【综述解读】非小细胞肺癌冷冻消融的免疫学效应

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【摘要】在免疫疗法中，我们通过冷冻消融治疗靶肿瘤以产生抗肿瘤免疫反应。过去肺癌已经被证明可以采用免疫检查点抑制剂治疗，因此近年来人们对肺癌冷冻消融的免疫学方面重新产生了兴趣。本文中我们回顾总结了冷冻消融原发性肺肿瘤的临床前和临床试验。我们确认了冷冻消融诱导的抗肿瘤免疫反应的程度，以及冷冻消融与其他免疫疗法或分子靶向疗法之间的潜在协同作用。我们进一步探讨将冷冻消融与免疫检查点抑制剂联合治疗的方案。

背景

肺癌是美国男性和女性癌症死亡的主要原因，全世界每年约有 160 万肺癌相关死亡发生。在没有可靶向致癌突变或易位的晚期非小细胞肺癌（NSCLC） 中，采用铂类为主化疗治疗患者的中位生存期仅8 至 12 个月。然而，免疫疗法的出现极大地改变了晚期 NSCLC 的治疗前景。当肿瘤 PD-L1 表达为 50% 时，针对程序性死亡 1（PD-1）/（程序性死亡配体 1）PD-L1 通路的免疫检查点抑制剂 (ICIs) 现在是治疗 IV 期 NSCLC 的一线疗法。不幸的是，在大多数肺癌临床试验中，只有大约 20% 的患者 ICI治疗有效。即使肿瘤 PD-L1 表达为 50% 或更高，晚期肺癌的客观反应率不超过 50%。一个潜在可能导致治疗无效的机制是肿瘤内特异性 T 细胞浸润不足。将 ICI 与另一种能够刺激肿瘤微环境中肿瘤特异性 T 细胞反应的治疗方式相结合将是增加ICI 疗效的潜在策略。其中，冷冻消融可能具有前景。

自 1960 年代后期以来，人们已经认识到冷冻消融的免疫学效应。在冷冻免疫疗法中，冷冻消融的肿瘤保留在靶器官内，可能起到原位疫苗接种的作用，刺激先天性和适应性免疫（图 1）。冷冻消融的肺癌细胞会释放肿瘤抗原。然后肿瘤抗原被抗原呈递细胞（APC）吸收，抗原呈递细胞与肿瘤特异性 T 细胞相互作用，触发它们的激活和增殖。激活的肿瘤特异性 T 细胞能够识别残留的局部肿瘤并发挥细胞毒性，从而杀伤全身转移的肿瘤。此外，垂死的肿瘤细胞可能会释放“危险信号”，包括促炎细胞因子和核蛋白，它们会吸引和激活中性粒细胞、巨噬细胞和自然杀伤 (NK) 细胞。激活的NK 细胞随后能够直接裂解靶肿瘤细胞。在一些肺癌传统的治疗方案中加入冷冻消融已被证明能够具提高治疗效果. 不过ICI 联合冷冻消融术在晚期 NSCLC 中的有效性目前尚不清楚。

冷冻消融的肿瘤与固有免疫以及适应性免疫的关系

什么是冷冻消融？

冷冻消融是局部应用重复的冻融循环从而使靶组织液化坏死的技术。在冷冻疗法中，称为冷冻剂的压缩液体通过小孔流出并进入膨胀室。膨胀后，压缩液体会转变成气态，从而产生显着的温度下降（焦耳汤姆逊效应）。一氧化二氮和二氧化碳是最常用的冷冻剂，可在几秒钟内在冷冻探针的尖端分别提供–89 ℃和–79 ℃的温度。冷冻消融会导致细胞损伤，由于细胞内冰晶的形成，会造成细胞膜和细胞器的损伤（物理效应）。此外，细胞外液会冻结，这会导致水分转移，从而导致细胞脱水。此外，微血管血栓形成、血管收缩和血管淤滞导致缺血性坏死（血管效应）。血管效应导致的损伤可能会以延迟的方式发生。目前冷冻消融常规用于治疗具有某些特定临床适应症的肺癌。支气管镜冷冻消融是一种公认的标准治疗技术，已被用于安全有效治疗中央气道阻塞性支气管内肿瘤 25 年以上。然而，支气管镜冷冻消融尚未用于治疗外周肺肿瘤的治疗。十多年来，经皮冷冻消融术一直是不可切除的原发性和继发性外周肺肿瘤的治疗选择。对于因合并症或肺功能不佳而不适合手术的早期肺癌患者，原发肿瘤的经皮冷冻消融术具有潜在的治疗效果。冷冻消融诱导的抗肿瘤免疫反应对局部和远处肿瘤控制的相对贡献尚不清楚。

冷冻免疫疗法的临床前试验

Lewis 肺癌 (LLC) 肿瘤模型是一种源的、免疫活性的 NSCLC 小鼠模型肺癌肿瘤模型，过去的研究显示冷冻消融能够诱发抗肿瘤免疫反应，他们在 C57BL/6 小鼠在其双侧大腿皮下植入 LLC 细胞，等待 LLC 肿瘤生长直径达 5 毫米，然后进行冷冻消融，并在冷冻消融后 2 小时和 2 天进行瘤周注射 LPS。并对一侧病灶进行了冻融冷冻消融治疗。在对照组中，小鼠仅接受瘤周 LPS 给药，不进行冷冻消融。值得注意的是，单侧的LLC 肿瘤冷冻消融和瘤周 LPS 注射能够显着抑制对策非冷冻消融肿瘤的生长，与“远隔”效应一致。在冷冻消融后第 14 天，接受两次冻融循环治疗的冷冻消融组的对侧肿瘤体积比仅使用 LPS 的对照组小 5 倍。冷冻消融组对侧肿瘤浸润的CD4 + T 细胞和 CD8 + T 细胞的百分比与仅使用 LPS 的对照组相比显着增加。此外，冷冻消融肿瘤的皮下瘤周空间具有更高水平的促炎细胞因子，包括白介素-2 (IL-2)、肿瘤坏死因子-a (TNF-a) 和干扰素 γ (IFN-g)。这些发现高度表明，在该小鼠模型中，LLC 冷冻消融的“远隔”效应本质上是免疫学的，并由细胞和细胞因子效应机制介导。

冷冻免疫疗法联合 DC 免疫疗法

目前提出的冷冻免疫疗法机制为，冷冻消融释放的肿瘤抗原被抗原呈递细胞吸收，包括未成熟的树突状细胞 (DC)。抗原摄取后，未成熟 DC 需要合适的环境（激活性的）才能成熟，从而促进抗肿瘤免疫激活而不是免疫耐受。成熟 DC 具有将主要组织相容性复合体 (MHC) I 类和 II 类分子上的肿瘤抗原呈递给 T 细胞的能力。在冷冻消融后的肿瘤微环境中，坏死细胞死亡和释放的炎性细胞因子可刺激 DC 成熟。当冷冻消融与骨髓来源的未成熟 DC 的瘤内递送相结合时，能够明显抗肿瘤免疫反应。在一项临床前研究中， C57BL/6 小鼠在其足内垫中接种了具有免疫活性的LLC细胞。当肿瘤直径达到 3 至 4 毫米时，研究者将小鼠分为五组，并采用冷冻消融、瘤内注射 10*6 个未成熟 DC +冷冻消融，或进行瘤内或静脉内 DC 免疫治疗，或瘤内注射磷酸盐缓冲盐水进行治疗。单一治疗组和对照组相比，联合冷冻消融和瘤内 DC 治疗组显着增加了肿瘤引流淋巴结 (TDLN) 和脾脏 CD8 +T 细胞增殖，减少了肺转移，提高了总生存率，并增加了对肿瘤再攻击的保护。值得注意的是，单独的冷冻消融对于诱导抗肿瘤免疫反应是无效的。这与 Takahashi 等人的研究结果相反。本综述前面讨论过，这些相反的结果可以用每项研究中进行冷冻消融的方式不同来解释。将冷冻镊子应用于目标肿瘤 10 秒在刺激免疫反应方面可能不如使用冷冻外科系统将加压液氮应用于目标肿瘤 60 秒。此外，在 Takahashi 等人的研究中观察到，LPS 与冷冻消融的共同给药可能有助于产生强大的抗肿瘤免疫反应。免疫佐剂，例如含有胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤基序 (CpG ODN) 的寡脱氧核苷酸，其与 Toll 样受体 9（TLR9）结合，提供刺激信号以诱导 DC 成熟。在一项单独的临床前研究中，免疫活性 C57BL/6 小鼠在其足内垫中植入了 LLC 细胞。当它们的肿瘤达到 12 到 20 mm³ 时，几组小鼠接受了冷冻消融、瘤内 DC 免疫疗法和瘤内 CpG-ODN 的不同组合治疗。对照组仅用磷酸盐缓冲盐水处理。与之前的研究一样，DC 从小鼠骨髓中采集、培养和离体分离。根据治疗组的不同，在冷冻免疫治疗后 1 小时和 7 天后再次共同给予 DC 免疫治疗和/或 CpG-ODN。在第二次治疗后 7 天的 TDLN 中，冷冻消融联合瘤内DC/CpG-ODN 组小鼠的 CD4 +和CD8+ T 细胞活化显着增加，脾 CD4 +和 CD8 + T 细胞增加种群与其他小鼠队列中的种群相比。此外，TDLN内CD4 +和 CD8 + T 细胞产生的 IFN-g 和 TNF-a 增加；然而，作为Th2 细胞型细胞因子的 Il-4 的产生并未增加。此外，与联合治疗组相比，该联合治疗组的肿瘤生长较慢，转移较少，总生存期有所改善。这一系列临床前研究表明，冷冻消融可以与其他形式的免疫疗法相结合，对原发性和远处肿瘤产生协同作用。

冷冻免疫疗法的临床试验

两项小型临床研究评估了肺癌经皮冷冻消融后的抗肿瘤免疫反应。经皮冷冻消融前后外周血单核细胞 (PBMC) 的比较并未证明循环 T 细胞群发生具有临床意义的变化。在 30 名接受单独经皮冷冻消融治疗的晚期 NSCLC 患者的临床试验中，与冷冻消融前外周血计数相比，冷冻消融后外周血总 T 细胞和 CD8+T 细胞数量均仅略微增加（各增加 1.1 倍）。然而，冷冻消融后淋巴细胞的功能显着增加，IL-2 和 IFN-g 蛋白的产生增加。在另一个小型试验研究中，针对 19 名接受经皮消融技术（包括冷冻消融、射频消融 (RFA) 或微波消融）治疗的各种恶性肿瘤患者的小型试点研究中，所有患者消融后外周血中的PBMC 中细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 的百分比仅略微增加（从 27.5 % 至 30.2%）。此外，外周血 CTL 与调节性 T 细胞 (Treg) 的比率在消融后仅略微增加（从 18.8% 到 21.6%）。 19 个肿瘤中只有 7 个位于肺部，只有两个是原发性肺癌。在接受经皮冷冻消融治疗的 19 名患者中，5 名患者的冷冻前和冷冻后外周血 CTL 或 Treg 水平没有显着变化。

冷冻消融在肺癌中的局部免疫学效果的理想评估是比较冷冻前和冷冻后肺肿瘤标本。在手术切除前以新辅助方式进行冷冻消融可以提供大的冷冻消融后标本。冷冻消融后数天至数周应进行手术切除，这是淋巴细胞肿瘤浸润发生的预期时间范围。这项提议的评估的潜在缺陷是，单独行经皮冷冻消融不能提供预冷冻消融后肺肿瘤标本。研究者需要单独的活检或可能的联合手术，然后进行冷冻消融，以获得该预冷冻消融标本。然后对冷冻消融前和冷冻消融后标本的病理学检查将明确冷冻消融后肿瘤浸润淋巴细胞是否增加。不幸的是，医学文献中没有关于肺癌冷冻消融的临床研究，尽管它们确实存在于其他形式的经皮消融，特别是 射频消融(RFA)。 RFA 通过高频交流电加热，引起原位组织破坏，也可以刺激抗肿瘤免疫反应。在一项纳入4 名 I 期 NSCLC 患者接受 RFA 治疗的研究中，8 天后进行电视辅助胸腔镜肺叶切除术。与经皮冷冻消融一样，使用经皮消融技术（包括 RFA）前未获得肿瘤标本。这些患者在接受 RFA 治疗前需要进行单独的活检以确认 NSCLC。手术切除肿瘤的组织切片显示切除肿瘤的中心区域坏死且缺乏淋巴细胞。然而，CD4 +和 CD8+ T 细胞有强烈的瘤周浸润。尽管在新辅助 RFA 后诱导了瘤周 T 细胞肿瘤浸润，但 RFA 前和 RFA 后外周血 T 细胞群保持不变。这表明外周血 T 细胞群可能无法很好地反映消融后肿瘤微环境中发生的免疫反应。或者，对原发性肺癌经皮 RFA 缺乏诱导全身免疫反应。T 细胞仅存在于肿瘤的外周部分可能表明表达肿瘤抗原的 DC 之间缺乏突触，并且可能具有潜在的反应性 T 细胞。需要进一步研究以评估原发性肺癌经皮冷冻消融后肿瘤特异性 T 细胞的肿瘤内浸润。

冷冻免疫疗法联合 ICI

在 ICI 治疗的基础上加入冷冻消融有可能增加免疫疗法的效果（图 2）。理论上，冷冻消融可以刺激抗肿瘤特异性 T 细胞激活和增殖，而 PD-1 抑制将通过阻断 PD-1/PD-L1 相互作用来防止这些肿瘤特异性 T 细胞“耗竭”或产生耐受。冷冻消融对肺肿瘤PD-L1 表达的影响尚未探索，ICI 和冷冻消融联合治疗晚期 NSCLC 的疗效尚不清楚。然而，这种联合方案在乳腺癌和前列腺癌中显示出有希望的结果。一项针对女性早期乳腺癌的初步研究涉及术前经皮肿瘤冷冻消融、伊匹单抗治疗或两者兼而有之，然后进行乳房切除术。冷冻消融和ipi单抗的新辅助组合安全、耐受性良好，并且与外周血可诱导共刺激分子表达 CD4 +和 CD8 +T 细胞以及 Ki67 +CD4+和 CD8 +T 细胞（标志物）的显着增加相关T 细胞活化和增殖分别。这将是未来可切除 NSCLC 中冷冻消融的机会窗口试验的极好模型。

图2.冷冻消融与PD-1抗体药物潜在的联合机制

在接种原发性前列腺肿瘤（Tramp C2）的C57BL/6 小鼠中，的冷冻消融与CTLA4抗体联合较单独使用冷冻消融、或CTLA4 治疗相比，治疗导致继发性前列腺肿瘤的肿瘤生长减慢或在远处完全排斥的比例明显升高。50 天后，联合治疗组的无瘤生存率为 44%，而所有其他组为 0%（p=0.0005）。此外，与所有其他队列相比，继发性前列腺肿瘤浸润有显着更高水平的 CD4+和 CD8 + T细胞，并且在接受联合治疗时具有更高的 T 效应细胞/Treg 细胞比率。每毫克肿瘤中 CD8 +T 细胞的数量与单独冷冻消融和未治疗组相比增加了 10 倍，与单独使用抗 CTLA4 治疗相比增加了 2 倍。每毫克肿瘤的 CD4 +Foxp3- T 细胞总数与单独冷冻消融和不治疗相比增加了八倍，与单独使用抗 CTLA4 治疗相比增加了四倍(p ＜ 0.001)。值得注意的是，单独用冷冻消融治疗原发性前列腺肿瘤不会影响继发性肿瘤生长或继发性肿瘤 T 细胞浸润。尽管有这些负面发现，但仍观察到冷冻消融与抗 CTLA4 疗法的显着协同免疫和存活效应。需要额外的研究来评估晚期 NSCLC 中冷冻消融和 ICI 的组合。目前，有两项 II 期临床试验研究了经皮冷冻消融和 ICI 联合治疗晚期肺癌（NCT03290677 和 NCT02469701）。

未来发展方向

我们需要进一步的研究来刻画单独经皮冷冻消融和其联合 ICI 在肺癌中的免疫学效应。原发性肺癌的新辅助经皮冷冻消融和手术切除将为整个肿瘤提供病理评估，评估先天性和适应性免疫反应以及肿瘤和肿瘤周围微环境中 PD-L1 表达的变化。这也可以与新辅助 ICI 给药联合进行。除 ICI 外，还应考虑联合经皮冷冻消融与局部免疫疗法（包括瘤内 注射DC、DC-CIK、NK 或抗 CTLA4 疗法）。经皮冷冻消融术是目前唯一可用于对周围肺肿瘤进行冷冻免疫治疗的技术。在外周肺肿瘤经皮冷冻消融术中，冷冻探针必须穿过胸膜和肺实质才能到达目标肿瘤，这会带来医源性气胸的高风险。未来可能的预防术后气胸的解决方案是考虑预防性喷胶或使用纤维蛋白密封剂堵塞冷冻探针的穿刺部位。或者，支气管镜冷冻消融术可以让消融设备通过气道直接到达周围肿瘤，从而最大限度地降低胸腔积气的风险。随着使用径向支气管内超声定位周围肺肿瘤，预计支气管镜冷冻消融术是可行的。上述未来的临床研究也可以用支气管镜冷冻消融术代替经皮冷冻消融术进行。这可能会降低并发症发生率，允许同时更安全地治疗多个病变，并允许分析冷冻消融对区域淋巴结和肺实质远端区域的影响。支气管镜冷冻消融的一个潜在限制是可能只消融一部分肿瘤。然而，我们可能只需要部分冷冻消融来诱导抗肿瘤免疫反应。

小沈点评：

尽管这篇文献发表于2018年，但是全面的概述了目前冷冻消融免疫效应的研究方向和评估了其可能的应用场景。冷冻消融诱发免疫的核心机制仍不十分明确，这也使得这个领域仍有巨大的空间可以探索。深入了解冷冻消融及其效应对于未来优化免疫治疗有着重要的意义。

参考文献：

Katzman D, Wu S, Sterman DH. Immunological Aspects of Cryoablation of Non-Small Cell Lung Cancer: A Comprehensive Review. J Thorac Oncol. 2018 May;13(5):624-635.