肺泡灌洗液（BALF）在间质性肺疾病（ILD）中的应用（译）

肺泡灌洗液（BALF）在间质性肺疾病（ILD）中的应用（选译）

1. 总体分析

BAL外观可提示ILD原因，如进行性增加的血性液体提示肺或肺泡出血综合征；米黄色或棕色，浑浊云雾状或牛奶样外观提示PAP可能；如为云雾状，需要低速离心才能澄清，考虑肺泡微结石症可能；如BAL上层可见油脂样物质，提示脂质性肺炎可能；如离心后可见黑色颗粒提示吸烟或吸入大量空气中含碳颗粒物。

2. BALF细胞分类及计数分析的技术细节

常用于肺泡灌洗的生理盐水，缺乏营养，低PH值，并且低渗透压，不利于细胞保存，一般保存不超过一小时。在实验室中，细胞成分需要被分离出来。采用二硫苏糖醇离心去除和收集液体上清液后对沉淀细胞颗粒进行处理，是一种不丢失其它物质的溶解粘液的替代方法。细胞成分应该用MEM 25mm HEPES的等渗电解质溶液如Hank‘s平衡盐溶液（HBSS）或缺乏钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，然后用250-300G离心5分钟。对上清液仔细抽吸后，通过温和搅拌，细胞可重新悬浮在特定体积的组织培养基中。注意避免剧烈摇晃。

建议细胞学分析最少用5mlBAL液，而10-20ml可提供更好的样本。分别于混合良好的初始液或首次灌洗液应用血细胞分析仪两次手工分析有核细胞计数，注意细胞随着重复洗涤逐渐消失。若出现红细胞计数逐渐增多应该记录，但无需常规计数。自动细胞计数器不能提供精确的细胞计数。应用硅化玻璃或聚丙烯材料收集灌洗液，避免巨噬细胞吸附和活化，导致它们数量被低估。有核细胞计数应该用锥虫蓝染色计数，统计有核细胞数量，成分及比例。活细胞比例超过90%才能被接受，低于80%活细胞比例为不合格。

对于细胞亚群的鉴定和计数，委员会建议行六种离心准备。虽然离心技术可能低估淋巴细胞计数，尤其对于淋巴细胞高的时候。应用Wright-Giemsa或May-Grunwald-Giemsa染色后晾干，随后盖上盖玻片。由于大量细胞不能被鉴定，Diff-Quick染色作为次选。在低倍镜（200×）视野，可以看到形态学差异，灰尘颗粒、微生物、恶性细胞簇或提示肺泡蛋白沉积症的无细胞聚集成分。在高倍镜（500×）视野下，可行有核的BAL免疫细胞分类计数，包括：巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞。要提供有统计学意义的细胞学计数样本（不超过总体样本的10%），至少要计数400个细胞。细胞评价应该随机分为两组，以减少操作和分布误差。对于细胞离心法，转速、条带区域、细胞数都会导致细胞计数的差别。细菌或其他微生物、肿瘤细胞也应记录。其他未染色的条带应该保留，以便根据临床需要进一步分析（如铁染色鉴别含铁血黄素的吞噬细胞，PAS染色鉴别肺泡蛋白沉积症，油红O用于吸引，银染色鉴别真菌等）。要精确反映远端气腔炎症模式不应包含超过5%的上皮细胞。

BAL细胞分类计数参考值尚无强力证据支持，但对于临床正常，非吸烟者，淋巴细胞≤15%，中性粒细胞≤3%，嗜酸性粒细胞≤0.5%，肥大细胞＜0.5%，巨噬细胞＞80%。正常吸烟个体BAL液淋巴细胞＞15%，中性粒细胞＞3%，嗜酸性粒细胞＞1%。健康吸烟者巨噬细胞数增加高达10倍，但淋巴细胞不增加，导致此类人群巨噬细胞≥85%，淋巴细胞比例稍下降。

3. 感染筛查

肺部感染可表现为弥漫性浸润性肺疾病，感染也可能使ILD病程复杂化。由于真菌

或分枝杆菌感染会掩盖或与不同ILD并存，有临床提示时BAL液应检查病原体。对于可能的肉芽肿性疾病如结节病，委员会建议除了BAL细胞组分分析，至少要鉴别分枝杆菌或真菌感染。如果临床有提示其他疾病，也应一并检测。

4. 流式细胞学

有时需要行T细胞计数，T淋巴细胞亚群测定或针对特定抗原的特殊细胞亚群测定。当淋巴细胞≥15%，需行CD4/CD8比例检查。当淋巴细胞比值少于15%，淋巴细胞亚群测定很难产生有价值的信息。对于已知的血液系统肿瘤，流式细胞学通过鉴定和计数肿瘤或恶性淋巴细胞可提供高灵敏度和特异度的肺部受累的证据。对于Langerhans细胞组织细胞增生症，通过免疫细胞化学染色或流式细胞学检查行免疫分型可明确诊断。虽然流式细胞学在某些方面诊断价值大，委员会不建议常规进行该项检查。

5. BAL细胞学分析报告

l 潜在疾病或吸烟对BAL的影响

吸烟会对BAL细胞成分产生深远的影响。最大的效应是在BAL中产生超过10倍的巨噬细胞。

中性粒细胞数目也增多。

l BALF细胞组分的报告

BALF的量、颜色、混浊度，有核细胞的活性比例，有核细胞总数，免疫细胞分类。应该报道纤毛柱状上皮细胞占有核细胞的比例，应该小于5%。超过5%的上皮细胞提示源于近端气道标本，不能代表肺泡腔的真实情况。报告中应包括免疫／炎症细胞分类计数，除外上皮细胞。其他形态学发现也应记录，如恶性细胞／脂蛋白小体。而且，任何特殊染色的结果都应记录。如果进行T细胞亚群分析或免疫表型分析，CD4／CD8比例和其他结果应该记录。建议间质性肺疾病专家解读报告。

l 非细胞成分的分析

BALF非细胞成分的临床意义未知，也是ERS报告讨论的主题之一。报告其中一个面是分析目前可用BAL稀释液生物标志物的局限性。回收的液体包括灌洗液和肺衬液，通过稀释指标，可以了解肺衬液所占的比例。最常用的内源性指标是尿素。外周血和肺衬液的尿素水平一致。计算外周血和回吸收BALF中的尿素浓度，可以确定稀释比例。这在很多情况下提供了很好的稀释指标。然而，在灌洗或支气管镜操作过程中，BAL中尿素浓度可能上升。增加上皮通透性的情况，如ARDS或肺炎，也会影响内源性指标的结果。

外源性指标也有局限性。亚甲蓝队一些疾病有用，但它可被气道摄取，目前所有的外源性指标都会被肺泡巨噬细胞不同程度摄取。由于各种方法都存在误差，委员会建议报告每毫升肺泡灌洗液所含有核细胞数。ERS建议灌洗200-240ml量，以便检测BAL非细胞成分。

委员会未发现临床常规行BAL非细胞成分分析对于ILD诊断的价值。

译自Meyer KC, Raghu G, Baughman RP, Brown KK, Costabel U, du Bois RM, Drent M, Haslam PL, Kim DS, Nagai S, Rottoli P, Saltini C, Selman M, Strange C, Wood B; American Thoracic Society Committee on BAL in Interstitial Lung Disease. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 2012 May 1;185(9):1004-14. doi: 10.1164/rccm.201202-0320ST. PMID: 22550210.）