延迟保护作用的报道不多，而且大多数ACEI为前体药，需要在体内代谢后才具有生物活性。而卡托普利是非前体药，具有生物活性，因此在我们的研究中，采用了卡托普利。IPC保护作用不仅存在于器官水平，而且存在于细胞水平；已有研究证明药物预处理是通过药物激发或模拟机体内源性物（腺苷，缓激肽，降钙素基因相关肽，前列环素（PGI2），一氧化氮（NO）等），而呈现的保护心肌和血管的作用。其研究方法也是通过模拟IPC而建立起来的，而我们采用模拟IPC而建立起来的前期实验已经证明卡托普利对内皮细胞进行晚期预处理后进行缺氧复氧损伤，结果发现细胞的凋亡现象明显减轻，从而证明卡托普利对缺氧复氧损伤导致的内皮细胞凋亡具有延迟保护效应，使细胞凋亡减少，并且在本实验所规定的浓度范围内，随着卡托普利浓度的增加此保护作用渐增强。但应用HOE₁₄₀阻断剂、PKC阻断剂、NOS阻断剂和NF-kB阻断剂，分别与卡托尽管作普利共同孵育细胞,再对内皮细胞行H/R损伤，可见卡托普利对H/R损伤导致内皮细胞凋亡的晚期保护效应部分消失。证明卡托普利是通过激活缓激肽B₂受体、PKC途径、NOS合成以及核因子的转录过程，保护内皮细胞，抑制细胞凋亡的，但其具体作用靶点仍有待于进一步的研究。

半胱氨酸蛋白酶（Caspase）家族目前被认为是与凋亡最为密切相关的一类蛋白酶，凋亡的发生是细胞中Caspase家族凋亡蛋白特异性活化的结果。其中Caspase-3、Caspase- 8、Caspase-9在细胞凋亡经典途径中的重要凋亡蛋白，在凋亡过程中起着关键作用，而目前对卡托普利预处理与Caspase蛋白表达的关系研究在国内外报道均未多见，故本实验根据以往的研究结果，采用免疫组化的方法来检测Caspase-3、Caspase- 8、Caspase-9的蛋白表达来探讨以下问题：

1 缺氧/复氧损伤诱导血管内皮细胞凋亡途径的研究。

2.ACEI晚期预适应抑制缺氧复氧诱导血管内皮细胞凋亡的作用靶点。

以进一步明确缺血再灌注损伤和ACEI晚期预适应抑制细胞凋亡的的相关机制，为临床应用提供新得理论基础和治疗靶点。

内 容 提 要

缺血再灌注损伤可以导致内皮细胞结构改变和功能失调，进而引起细胞发生一系列变化，例如细胞内钙离子超载、脂质过氧化反应增加、大量自由基产生、细胞膜通透性增强、蛋白含量降低等变化，最终引起细胞死亡或凋亡。自从1986年Murry等首次发现预处理现象至今，缺血预适应（IPC）的机制尚不十分明确，但多年的研究明确证实，IPC是最强大的内源性保护机制，其心脏保护作用主要表现在限制心梗范围，减少恶性心律失常的发生和改善心功能等。药物预处理研究的发展，避免了缺血的损伤，更符合医学论理学。近年来发现，IPC及其药物预适应对缺氧再灌注损伤的血管床亦有保护作用。但无论是缺血还是药物预适应，特别是晚期预适应，其研究的重点多集中于对心肌细胞的保护，而对内皮细胞与缺血再灌注损伤的研究、预适应特别是晚期预适应保护内皮细胞免受缺血再灌注损伤的研究还不多见，仅少数实验涉及此方面的研究，相关文献报道较少用。在实验中，我们通过建立血管内皮细胞缺血再灌注（缺氧复氧）损伤模型,以探讨ACEI预适应对血管内皮的延迟保护作用及其机制。

实验研究结果显示：1. 缺氧复氧损伤引起血管内皮细胞凋亡的病理过程中，caspase-3,9被激活，并且随着复氧时间的延长，caspase-3，9表达逐渐增加，提示caspase-3,9参与了缺氧复氧损伤诱导血管内皮细胞凋亡的病理过程；同时caspase-8表达在这个过程中无明显变化，因而我们可以从中推测缺氧复氧损伤导致血管内皮细胞凋亡主要是通过线立体途径进行的。2. 卡托普利预处理组的Caspase表达变化与缺氧/复氧组相似，但明显下降,有此可见，卡托普利预处理可以通过影响缓激肽B₂受体、一氧化氮产生等多种途径来降低caspase-3,9的表达来抑制细胞凋亡而发挥血管内皮的保护作用, 且此保护作用具有剂量依赖性。由此可见，卡托普利预处理对血管内皮的保护作用涉及多种机制。这对于维持血管内皮细胞的屏障功能和内分泌功能，减轻缺血后的炎症反应，维持血流稳定和血管的紧张性调节具有重要意义。本研究将进一步阐述卡托普利的作用机制，为其临床应用提供新的作用空间。

关键词：细胞凋亡 卡托普利 Caspase-3,8,9 缺血再灌注损伤

第一部分：缺氧/复氧损伤诱导血管内皮细胞凋亡途径的研究

前言

细胞凋亡是细胞的程序化死亡，是由一系列高度调控的半胱氨酸蛋白酶（caspase）级联反应（cascade）事件的结果，而caspase-3又被证实处于该级联反映的下游，是凋亡的真正执行者； caspase-8,9又分别做为细胞凋亡的两条主要途径中caspase-3的激活剂，故三者在细胞凋亡中起着重要作用。而缺血在灌注损伤不但是心血管疾病中一种常见的病理现象，而且也是导致血管内皮细胞凋亡的主要原因之一，目前关于缺血再灌注损伤诱导细胞凋亡的研究多集中于神经元细胞和心肌细胞，对血管内皮细胞的凋亡机制了解不是很多。而且，缺血再灌注损伤可引起细胞凋亡已在大量实验中得以证实，故本实验对此不在重复，重点是通过对培养的人脐静脉内皮细胞进行缺氧/复氧来模拟缺血再灌注损伤这一病理过程，并采用免疫组化的方法检测caspase-3,8,9的表达，来进一步探讨和阐明缺血再灌注损伤导致细胞凋的相关机制和caspase3,8,9在细胞凋亡中所起的作用。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验仪器

二氧化碳培养箱(RAK 日本) 倒置相差显微镜(OLYMPUS公司)

恒温水浴箱(H₂S-H 哈尔滨) 加样器(Labsystem芬兰)

显微镜自动暴光系统（（OLYMPUS pm20）

超净工作台（SW-CT-EFD苏州）

低温台式离心机（AERMLE Z383K 德国）

1.1.2实验药品与试剂

人脐静脉内皮细胞株（购置中国科学院上海细胞库）

caspase-3,8,9单克隆鼠抗人抗体（Santa Cruz）

辣根过氧化物酶兔抗鼠抗体（Santa Cruz）

胰蛋白酶(trypsin)购自Difco公司.

高压氮气一瓶（上海比欧西气体工业有限公司）

胎牛血清和DMEM合成培养基购自Gibco公司。将干粉型DMEM培养基10g溶于三蒸水1000ml，在磁力搅拌器上混匀，过滤除菌，分装于250ml盐水瓶中4C保存。胎牛血清首次应用时先56℃灭活30min。用时现配制成含15%胎牛血清的DMEM：取胎牛血清15ml, HEPES（1mmol/L）1ml，L谷氨酰胺（0.2mmol/L）1ml, 抗菌素液(青霉素10,000U/ml链霉素10,000µg/ml)1ml, 加入DMEM82ml,然后用7.5%NaHCO₃调PH至7.4。配制无血清DMEM：DMEM 96ml，加入HEPES、L谷氨酰胺、抗菌素液各1ml，然后用7.5%NaHCO₃调PH至7.4。

HanK’s缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH₂PO₄ 0.06g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.13g，Na₂CO₃ 0.35g，CaCl₂ 0.14g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖·H₂O 10.9g，加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO₃调PH至7.4，过滤除菌，250ml瓶分装，4℃保存。

D-HanK’s缓冲液：NaCl 8.0g，KCl 0.4g，KH₂PO₄ 0.06g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.13g，Na₂CO₃ 0.35g，加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO₃调PH至7.4,高压除菌，250ml瓶分装，4℃保存。

PBS缓冲液: NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.5g,加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO₃调PH至7.4，过滤除菌，250ml瓶分装，4℃保存。

缺氧液：Na₂HPO4:0.9mmol/L；NaHCO3:6.0mmol/L ；CaCl₂：1.8mmol/L；MgSO4:1.2mmol/L;乳酸钠:40mmol/L;HEPES:10mmol/L; Nacl:98.5mmol;KCl:10.00mmol/L加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO₃调PH至7.4，过滤除菌，250ml瓶分装，4℃保存。

复氧液：Na₂HPO4:0.9mmol/L；NaHCO3 ：20.0mmol/L ；CaCl₂ ：1.8mmol/L；MgSO4:1.2mmol/L；glucose:55mmol/L；HEPES:10mmol/L; Nacl:129.5mmol；KCl:5.0 mmol/L加三蒸水至1000ml，混匀后用NaHCO₃调PH至7.4，过滤除菌，250ml瓶分装，4℃保存。

1.2 实验方法

1.2.1人脐静脉内皮细胞的培养

（1）体外培养的人脐静脉内皮细胞形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。

（2）2-3d换液一次。换液时将原培养液弃掉1/2-2/3，然后加入新鲜的培养液至原来的量。待细胞长至融合状态后，即可传代。

（3）原代培养的细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的D-Hank’s液清洗2次。加入0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞覆盖，室温（20-25℃）下消化1-2min。

（4）镜下见细胞稍收缩变圆、细胞间隙增宽后，立即翻转培养瓶，弃酶液。可再用D-Hanks液轻轻洗1次。加入IMDM培养液（pH7.2、100IU/ml青霉素、100µg/ml链霉素）和10%胎牛血清。

（5）用弯头吸管吸取培养液，轻轻将细胞吹打下来。调整细胞密度至大约1.5×10⁵个/ml。按实验需要接种到新的培养瓶或其他培养皿中。一般按1：2或1：3的比例传代（即1瓶传2-3瓶）。

（6）内皮细胞多次传代后，其形态和生物学特性会有所改变，故不宜做长期传代培养。如实验需要可重复从原代建立培养。因此，一般不做冷冻和复苏处理。

1.2.2 台盼蓝染色细胞记数

细胞记数对于决定植入的细胞浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度都是极为重要的。首先取待测的细胞悬液0.1ml加D-Hank’s0.8ml及0.3%台盼蓝0.1ml（死细胞着色），混合后滴入血球记数盘内，按白细胞记数法，于低倍镜下计数4角的4个大格内的活细胞数（透明未着色者），然后按下式记数：细胞浓度（细胞数/ml）=（4个大格内的活细胞数/4）×10⁴×稀释倍数（10）细胞存活率=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%

1.2.3缺氧复氧模型的建立

取培养至第3代的人脐静脉内皮细胞用缺氧液换液，95%氮气、37℃培养不同时间后，再以复氧液全量换液，并恢复5%CO₂气体环境正常培养，建立缺氧复氧模型。

1.2.4实验分组与方案

实验随机分两组：（1）对照组（C）：细胞置IMDM培养基中于5%CO2、370℃饱和湿度培养箱培养 （2）缺氧复氧组（H/R）：细胞于缺氧液、100%氮气、37℃条件下培养2小时后，全量换以复氧液，并恢复5%CO2气体环境分别培养1小时，2小时，3小时，4小时。

1.3 Caspase—3，8，9表达测定：

采用免疫组化染色的方法：收集以上各组细胞，于4℃多聚甲醛固定后过夜，再用0.5%H2O2—甲醇液处理30分钟（封闭细胞内源性过氧化物），再浸入到PBS中洗3×5分钟，滴加5%—10%的正常动物血清，室温，放湿盒中封闭30分钟，滴加一抗，湿盒内4℃过夜，再浸入到PBS中洗3×5分钟，滴加二抗，37℃，30分钟，浸入到PBS中洗3×5分钟，加入避光显色5—10分钟（室温），光镜下控制反应强度（棕色），浸入到PBS中洗3×5分钟，终止反应，经80%，90%，2×100%乙醇溶液脱水，二甲苯透明，每步1分钟，室温放置数分钟，使二甲苯完全蒸发掉，最后滴加1滴封片液。

1.4 细胞记数：

在培养孔边缘统计学分析和中心之间的位置随机选取4个区域进行细胞记数并取平均值，每个区域记数约200个细胞，每组有4个平行孔，计算阳性细胞占细胞总数的百分比.

1.5统计学分析

各种计量数据均以均数±标准差表示，各组数据间显著性检验采用t检验，多个样本均数比较及两两比较采用ANOVA，统计学分析应用SPSS软件包。P<0.05为差异有显著性。

2结果

2.1对照组的Caspase蛋白表达：对照组的细胞染色均很微弱，说明正常条件下Caspase-3,8,9的蛋白基本无明显表达，表明Caspase-3,8,9在正常条件下活性低下。

2.2缺氧复氧组的Caspase蛋白表达：与对照组相比,缺氧/复氧组中检测Caspase-3,9蛋白表达的细胞的染色明显，各组相比P<0.05差异有统计学意义这说明缺氧/复氧损伤使血管内皮细胞的Caspase-3,9蛋白表达明显增加，；而检测Caspase-8蛋白表达的细胞染色无明显染色，各组相比P>0.05差异无统计学意义，这说明Caspase-8在缺氧复氧损伤中没有明显表达，即没有参与这一病理过程。

2.3Caspase蛋白表达的时间依赖性：缺氧复氧组的血管内皮细胞Caspase-3,9的表达随着复氧时间的延长而进一步增加直到复氧四小时而达到顶峰。（表1）（附图1）

Table1 Changes of caspase-3.8.9 expression on HUVEC induced by hypoxia/reoxygenation

group	Caspase expression positive cells %
	Caspase-3 casepase-8 casepase-9
Control group 5.6±1.2* 3.3±1.4 6.4±2.2* hypoxia/reoxygenation1.0h 12.8±2.4* 3.2±2.2 22.6±2.4* hypoxia/reoxygenation2.0h 20.5±3.2* 3.6±2.6 32.8±1.8* hypoxia/reoxygenation3.0h 38.8±2.2* 3.5±2.1 42.2±3.2* hypoxia/reoxygenation4.0h 47.2±2.6* 3..8±1.6 52.8±2.6*

The expression of caspase-3,8,9 were detected by immunocytochemistry. the Caspase-3、9 were activated in HUVEC during hypoxia /reoxygenation and expression of caspase-3,9 were significantly increased fol lowed the time of reoxygenation extending;but expression of caspase-8 have no changes in HUVEC during hypoxia/ reoxyge nation.

3.讨论

缺血和缺氧有着极其相似的病理改变和发病机制，故设计利用培养的人脐静脉内皮细胞的缺氧复氧模型来模拟缺血再灌注损伤模型，旨在研究缺血再灌注损伤导致细胞凋亡的可能机制及Caspase家族相关的蛋白酶的表达变化。为了更好的模拟在体时细胞的缺血再灌注状态，在缺氧时我们采用缺氧液培养细胞，除造成缺氧外，同时限制糖，钙及液体量，而在复氧时则用含糖，钙的复氧液，并给予充分的氧，以满足再灌注的条件。

在本实验中，我们发现在对照组的HUVEC的Caspase-9仅低水平表达，但实验组在缺氧两小时后再进行复氧的过程中，在复氧早期Caspase—9，表达即开始增加，并随着复氧的时间的延长而逐渐增加，在复氧四小时达到顶峰。这无疑提示Caspase—9在缺氧/复氧诱导HUVEC凋亡这一病理过程中被激活并参与了这一病理过程。

细胞凋亡是由于细胞程内外环境变化或死亡信号触发以及在基因调控下所引起细胞主动死亡的过程，这一过程一般要经历启始阶段、效应阶段和降解阶段（Initiation phase、Effect phase and Degradation phase）三个阶段^[3]。启始阶段时，细胞受到来自外界的各类凋亡信号的刺激以引发细胞内一系列生化反应；效应阶段时，细胞内进行各种生化反应而形成细胞凋亡的一条或数条信号传导通路，其中包括必须的四大关键元件：线粒体，Caspase ，bcl-2s和Apaf-1。最终细胞进入降解阶段时，多种水解酶（包括特异性蛋白酶Caspase 和核酸酶）被活化，细胞内表现为DNA的降解，细胞质和细胞核浓缩，细胞体积缩小，质膜发泡，最终细胞裂解，凋亡小体形成并被周边吞噬细胞吞噬降解。由此可见，Caspase家族在细胞凋亡中发挥着极为重要的作用。Caspase家族的分子量在30-50KD之间，包括三个结构域：氨基端的原域、大亚单位（约20KD）、和小亚单位（约10KD）。根据它们之间大小亚单位序列的同源性以及功能，可分为三组^[4]：（1）细胞因子处理组：Caspase-1、-4、-5、-11、-12、-13和-14；（2）凋亡起始组：Caspase-2、-8、-9和-10（3）：凋亡效应组：Caspase-3、-6和-7。细胞因子处理组和起始组Caspase酶原都含有较长的原域，长原域中包含有死亡效应域（DED）或Caspase募集域（CARD）。DED和CARD的结构与死亡域(DD)相似，都属于死亡域超家族。这些区域通过蛋白-蛋白的相互作用从而在Caspase酶原的激活过程中发挥重要作用。相比之下，效应组Caspase的原域很短，不可能通过这种方式激活。除此之外，Caspase还具备以下特点（1）：它是一种半胱氨酸蛋白酶，用半胱氨酸作为裂解底物的亲核集团（2）：其催化活性对底物的天冬氨酸有特异的要求，既催化时使底物的天冬氨酸残基羧基端的肽键断裂（3）：Caspase以活性很低的酶原形式合成，通过蛋白酶水解去处氨基端的一段序列而被激活。（4）：活化的Caspase能够特异性地水解一套底物，从而导致细胞凋亡，此过程为不可逆反应。（5）：正常情况下，细胞内Caspase与其抑制剂总是共存的，以免Caspase酶原被意外激活，对正常细胞造成损伤。正是这种Caspase家族组成的复杂性和独特的生物学特性才决定了不同的细胞含有不同的Caspase群体，不同的刺激激活不同的细胞凋亡信号传导途径，由不同的Caspase参与信号的级联放大反应，故发生细胞凋亡的机制也不尽相同。

在本实验中，我们还发现在复氧早期Caspase—3蛋白表达即开始增加，并随着复氧的时间的延长而逐渐增加，在复氧四小时达到顶峰。这无疑提示Caspase—3在缺氧/复氧诱导HUVEC凋亡这一病理过程中被激活并参与了这一病理过程。这与[MatsushitaH] ^[5]所进行的缺氧诱导内皮细胞凋亡时实验结果相一致。

Caspase-3基因（CASP-3）最初在人类Jurkat-T淋巴细胞中被克隆出的，该基因编码一个分子量为32KD的半胱氨酸蛋白酶CPP32，其活性中心和结合底物相关的保守氨基酸序列均与白细胞介素—Iβ转化酶（IEC）一致。其后，等研究发现CPP32酶原含有凋亡素，它由分子量为17KD和12KD的大小2个亚基组成，[Nicholson]等把它命名为Caspase-3^[6]。在Caspase-3酶原中存在一安全扣调解三肽，由“Asp-Asp-Asp”组成，位于大小亚基结合处可变形的环区中，凋亡发生时该三肽残基在胞浆内被酸化裂解，在Caspase-3的触发活化是起关键作用，因而它可能是整个凋亡级联反应的一个关键调节点^[7] 。正常情况下，Caspase-3是以休眠状态的酶原形式存在于正常细胞中，酶原的N端有一前区（prodomain），与Caspase-8、9等起始型Caspase相比，其前区较短，不含有DED，必须在起始型Caspase被激活后才能进一步被激活^[8]。Caspase-3的激活主要是通过两条细胞凋亡途径进行的：1死亡受体途径^[9]: 死亡受体属于肿瘤因子受体(TNFR)超家族,包括Fas, TNFR1,DR3 ,DR4和DR5,在胞内部分含有一个死亡域(DD),以此招募下游的凋亡蛋白。Fas配体是一个同源三聚体，每个三聚体分子结合3个Fas分子。一旦与三聚体的配体相结合，Fas通过胞内段的DD和FADD羧基端的DD之间的相互作用，募集胞质中的衔接蛋白FADD。FADD氨基端含有DED，此DED和Caspase-8原域的DED相互作用，把Caspase-8募集到Fas区域。Fas、FADD和Caspase-8形成了死亡诱导信号复合体（DISC）。Caspase-8酶原有弱的蛋白水解活性，在DISC中Caspase-8由于寡聚化水解活性增强，而自我剪切活化 。活化的Caspase-8释放到细胞质中即激活Caspase—3；2：线粒体通路^[10]：各种促凋亡信号如DNA损伤、生长因子去除等诱导线粒体释放细胞色素C。在ATP/dATP存在的情况下，细胞色素C结合到Apaf-1的WD40重复区域，促使Apaf-1寡聚化，形成Apaf-1-细胞上色素C多聚复合体。此复合体通过Apaf-1的氨基端的CARD与Caspase-9原域的CARD之间的蛋白—蛋白相互作用，以1：1比例募集胞质的Caspase—9。Caspase—9酶原之间因相互靠近自我剪切而活化。Caspase—9作为起始半胱氨酸蛋白酶激活下游的Caspase—3。Caspase—3激活时在Asp（pl）-x位置切开，形成大小亚基（α和β），同时去掉其N端的前区，进而α与β结合形成异二聚体（17KD-12KD）^[11]，酶的两个活性位点位于大小亚基的结合部，异二聚体还将进一步通过次级键形成四级结构（α/β）₂发挥作用。Caspase酶原被剪切而发挥作用时，其辨认序列从N端到切割位点至少要4个氨基酸，而且P1位点必须是Asp（D）。一旦Caspase—3被激活，其本身至少从三个方面导致细胞凋亡^[11]：（1）分解凋亡保护蛋白，如凋亡抑制性蛋白bcl-2家族（2）直接解聚细胞结构，如分解细胞骨架蛋白（α-spectrin, β-spectrin,actin,tau蛋白等）和调节细胞骨架的蛋白gelsolin。（3）使细胞内参与DNA复制和修复的蛋白酶失活或下调，而且激活其他的Caspase并且放大Caspase级联反应，最终导致细胞凋亡。

同时我们还从实验中发现Caspase—8的表达在缺氧/复氧诱导细胞凋亡的整个过程中，无明显变化，这说明Caspase-3的激活主要是通过线粒体途径由Caspase-9激活的，而不是通过细胞的死亡受体途径由Caspase-8激活的。这也进一步说明缺氧/复氧导致内皮细胞受损时，氧自由基大量产生和细胞内钙超载等多种机制引起线粒体的跨膜电位崩解，激发了细胞凋亡的线粒体途径而导致细胞凋亡。

4.结论

在缺氧复氧损伤诱导HUVEC凋亡的过程中， Caspase-3，-9蛋白表达明显增加，并随着复氧的时间的延长而逐渐增加，在复氧四小时达到顶峰。这说明Caspase-3， Caspase—9参与了缺氧/复氧诱导HUVEC凋亡这一病理；同时Caspase—8的蛋白表达在缺氧/复氧诱导细胞凋亡的整个过程中，无明显变化，从中我们可以推测缺氧/复氧诱导血管内皮细胞凋亡主要是通过线粒体途径进行的。

第二部分 ACEI预适应对缺氧复氧诱导血管内皮细胞凋亡时caspase-3,8,9的影响及机制

前言

IPC作为体内最强大的内源性保护机制，在缺血再灌注损伤中的作用已是不争的事实，IPC的保护作用不仅存在于器官水平，而且存在于细胞水平；不仅可以保护心肌细胞，还可以保护内皮细胞。然而，缺血本身是一种损伤，实施损伤性预处理由于伦理观念临床上还难以接受，故药物性预处理具有重要的研究价值。

卡托普利是第一个口服有效的血管紧张素转化酶抑制剂，自从1981年由美国FDA批准用于治疗高血压以来，卡托普利在治疗充血性心力衰竭，心肌梗死后的心室重构和糖尿病肾病中取得了良好的疗效。它在血管紧张素转化酶抑制剂中应用范围最广^[13]。随着相关基础科学的迅猛发展和对卡托普利药理作用研究的深入，近来人们在大量的动物和临床实验中发现卡托普利具有药物预处理的作用。

缺血再灌注损伤不但是心血管疾病中一种常见的病理现象，而且也是导致血管内皮细胞过度凋亡的主要原因之一，这已在大量的实验中得以证实，但对其发生机制的阐明还缺乏明确阐述。而且关于缺血及再灌注时细胞凋亡机制的研究,目前主要集中在神经细胞和心肌细胞,对VEC的研究较少。此外血管内皮细胞作为一个具有多种生物活性的器官，具有重要的生理功能，内皮细胞凋亡过度既是内皮细胞功能失调的始动环节，也是冠心病发生和发展的细胞学基础，也是不稳定型心绞痛、急性心肌梗死等急性心脏事件的促发环节，而且还能抑制心脏急性缺血后的血管再生，妨碍其功能的恢复。故研究缺血再灌注损伤导致VEC发生凋亡的机制,明确有效的阻断位点并加以阻断,对保护VEC,治疗缺血缺氧性疾病有重要的理论和现实意义。

本实验通过建立血管内皮细胞缺血再灌注（缺氧复氧）损伤模型,探讨ACEI预适应对血管内皮的延迟保护作用机制，为其抗缺血再灌注损伤作用提供实验依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验仪器

二氧化碳培养箱(RAK 日本) 倒置相差显微镜(OLYMPUS公司)

恒温水浴箱(H₂S-H 哈尔滨) 加样器(Labsystem芬兰)

显微镜自动暴光系统（（OLYMPUS pm20）

超净工作台（SW-CT-EFD苏州）

低温台式离心机（AERMLE Z383K 德国）

1.1.2实验药品与试剂

人脐静脉内皮细胞株（购置中国科学院上海细胞库）

caspase-3,9单克隆鼠抗人抗体（Santa Cruz）

辣根过氧化物酶兔抗鼠抗体（Santa Cruz）

胰蛋白酶(trypsin)购自（Difco公司.）

卡托普利纯品（中美上海施贵宝公司馈赠）

高压氮气一瓶（上海比欧西气体工业有限公司）

胎牛血清和DMEM合成培养基购自(Sigma Chemical Co.USA)

HanK’s缓冲液，D-HanK’s缓冲液

PBS缓冲液

缺氧液，复氧液

1.2 实验方法

1.2.1人脐静脉内皮细胞的培养

（1）体外培养的人脐静脉内皮细胞形态呈“鹅卵石样”镶嵌排列，细胞长满后呈接触抑制现象。

（2）2-3d换液一次。换液时将原培养液弃掉1/2-2/3，然后加入新鲜的培养液至原来的量。待细胞长至融合状态后，即可传代。

（3）原代培养的细胞长至融合状态后，弃培养液，用预温的D-Hank’s液清洗2次。加入0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA混合消化液，正好形成一浅层液面将细胞覆盖，室温（20-25℃）下消化1-2min。

（4）镜下见细胞稍收缩变圆、细胞间隙增宽后，立即翻转培养瓶，弃酶液。可再用D-Hanks液轻轻洗1次。加入IMDM培养液（pH7.2、100IU/ml青霉素、100µg/ml链霉素）和10%胎牛血清。

（5）用弯头吸管吸取培养液，轻轻将细胞吹打下来。调整细胞密度至大约1.5×10⁵个/ml。按实验需要接种到新的培养瓶或其他培养皿中。一般按1：2或1：3的比例传代（即1瓶传2-3瓶）。

（6）内皮细胞多次传代后，其形态和生物学特性会有所改变，故不宜做长期传代培养。如实验需要可重复从原代建立培养。因此，一般不做冷冻和复苏处理。

1.2.2 台盼蓝染色细胞记数

细胞记数对于决定植入的细胞浓度和数量以及了解细胞存活率和增殖度都是极为重要的。 首先取待测的细胞悬液0.1ml加D-Hank’s0.8ml及0.3%台盼蓝0.1ml（死细胞着色），混合后滴入血球记数盘内，按白细胞记数法，于低倍镜下计数4角的4个大格内的活细胞数（透明未着色者），然后按下式记数：细胞浓度（细胞数/ml）=（4个大格内的活细胞数/4）×10⁴×稀释倍数（10）细胞存活率=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%

1.2.3缺氧复氧模型的建立

取培养至第3代的人脐静脉内皮细胞用缺氧液换液，95%氮气、37℃培养不同时间后，再以复氧液全量换液，并恢复5%CO₂气体环境正常培养，建立缺氧复氧模型。

1.2.4实验分组与方案

实验随机分三组：（1）对照组（C）：细胞于IMDM培养基中于5%CO2、37℃饱和湿度培养箱培养 （2）缺氧复氧组（H2/R4）：细胞于缺氧液、100%氮气、37℃条件下培养2小时后，全量换以复氧液，并恢复5%CO2气体环境培养4小时。（4）卡托普利预处理组（CAP）：不同浓度的卡托普利（10^-2、10^-3、10^-4mol/L）预处理24小时后，对EC行缺氧2小时复氧4小时（H2/R4）方案。

1.3 Caspase—3，9蛋白表达测定：

采用免疫组化染色的方法：收集以上各组细胞，于4℃多聚甲醛固定后过夜，再用0.5%H₂O₂—甲醇液处理30分钟（封闭细胞内源性过氧化物），再浸入到PBS中洗3×5分钟，滴加5%—10%的正常动物血清，室温，放湿盒中封闭30分钟，滴加一抗，湿盒内4℃过夜，再浸入到PBS中洗3×5分钟，滴加二抗，37℃，30分钟，浸入到PBS中洗3×5分钟，加入避光显色5—10分钟（室温），光镜下控制反应强度（棕色），浸入到PBS中洗3×5分钟，终止反应，经80%，90%，2×100%乙醇溶液脱水，二甲苯透明，每步1分钟，室温放置数分钟，使二甲苯完全蒸发掉，最后滴加1滴封片液。

1.4 细胞记数

在培养孔边缘统计学分析和中心之间的位置随机选取4个区域进行细胞记数并取平均值，每个区域记数约200个细胞，每组有4个平行孔，计算阳性细胞占细胞总数的百分比.

1.5统计学分析

各种计量数据均以均数±标准差表示，各组数据间显著性检验采用t检验，多个样本均数比较及两两比较采用ANOVA，统计学分析应用SPSS软件包。P<0.05为差异有显著性。

2. 结果

2.1卡托普利最适浓度的筛选

待细胞生长达80%汇合以后,各组分别加入10-1mol/l，10-2mol/l、10-3 mol/l、10-4 mol/l 、10-5 mol/l 、10-6 mol/l 作用24小时,观察各组细胞的生长状况。收集全部的贴壁和漂浮细胞,用台盼蓝染色后在细胞计数板上进行活细胞计数。活细胞因其细胞膜的完整性而对台盼蓝拒染,死细胞被台盼蓝染成蓝色。活细胞百分数=未着色细胞数/细胞总数(着色细胞数+未着色细胞数)。以细胞生长不受影响而卡托普利浓度达最高时的浓度作为实验最大浓度。

2.2 Caspase蛋白表达的检测结果

2.2.1对照组的Caspase蛋白表达：对照组的细胞染色均很微弱，说明正常条件下内皮细胞Caspase-3,9的蛋白基本无明显表达，同时也说明Caspase-3,9在正常条件下活性低下。

2.2.2卡托普利预处理组的Caspase蛋白表达：与正常对照组细胞微弱的染色相比, 卡托普利预处理组的细胞细胞染色有所增加，与缺氧/复氧组的细胞染色相比则明显减少，各组细胞染色相比P<0.05，差异有统计学意义。这说明缺氧/复氧损伤使血管内皮细胞的Caspase-3,9蛋白表达明显增加，而卡托普利预处理可以明显降低凋亡细胞的Caspase-3,9蛋白表达。

2.2.3 Caspase蛋白表达的时间依赖性：卡托普利预处理组的Caspase3、9的表达且随着卡托普利浓度的增加而逐渐降低，这种抑制作用与卡托普利的浓度具有量-效关系。并随着卡托普利浓度的增加而Caspase-3,9的表达降低越明显，三者相比P<0.05，差异有统计学意义.。（表2）（附图2）

Table2 Effect of on caspase-3.8.9 expression on HUVEC induced by hypoxia/reoxygenation and preconditioning with captopril

group	Caspase expression positive cells %
	Caspase-3 Casepase-9
Control group 4.6±1.9* 5.2±2.8* H2/R4 47.8±2.4* 62.6±2.4* H2/R4 +capotril(10-4) mmol/L 39.2±2.2* 48.6±3.8* H2/R4 +capotril(10-3) mmol/L 30.8±3.6* 39.2±2.8* H2/R4 +capotril(10-2) mmol/L 20.4±2.8* 27.8±3.5*

The expression of caspase-3,9 were detected by immunocytochemistry.the Caspase-3、9 were activated in HUVEC during hypoxia/reoxygenation， expression of caspase-3.9 in HUVEC preconditioning with catopril were significantly decreased in contrast with hypoxia/reoxygenation group and significantly decreased followed the catopril concentration increasing.

3讨论

本实验在离体培养的人脐静脉内皮细胞上，给予不同浓度的卡托普利处理后进行缺氧复氧损伤，从中发现卡托普利预处理组的Caspase3、9表达明显低于缺氧复氧组，且随着卡托普利浓度的增加而逐渐降低，这说明卡托普利具有抑制Caspase蛋白表达的作用，并且这种抑制作用与卡托普利的浓度具有量-效关系。

缺血再灌注损伤是一种常见的临床病理生理过程，与心肌梗死，心绞痛等心血管疾病密切相关，故一直是医学界研究的热点问题之一。血管内皮细胞位于血液与组织之间，是各血管组织缺血及再灌注损伤过程中最先受损的部位，大量的在体和离体实验均以证实缺血再灌注可以导致内皮细胞凋亡^[13-16]。细胞凋亡不但是缺血再灌注损伤的特征之一，而且细胞凋亡可以加重缺血再灌注损伤，细胞凋亡的多少决定了缺血再灌注损伤的轻重。故通过研究VEC缺氧复氧损伤性凋亡的机制和卡托普利预适应的VEC保护作用来抑制细胞凋亡，对治疗缺血缺氧性疾病有重要的理论和临床意义。

细胞凋亡可在四个水平被抑制,即干扰凋亡的刺激因素、在受体/配体水平的功能性拮抗、阻断信号转导、抑制催化性酶,如Caspase、核酸内切酶等。目前，对缺氧再灌注损伤导致细胞凋亡及卡托普利预处理的保护机制尚不十分明确。考虑可能与以下几种因素相关：（1）氧自由基：我们以往的实验证实单纯缺氧和缺氧复氧均可产生大量的超氧阴离子自由基，它可能通过以下几种途径诱导细胞凋^[16]。①直接损伤DNA，导致细胞凋亡的发生。②攻击蛋白质，使许多蛋白尤其是具有酶活性的蛋白功能丧失。③影响核基因转录，改变细胞表型特征，诱导凋亡。④直接作用于细胞质膜，引起脂质过氧化反应，从而影响细胞转录系统，最终激活Caspase蛋白及有关调控凋亡的基因，导致细胞凋亡。而经过卡托普利预处理后的内皮细胞，由于卡托普利本身含有巯基（SH），不但具有抑制微粒体脂质过氧化反应及白细胞产生氧自自由基的作用，而且本身是强有力的氧自由基清除剂。Tambd^[17]等研究发现卡托普利对缺血再灌注过程中产生氧自由基所至的细胞凋亡具有明显的抑制作用，这与我国学者胡青松等^[18]研究发现卡托普利具有抑制羟自由基诱导血管内皮细胞、心肌细胞凋亡的结论相一致。由此可见，卡托普利通过抑制和清除氧自由基的双重作用来阻止氧自由基氧化PT孔上的硫醇P所致T孔开放，此外卡托普利所含有巯基（SH）也可使PT孔处于关闭状态，稳定了线粒体膜电位，阻止Cyt-C及凋亡诱导因子（AIF）从线粒体中释放，有效降低了缺血再灌注损伤过程中Caspase3、9的激活，从而抑制细胞凋亡。（2）各种凋亡相关基因的作用：①Bcl-2家族：Bcl-2家族由两类功能相反的蛋白组成,Bcl-2、Bcl-XL、A1及Mcl-1抑制凋亡,而Bax、Bcl-Xs、Bad和Bak促进凋亡。Bcl-2对细胞凋亡的调控作用主要是通过线粒体依赖性途径实现：Bcl-2蛋白可以在线粒体膜形成阳离子通道，它插入到线粒体膜后通过质子流动和电压依赖性阴离子通道（VDAC）来抑制渗透性转变孔开放，从而防止细胞色素C、凋亡诱导因子（AIF）等促凋亡因子从线粒体释放，阻止了Caspase-3、9的激活，最终抑制细胞凋亡^[19-20]。此外Bcl-2还可以直接与胞浆中Caspase-9连接的Apaf-1相结合而存在于线粒体外膜，通过形成线粒体—Bcl-2—Apaf-1—Caspase-9的四聚复合物的形式对Apaf-1的结构进行调控，使Apaf-1失去对Caspase酶系的活化从而抑制细胞凋亡^[21]。Matsushita研究小组证明,缺氧处理可使内皮细胞Bcl-2水平明显降低,而Bax水平没有变化,抗凋亡蛋白Bcl-2水平的降低与细胞凋亡相关^[8]。对人冠状动脉内皮细胞的研究也发现缺氧再灌注可使Bcl-2水平降低^[22]，而Stempien-Otero等发现在脐静脉内皮细胞缺氧性凋亡时,Bax和Bcl-XL水平均未发生变化,Bax/Bcl-XL的比例似乎与细胞凋亡并无相关^[23]。从中我们可以推测Bcl-2的水平降低在缺血再灌注损伤导致细胞凋亡的病理过程中起着重要作用。同时Liangxuguo^[24]等应用卡托普利和氯沙坦干预由血管紧张素II（AngII）所诱导的血管内皮细胞凋亡的实验中发现，还能降低促凋亡基因表达，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而抑制Caspase-9的激活并阻断了Caspase-3激活所依赖的线粒体途径，减少了Caspase-3的活化而发挥抗细胞凋亡的作用。（3）AngII与其相应的受体AT₁结合并共同作用，在增加AT₁受体蛋白的表达的同时并明显上调促凋亡基因的表达，进而激活caspase-3导致细胞凋亡^[25]；而卡托普利通过抑制血管紧张素转化酶的活性，阻止了AngI转换为AngII，从而不但使AngII所产生的氧自由基和炎性介质减少，而且部分阻断AngII与其相应受体结合所至的细胞凋亡作用。同时，还能降低促凋亡基因表达，上调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从分子水平发挥抗细胞凋亡的作用^[24]。此外卡托普利还能通过减少缓激肽的降解，使增加的缓激肽通过与其β2受体结合,进而激活磷酸酯酶C(PLC),产生的IP3使细胞内Ca²⁺释放而一氧化氮合酶（NOS）和上调ecNOS，从而增加一氧化氮（NO）的产生^[26]，而一氧化氮可以通过半胱氨酸的S亚硝基化来抑制caspase-3的表达，从而减少细胞凋亡^[27-28]．Fnjita N^[29]通过实验证明，内皮细胞提前经ACEI类药物和缓激肽处理后可以明显减少H/R引起的内皮细胞的凋亡和乳酸脱氢酶的释放，且此作用可以被B2受体阻断剂和一氧化氮合酶抑制剂取消，从而证明，ACEI可以通过上调缓激肽水平从而使一氧化氮合酶活性增加，提高NO的释放，从而达到保护内皮细胞的作用。

通过本实验，我们发现，缺氧再灌注损伤导致的细胞凋亡是可以干预的，从而提示我们可以从减轻细胞凋亡的角度预防缺氧再灌注损伤对细胞的结构和功能的破坏。即通过清除凋亡诱发因素，抑制凋亡的信息传导通路，减少细胞损伤，这将会为保护缺氧再灌注损伤提供新的治疗途径，具有重要的治疗价值。

结 论

本实验证明，卡托普利晚期预处理后，内皮细胞在缺氧复氧损伤过程中，Caspase3，9的表达明显降低，且与卡托普利的浓度具有量-效关系。结合进一步的研究我们分析，卡托普利预处理可以通过激活缓激肽B₂受体、清除氧自由基、上调bcl-2的表达等多种机制来抑制Caspase3，9在内皮细胞缺血再灌注损伤期间的激活从而发挥内皮细胞的保护作用。同时亦表明卡托普利对血管内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用至少是部分通过降低Caspase-3、9的表达来抑制细胞凋亡而实现的。

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本研究先进性

1．本实验根据缺血和缺氧有着极其相似的病理改变和发病机制，故设计以培养的人脐静脉内皮细胞的缺氧复氧模型来模拟缺血再灌注损伤模型，而且为了更好的模拟在体时细胞的缺血再灌注状态，在缺氧时我们采用缺氧液培养细胞，除造成缺氧外，同时限制糖，钙及液体量，而在复氧时则用含糖，钙的复氧液，并给予充分的氧，以满足再灌注的条件。

2．本实验依细胞凋亡的经典途径为基础，通过检测凋亡过程中的关键酶Caspase3、8、9，来研究缺血再灌注损伤导致血管内皮细胞凋亡的相关机制。

3．缺氧和缺氧复氧均可以引起血管内皮细胞的Caspase3、9表达，且表达程度与缺氧复氧损伤时间具有显著的依赖性，这说明Caspase-3， Caspase—9参与了缺氧/复氧诱导HUVEC凋亡这一病理；

4．同时Caspase—8的表达在缺氧/复氧诱导细胞凋亡的整个过程中，无明显变化，从中我们可以推测缺氧/复氧诱导血管内皮细胞凋亡主要是通过线粒体途径进行的。这将有助于为寻找适当的治疗靶点提供理论参考。

5卡托普利晚期预处理可以降低血管内皮细胞的Caspase3、9表达，此种抑制作用具有剂量依赖性。

6卡托普利晚期预处理可以通过激活缓激肽B₂受体、清除氧自由基、上调bcl-2的表达等多种机制来抑制Caspase3，9在内皮细胞缺血再灌注损伤期间的激活从而发挥内皮细胞的保护作用。同时亦表明卡托普利对血管内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用至少是部分通过降低Caspase-3、9的表达来抑制细胞凋亡而实现的。

中文摘要

缺血再灌注损伤的防治一直是心血管领域研究的重点课题。缺血预适应（ischemic preconditionging，IPC）是体内最强大的保护机制，是一种多元性细胞防御现象。IPC的保护作用不仅存在于器官水平，而且存在于细胞水平，不仅可以保护心肌细胞，而且可以保护血管内皮细胞，血管平滑肌细胞。这一现象的发现，为缺血心肌的保护及其机制的探讨开辟了新的领域。且目前的研究已经明确的证实缺氧预处理和缺血预处理具有相似的效应。由于缺血本身是一种损伤，实施损伤性预处理临床还难以接受，目前诱导预处理的研究已从缺血、生物、物理、化学源性扩展到药物性预处理。药物性预处理（pharmacologic preconditioning）是通过药物激发或模拟机体内源性物质呈现的心脏保护作用。

血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）具有药物预适应作用。ACEI通过诱导或增强预处理早期心脏保护作用已有较多研究，而诱导预处理的延迟保护作用的报道不多；因此，为了研究ACEI晚期预处理在血管内皮细胞缺血再灌注损伤中的保护作用，我们在实验中建立血管内皮细胞缺血再灌注（缺氧复氧）损伤模型，选用卡托普利（ACEI代表药，非前体药），探讨卡托普利和Caspase-3、8、9在人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤中的作用。我们把人脐静脉内皮细胞分为正常对照组、缺氧/复氧组、和卡托普利预处理组；分别进行缺氧2小时复氧1小时、2小时、3小时、4小时；用免疫组化检测Caspase-3、8、9表达。实验结果显示缺氧/复氧组随着复氧时间的延长， Caspase-3、9表达亦随着复氧时间的延长而进行性增加，尤以复氧4小时最为明显；而Caspase—8表达无明显变化。.卡托普利预处理组的Caspase蛋白表达变化与缺氧/复氧组相似，但明显下降，并且细胞的Caspase蛋白表达随着卡托普利的浓度的增加而