肺癌病理学检查要注意什么？

本院经常会遇到外院患者拿着新鲜的病理标本来我院会诊，那么这个标本是否合格？是否能进行病理检测？需要注意什么呢？以下几点可供参考，要做病理学检查的患者及其家属要注意，因为不合格的标本对于患遭受了不必要的取样痛苦，但是又不能做出病理诊断，得不偿失。

1、标本固定标准

使用10％中性缓冲福尔马林固定液，避免使用含有重金属的固定液，固定液量应大于等于所固定标本体积的10倍，常温固定。标本从离体到固定时间不宜超过30分钟。活检标本直接放入固定液，支气管镜活检标本的固定时间为6~24小时，手术切除标本的固定时间为12~48小时。

不同类型细胞学标本制片固定应采用95％乙醇固定液，时间不宜少于15min，或采用非妇科液基细胞学固定液，固定时间和方法可按说明书进行操作；所有细胞学标本应尽量制作福尔马林固定石蜡包埋细胞学蜡块。将细胞学标本离心沉淀置于包埋盒中，后续操作同组织学标本制作蜡块流程。

2、取材后标本处理原则和保留时限

取材剩余组织保存在标准固定液中，并始终保持充分的固定液量和甲醛浓度，以备在病理诊断报告签发后接到临床反馈信息时复查大体标本或补充取材。剩余标本处理的时限建议在病理诊断报告签发1个月后，未接到临床反馈信息，未发生因外院会诊意见分歧而要求复审等情形后，由医院自行按相关流程处理。

3、组织病理诊断

小的组织标本用于肺癌病理诊断主要解决有无肿瘤及肿瘤类型，对于形态不典型的病例或晚期不能手术的患者病理诊断需结合免疫组化染色尽可能进行亚型分类，尽量避免使用非小细胞肺癌-非特殊类型（non-small cell lung cancer-not otherwise specified,NSCLC-NOS）的诊断。

4、免疫组化和特殊染色

腺癌与鳞状细胞癌鉴别的免疫组化标志物宜选用TTF-1、Napsin-A、p63、P40和CK5/6；神经内分泌肿瘤标志物宜选用CD56、Syn、CgA、Ki-67和TTF-1，在具有神经内分泌形态学特征基础上，至少有一种神经内分泌标志物明确为阳性，阳性细胞数应＞10％肿瘤细胞量才可诊断神经内分泌肿瘤；细胞内黏液物质的鉴别宜进行黏卡、AB-PAS特殊染色；可疑累及胸膜时应进行弹力纤维特殊染色确认。

5、分子病理检测

对于非小细胞肺癌中的肺腺癌或含腺癌成分的其他类型肺癌，应在诊断的同时常规进行EGFR基因突变和间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）融合基因检测。如有必要可进行c-ros原癌基因1酪氨酸激酶（c-ros oncogene 1receptor tyrosine kinase,ROSI）融合基因及RET融合基因、鼠类肉瘤病毒癌基因（kisten ratsarcoma riral oncogene homolog,KRAS）、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌同源体B（v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B,BRAF）基因V600E、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2,HER-2）基因突变、MET基因高水平扩增及MET基因14号外显子跳跃缺失突变等分子检测。

1）EGFR基因突变检测

推荐所有病理诊断为肺腺癌、含有腺癌成分的NSCLC患者进行EGFR基因突变检测，建议对于小的组织标本诊断或不吸烟的鳞癌患者也进行检测。

（１）EGFR基因突变检测的标本和处理方法：手术切除和活检的组织标本是最常见的用于EGFR基因突变检测的标本类型，建议优先选择组织标本进行检测，规范处理的组织标本可以满足检测要求。原发灶和转移灶的组织标本均可用于EGFR基因突变检测，细胞学标本也可以用于检测。

应规范不同标本的处理方法，组织标本的固定应使用４％中性缓冲甲醛固定液或10％中性缓冲福尔马林固定液，避免使用酸性及含有重金属离子的固定液。活检组织标本一般固定6～24ｈ，手术切除标本需固定12～48ｈ。

肿瘤组织切片应由病理医师审阅复核，评估肿瘤细胞含量，必要时在显微镜下定位标出肿瘤组织区域，进行人工切割刮取组织，以保证有足量的肿瘤细胞提取DNA。对于肿瘤细胞数量不达标的样本应重新采集。

（２）EGFR基因突变检测方法：目前，检测EGFR基因突变最常用的方法是直接测序法和扩增阻遏突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS）。建议使用权威机构批准上市的EGFR基因突变检测试剂盒。

近年来，随着高通量技术的发展，多项研究采用二代测序（next generation sequencing,NGS）对Ⅳ期NSCLC的肿瘤组织或血液进行多基因检测，发现目前可作为治疗靶点的基因突变，如：EGFR基因敏感突变、EGFR T790M突变、KRAS基因突变、HER2基因突变、ALK基因融合、ROS1基因融合、BRAFV600E基因突变、RET基因融合、MET基因扩增和MET-14基因外显子跳跃性突变等。NGS的应用节省了检测样本、提高了临床检测效率，可更加精准的指导NSCLC的治疗。但由于成本较高、技术相对复杂，同时缺乏NGS质控和行业规范等因素限制了该技术的临床常规使用。

检测应包括患者的基本个人信息、病历号、病理诊断、标本类型、肿瘤细胞含量（如肿瘤细胞数量或百分比）、检测方法和检测结果，同时标明标本接收日期和报告日期，由检测员和另一位有经验的医师审核并出具报告。检测结果中EGFR基因突变类型应采用国际通用的人类基因组变异协会命名法则命名。

2）第一代、第二代EGFR-TKI耐药后的分子病理检测

第一代、第二代EGFR-TKI治疗失败的患者在条件允许的情况下应再活检取肿瘤组织，明确病变组织类型，如果为NSCLC，建议进行EGFR T790M基因突变、MET因扩增、HER2基因扩增、PIK3CA基因突变、BRAF V600E基因突变和ERK基因扩增等检测。对于无法获取肿瘤组织的患者，可用外周

血提取ctDNA行EGFR T790M基因突变检测，常用方法包括ARMS、Super-ARMS法和NCS等。

3）ALK融合基因检测

推荐所有病理诊断为肺腺癌、含有腺癌成分的NSCLC患者进行ALK融合基因检测。

ALK融合基因检测的标本类型：肿瘤原发或转移部位的组织或细胞学标本均可进行ALK融合基因检测，标本处理的要求与EGFR基因突变检测相同。

无论采用哪种标本类型，均应保证足够的肿瘤细胞，尽量排除非肿瘤组织和细胞。石蜡组织切片厚度一般为（５±１）μｍ。

4）ROS1融合基因检测

推荐所有腺癌或含有腺癌成分的晚期NSCLC患者，应在诊断时常规进行ROS1融合基因检测。对于小活检标本或不吸烟的鳞状细胞癌患者也应进行ROS1融合基因检测。

ROS1融合基因检测方法：与ALK融合基因检测类似，目前用于ROS1融合基因的检测方法有3种：FISH、RT-PCR和IHC。但ROS1 IHC结果不能直接指导临床用药。ROS1 IHC检测结果阳性的患者，需进一步进行RT-PCR IHC检测结果阳性的患者，需进一步进行RT-PCR或FISH检测确认。ROS1融合基因检测的具体方法详见《ROS1阳性非小细胞肺癌诊断病理专家共识》。

5）PD-L1表达检测

多项临床研究结果显示，PD-L1表达水平与PD1／PD-L1抑制剂治疗的疗效相关。PD-L1检测标本类型可分为手术切除和活检标本，目前推荐的PD-L1检测方法为IHC。IHC方法检测PD-L1表达水平在临床推广及应用方面存在一定困难，例如，不同PD-1／PD-L1抑制剂需要不同的PD-L1 IHC试剂盒进行检测；不同的PD-L1 IHC检测试剂盒评价标准、阈值、检测平台有所差异等。

目前，FDA批准的PD-L1试剂盒包括：Dako公司研发的22C3和28-8，以及Ventana公司研发的SP263和SP142。中国尚缺乏PD-L1检测的指南或共识。2019年8月30日，国家药品监督管理局（National Medical Products Administration,NMPA）批准Dako公司的PD-L1 IHC 22C3检测试剂盒上市，

这是在中国批准上市的首个PD-L1检测试剂盒。

进行分子病理检测时，肿瘤组织标本的处理和质量控制均应由有经验的病理科医师负责，所有标本均应在尽量短的时间内进行检测，在进行切片时应有措施避免不同病例的病理组织间的交叉污染。